腫瘍の誘導および診断<em>ショウジョウバエ</em> Imaginal Disc Epithelia
Summary
ショウジョウバエの上椎間板上皮におけるモザイククローン解析は、腫瘍形成の遺伝的メカニズムおよび細胞メカニズムを研究するための強力なモデルシステムです。ここでは、GAL4-UASシステムを用いて、 ショウジョウバエの翅の椎間板に腫瘍を誘導するプロトコールについて説明し、腫瘍の表現型を分類するための診断法を紹介する。
Abstract
癌の初期段階では、形質転換された突然変異細胞は細胞学的異常を示し、制御されない過増殖を開始し、組織組織化を漸進的に破壊する。 Drosophila melanogasterは、腫瘍発生の遺伝的メカニズムおよび細胞メカニズムを研究するために、癌生物学における一般的な実験モデルシステムとして登場しました。特に、 ショウジョウバエ （ Drosophila） imaginal disc（幼生の上皮発生）のための遺伝的ツールは、正常な上皮組織内で形質転換された前腫瘍細胞の生成を可能にする。これはヒト癌の初期段階と同様の状況である。しかし、 ショウジョウバエの翅の椎間板の腫瘍形成に関する最近の研究では、腫瘍の開始は組織固有の細胞構造および局所微小環境に依存することが示され、imaginalの腫瘍表現型を評価する際の腫瘍原性刺激に対する領域特異的感受性を考慮することが重要であるディスク。腫瘍進行の表現型分析を容易にするためにGAL4-UASシステムを用いた遺伝子実験のプロトコールについて説明します。この実験では、翅の椎間板に腫瘍性腫瘍を誘導します。以前には報告されていなかった腫瘍の進行の様々な段階（肥厚、形成異常または腫瘍形成）を識別するための明確な分類方法として、想像上皮に誘発されたクローン病変の表現型を分類するための診断方法をさらに紹介する。これらの方法は、 ショウジョウバエの種々の臓器における腫瘍表現型のクローン分析に広く適用可能であろう。
Introduction
上皮組織は、発達および細胞代謝回転を通じて組織を維持する顕著なホメオスタシス能力を有する高度に組織化されたシステムである。しかしながら、この堅牢な自己組織化システムは、腫瘍発生の間に次第に破壊される。腫瘍発生の開始時に、腫瘍遺伝子活性化または腫瘍抑制遺伝子不活性化から生じる個々の変異細胞が上皮層内に出現する。この形質転換された「プロ腫瘍細胞」が抑制的環境を回避し、上皮組織を破壊し、制御されない増殖を開始すると、腫瘍形成が起こる1 。過去数十年の間に、遺伝学および分子生物学における優れた技術的進歩は、がん研究において顕著な進歩を遂げました。特に、FLP-FRT（フリッパーゼリコンビナーゼ/フリッパーゼリコンビナーゼ標的）有糸分裂組換え体のようなショウジョウバエメラノガスターにおける遺伝的モザイク分析ツールを用いた最近の研究エーション2とフリップアウト-GAL4-UAS（上流活性化配列）システム3、大幅に良好腫瘍4、5、6の形成および転移に関与する遺伝的メカニズムを理解することに貢献しています。
保存されたショウジョウバエ腫瘍サプレッサー遺伝子、 致死性の巨大幼虫 （ lgl ）、 大型ディスク （ dlg ）、 落書き （ scrib ）の研究は、これらの遺伝子が重要な役割を果たすため、上皮組織の消失と腫瘍発生の重要な関係を明らかにした上皮組織7で、頂端-基底細胞極性および細胞増殖の調節インチショウジョウバエの原始椎間板は通常単層上皮であるが、これらの3つの遺伝子のいずれかのホモ接合突然変異は、細胞が構造および極性を失い、過剰増殖し、最終的に隣接する組織と融合する多層アモルファス塊を形成する7 。同様に、哺乳動物におけるこれらの遺伝子の破壊は、悪性腫瘍8,9の開発に関与しています。変異体組織によって示される腫瘍性表現型は、保存、新生物、腫瘍抑制遺伝子（nTSGs）として、これら三つの遺伝子の分類7,8につながっています。ホモ接合nTSG変異細胞は散発的にFLP-FRT媒介有糸分裂組換えを使用して、野生型の成虫を開発する際に生成される場合しかし、変異細胞はc-Jun N末端キナーゼ（JNK）依存性アポトーシス10、11を介して組織から除去されます、12、13、14、15、押出し</sup> 、 16 、または隣人による貪食および食作用17 。この遺伝的にモザイク上皮では、アポトーシスは主に隣接する正常細胞はnTSG変異細胞10、11、12、18のアポトーシスを引き起こすことを示唆し、クローンの境界に位置nTSG変異体細胞において検出されます。哺乳動物細胞における最近の研究では、プロの腫瘍細胞のこの細胞競争依存除去は癌19、20、21、22、23に対する進化的に保存された上皮の自己防御機構であることを確認しました。
しかし、最近のショウジョウバエの成虫の研究では、モザイクのnTSGノックダウンクローンが腫瘍性腫瘍を特異的に誘導することが示されています翼の想像上のディスクのIC領域16 。初期の腫瘍形成は末梢「ヒンジ」領域に常に見られ、ウイングディスク上皮の中央「ポーチ」領域では決して観察されず、nTSGノックダウン細胞の腫瘍形成能は局所環境に依存することが示唆された。中央ポーチ領域は、プロ腫瘍細胞が形成異常増殖を示さない一方で、周辺ヒンジ領域が「腫瘍ホットスポット」として振る舞う「腫瘍コールドスポット」として機能する16 。 「コールドスポット（cold spot）」ポーチ領域では、nTSG-ノックダウン細胞は基底面から剥離し、アポトーシスを起こす。対照的に、「ホットスポット」ヒンジ細胞は基底面に頑強な細胞骨格構造のネットワークを持っているため、nTSGノックダウン細胞は上皮の頂端側から剥離し、腫瘍原性の過増殖を開始する16 。したがって、原始椎間板における腫瘍表現型の解析には、注意深い検討が必要である腫瘍形成刺激に対する領域特異的感受性の低下。
ここでは、正常なウイングディスク上皮においてnTSGノックダウン細胞が生成されるGAL4-UAS- RNAiシステムを利用して、 ショウジョウバエのウイングのヘルニア椎間板に腫瘍性腫瘍形成を誘導するためのプロトコールについて説明する。これらの実験系は癌の初期段階を研究するのに有用であるが、椎間板上皮における腫瘍進行の段階を評価するための明確な分類方法はこれまで明らかにされていない。したがって、我々はまた、ウイングディスク上皮に誘導された前腫瘍クローン表現型を3つのカテゴリーに分類する診断法を提案する：過形成（増殖が増加した正常数の細胞の過剰な蓄積）、異形成（異常に出現する前悪性組織細胞）、および新生物（異常な外観および異常な増殖パターンを有する細胞からなる良性または悪性の腫瘍）。
Protocol
Representative Results
Discussion
GAL4-UASシステムは、 ショウジョウバエ 26の標的遺伝子発現のための最も強力な遺伝子ツールの1つであり、in vivoで腫瘍細胞の誘導と解析を大いに容易にします4 。このシステムは、野生型上皮組織内の腫瘍抑制遺伝子のノックダウンまたは癌遺伝子の過剰発現を有するクローンの生成を可能にする。これは、形質転換された前腫瘍細胞が正常?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、原稿の批判的読解に対するJ.ヴォーゲンに感謝します。この研究は、日本学術振興会グラント番号26891025,15H01500およびYTへの武田科学財団研究助成金
Materials
| Reagents | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) | Wako | 162-19321 | |
| TritonX-100 | Wako | 168-11805 | |
| Formaldehyde | Wako | 064-00406 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| normal goat serum | Sigma | G6767 | |
| mounting medium, Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| mouse-anti-Dlg 4F3 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 anti-discs large, RRID:AB_528203 | dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3A6B4, RRID:AB_579780 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3B8D12, RRID:AB_579781 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 5H7B11, RRID:AB_579779 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-atubulin | Developmental Studies Hybridoma Bank | AA4.3, RRID:AB_579793 | dilute in PBTG, 1:100 |
| Alexa Fluor 546 Phalloidin | Molecular probes | A22283 | dilute in PBS, 1:40 |
| goat anti-mouse IgG antibody, Alexa Fluor 546 | Molecular probes | A11030 | dilute in PBTG, 1:400 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly strains | |||
| sd-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | #8609 | recombined with UAS-EGFP |
| upd-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | #26796 | recombined with UAS-EGFP |
| UAS-lgl-RNAi | Vienna Drosophila RNAi center | #51247 | |
| UAS-scrib-RNAi | Vienna Drosophila RNAi center | #105412 | |
| UAS-RasV12 | Bloomington Drosophila Stock Center | #64196 | |
| UAS-Yki3SA | Bloomington Drosophila Stock Center | #28817 | |
| hsFLP | Bloomington Drosophila Stock Center | #6 | |
| Act>CD2>GAL4 (flip-out GAL4) | Bloomington Drosophila Stock Center | #4780 | recombined with UAS-EGFP |
| UAS-EGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | #5428 | X chromosome |
| UAS-EGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | #6658 | third chromosome |
| UAS-Dicer2 | Bloomington Drosophila Stock Center | #24650 | second chromosome |
| UAS-Dicer2 | Bloomington Drosophila Stock Center | #24651 | third chromosome |
| vkg-GFP | Morin et al. 2001 | GFP protein trap |
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