Indução e diagnóstico de tumores em<em> Drosophila</em> Epitelio do disco imaginal
Summary
A análise do clone de mosaico no epitélio do disco imaginal de Drosophila é um sistema modelo poderoso para estudar os mecanismos genéticos e celulares da tumorigênese. Aqui descrevemos um protocolo para induzir tumores em discos imaginários da asa de Drosophila usando o sistema GAL4-UAS e introduzir um método de diagnóstico para classificar os fenótipos do tumor.
Abstract
Nos estágios iniciais do câncer, as células mutantes transformadas apresentam anormalidades citológicas, começam o excesso de crescimento descontrolado e interromperam progressivamente a organização do tecido. Drosophila melanogaster emergiu como um sistema modelo experimental popular em biologia do câncer para estudar os mecanismos genéticos e celulares da tumorigênese. Em particular, as ferramentas genéticas para discos imagólicos de Drosophila (desenvolvimento de epitélios em larvas) possibilitam a criação de células pro-tumorais transformadas dentro de um tecido epitelial normal, uma situação semelhante às etapas iniciais do câncer humano. Um estudo recente da tumorigênese em discos imaginários da asa de Drosophila , no entanto, mostrou que a iniciação do tumor depende da citoarquitetura do tecido intrínseco e do microambiente local, sugerindo que é importante considerar a susceptibilidade específica da região aos estímulos tumorigênicos na avaliação de fenótipos tumorais em imaginações Discos. Para facilitar a análise fenotípica do tumor progressiEm discos imaginais, aqui descrevemos um protocolo para experiências genéticas usando o sistema GAL4-UAS para induzir tumores neoplásicos em discos imaginais de asa. Além disso, introduzimos um método de diagnóstico para classificar os fenótipos das lesões clonais induzidas em epitélios imaginais, pois um método de classificação claro para discriminar vários estágios de progressão tumoral (como hiperplasia, displasia ou neoplasia) não havia sido descrito anteriormente. Esses métodos podem ser amplamente aplicáveis à análise clonal de fenótipos tumorais em vários órgãos em Drosophila .
Introduction
Os tecidos epiteliais são sistemas altamente organizados que possuem a habilidade homeostática notável para manter sua organização através do desenvolvimento e do turnover celular. Este robusto sistema de auto-organização, no entanto, é progressivamente interrompido durante o desenvolvimento do tumor. No início do desenvolvimento do tumor, as células mutantes individuais decorrentes da ativação do oncogene ou da inativação do gene supressor de tumor emergem dentro de uma camada epitelial. Quando esta "célula pro-tumoral" transformada evade um ambiente supressivo, interrompe a organização epitelial e começa a proliferação descontrolada, a tumorigênese ocorre 1 . Durante as últimas décadas, os avanços tecnológicos notáveis em genética e biologia molecular fizeram progressos notáveis na pesquisa do câncer. Em particular, estudos recentes utilizando ferramentas de análise de mosaico genetico em Drosophila melanogaster , como o recombinante mitótico recombinante FLP-FRT (flipase recombinase / flippase recombinase)Os sistemas 2 e flip-out-GAL4-UAS (seqüência de ativação upstream) 3 contribuíram grandemente para uma melhor compreensão dos mecanismos genéticos envolvidos na formação e metástase dos tumores 4 , 5 , 6 .
Estudos de um grupo de genes de supressores de tumores Drosophila conservados, larvas gigantes letais ( lgl ), discos grandes ( dlg ) e rabiscos ( scrib ), evidenciaram a relação crítica entre perda de organização epitelial e desenvolvimento tumoral, pois esses genes desempenham papéis fundamentais Na regulação da polaridade das células basais apical e da proliferação celular nos tecidos epiteliais 7 . Enquanto os discos imaginários de Drosophila são normalmente epitélios monocamadas, mutações homozigóticas em qualquer um desses três genes fazem com que as células perdam estrutura e polaridade, não conseguem diferenciarRentiate, overproliferate e, finalmente, formam massas amorfas multicamadas que se fundem com tecidos adjacentes 7 . Da mesma forma, a interrupção desses genes em mamíferos está envolvida no desenvolvimento de tumores malignos 8 , 9 . Os fenótipos neoplásicos exibidos pelos tecidos mutantes levaram à classificação desses três genes como genes supressores tumorais neoplásicos (nTSGs) 7 , 8 preservados. No entanto, quando as células mutantes nTSG homozigóticas são geradas esporadicamente no desenvolvimento de discos imaginais de tipo selvagem usando a recombinação mitótica mediada por FLP-FRT, as células mutantes são eliminadas do tecido através da apoptose dependente da quinase N-terminal N-terminal (JNK) 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , extrusão 15 </suP> , 16 , ou engulfment e fagocitose por vizinhos 17 . Neste epitelio de mosaico genetico, a apoptose é principalmente detectada em células mutantes nTSG localizadas no limite do clone, sugerindo que as células normais adjacentes desencadeiam a apoptose de células mutantes nTSG 10 , 11 , 12 , 18 . Estudos recentes em células de mamíferos confirmaram que esta eliminação dependente da competição celular das células pro-tumorais é um mecanismo de autodefesa epitelial conservado evolutivamente contra o câncer 19 , 20 , 21 , 22 , 23 .
Um estudo recente em discos imagólicos de Drosophila , no entanto, mostrou que os clones de nTSG-knockdown em mosaico induzem tumores neoplásicos em especificaçõesRegiões ic de discos ideais de asa 16 . A formação inicial do tumor sempre foi encontrada na região periférica da "dobradiça" e nunca observada na região central da "bolsa" do epitélio do disco de asa, sugerindo que o potencial tumorigênico das células nTSG-knockdown depende do ambiente local. A região da bolsa central funciona como uma "mancha fria do tumor" onde as células pró-tumorais não apresentam crescimento excessivo displásico, enquanto que a região da dobradiça periférica se comporta como um "ponto crítico do tumor" 16 . Nas regiões da bolsa "coldspot", as células nTSG-knockdown se delaminam do lado basal e sofrem apoptose. Em contraste, as células de dobradiça "hotspot" possuem uma rede de estruturas citoesqueléticas robustas em seus lados basais, as células de nTSG-knockdown se delaminam do lado apical do epitélio e iniciam o crescimento excessivo tumorigênico 16 . Portanto, a análise de fenótipos tumorais em discos imaginários exige consi cuidadoDerrame da susceptibilidade específica da região aos estímulos tumorigênicos.
Aqui, descrevemos um protocolo para induzir a formação de tumor neoplásico nos discos imaginários da asa Drosophila utilizando o sistema GAL4-UAS- RNAi pelo qual as células nTSG-knockdown são geradas em epitélio de disco de asa normal. Embora esses sistemas experimentais sejam úteis para estudar os estágios iniciais do câncer, um método de classificação claro para avaliar os estágios da progressão tumoral no epitélio de disco imaginal não foi claramente descrito anteriormente. Portanto, também propomos um método de diagnóstico para classificar os fenótipos clonais pro-tumorais induzidos no epitélio do disco de asa em três categorias: hiperplasia (acumulação de um número excessivo de células que aparecem normalmente com aumento da proliferação), displasia (tecido pré-maligno composto de aparência anormal Células) e neoplasia (tumor benigno ou maligno composto de células com aparência anormal e padrão de proliferação anormal).
Protocol
Representative Results
Discussion
O sistema GAL4-UAS é uma das ferramentas genéticas mais poderosas para a expressão de genes direcionados em Drosophila 26 e facilita grandemente a indução e análise de células tumorais in vivo 4 . Este sistema permite a geração de clones que suportam os genes supressores de tumores ou a superexpressão de oncogenes no tecido epitelial de tipo selvagem, uma situação altamente semelhante aos estágios iniciais do câncer humano onde as células p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a J. Vaughen pela leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi apoiado por bolsas da JSPS KAKENHI Grant Numbers 26891025, 15H01500 e The Takeda Science Foundation Research Grant to YT
Materials
| Reagents | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) | Wako | 162-19321 | |
| TritonX-100 | Wako | 168-11805 | |
| Formaldehyde | Wako | 064-00406 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| normal goat serum | Sigma | G6767 | |
| mounting medium, Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| mouse-anti-Dlg 4F3 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 anti-discs large, RRID:AB_528203 | dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3A6B4, RRID:AB_579780 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3B8D12, RRID:AB_579781 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 5H7B11, RRID:AB_579779 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-atubulin | Developmental Studies Hybridoma Bank | AA4.3, RRID:AB_579793 | dilute in PBTG, 1:100 |
| Alexa Fluor 546 Phalloidin | Molecular probes | A22283 | dilute in PBS, 1:40 |
| goat anti-mouse IgG antibody, Alexa Fluor 546 | Molecular probes | A11030 | dilute in PBTG, 1:400 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly strains | |||
| sd-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | #8609 | recombined with UAS-EGFP |
| upd-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | #26796 | recombined with UAS-EGFP |
| UAS-lgl-RNAi | Vienna Drosophila RNAi center | #51247 | |
| UAS-scrib-RNAi | Vienna Drosophila RNAi center | #105412 | |
| UAS-RasV12 | Bloomington Drosophila Stock Center | #64196 | |
| UAS-Yki3SA | Bloomington Drosophila Stock Center | #28817 | |
| hsFLP | Bloomington Drosophila Stock Center | #6 | |
| Act>CD2>GAL4 (flip-out GAL4) | Bloomington Drosophila Stock Center | #4780 | recombined with UAS-EGFP |
| UAS-EGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | #5428 | X chromosome |
| UAS-EGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | #6658 | third chromosome |
| UAS-Dicer2 | Bloomington Drosophila Stock Center | #24650 | second chromosome |
| UAS-Dicer2 | Bloomington Drosophila Stock Center | #24651 | third chromosome |
| vkg-GFP | Morin et al. 2001 | GFP protein trap |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
- Struhl, G., Basler, K. Organizing activity of wingless protein in Drosophila. Cell. 72 (4), 527-540 (1993).
- Potter, C. J., Turenchalk, G. S., Xu, T. Drosophila in cancer research. An expanding role. Trends Genet. 16 (1), 33-39 (2000).
- Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila. Dis Model Mech. 4 (6), 753-761 (2011).
- Tipping, M., Perrimon, N. Drosophila as a model for context-dependent tumorigenesis. J Cell Physiol. 229 (1), 27-33 (2013).
- Bilder, D. Epithelial polarity and proliferation control: links from the Drosophila neoplastic tumor suppressors. Genes Dev. 18 (16), 1909-1925 (2004).
- Humbert, P. O., et al. Control of tumourigenesis by the Scribble/Dlg/Lgl polarity module. Oncogene. 27 (55), 6888-6907 (2008).
- Huang, L., Muthuswamy, S. K. Polarity protein alterations in carcinoma: a focus on emerging roles for polarity regulators. Curr Opin Genet Dev. 20 (1), 41-50 (2010).
- Brumby, A. M., Richardson, H. E. scribble mutants cooperate with oncogenic Ras or Notch to cause neoplastic overgrowth in Drosophila. EMBO J. 22 (21), 5769-5779 (2003).
- Igaki, T., Pastor-Pareja, J. C., Aonuma, H., Miura, M., Xu, T. Intrinsic tumor suppression and epithelial maintenance by endocytic activation of Eiger/TNF signaling in Drosophila. Dev Cell. 16 (3), 458-465 (2009).
- Tamori, Y., et al. Involvement of Lgl and Mahjong/VprBP in cell competition. PLoS Biol. 8 (7), e1000422 (2010).
- Cordero, J. B., et al. Oncogenic Ras diverts a host TNF tumor suppressor activity into tumor promoter. Dev Cell. 18 (6), 999-1011 (2010).
- Yamamoto, M., Ohsawa, S., Kunimasa, K., Igaki, T. The ligand Sas and its receptor PTP10D drive tumour-suppressive cell competition. Nature. 542 (7640), 246-250 (2017).
- Vaughen, J., Igaki, T. Slit-Robo Repulsive Signaling Extrudes Tumorigenic Cells from Epithelia. Dev Cell. 39 (6), 683-695 (2016).
- Tamori, Y., Suzuki, E., Deng, W. -. M. Epithelial Tumors Originate in Tumor Hotspots, a Tissue-Intrinsic Microenvironment. PLoS Biol. 14 (9), e1002537 (2016).
- Ohsawa, S., et al. Elimination of oncogenic neighbors by JNK-mediated engulfment in Drosophila. Dev Cell. 20 (3), 315-328 (2011).
- Menéndez, J., Pérez-Garijo, A., Calleja, M., Morata, G. A tumor-suppressing mechanism in Drosophila involving cell competition and the Hippo pathway. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14651-14656 (2010).
- Hogan, C., et al. Characterization of the interface between normal and transformed epithelial cells. Nat Cell Biol. 11 (4), 460-467 (2009).
- Kajita, M., et al. Interaction with surrounding normal epithelial cells influences signalling pathways and behaviour of Src-transformed cells. J Cell Sci. 123 (Pt 2), 171-180 (2010).
- Norman, M., et al. Loss of Scribble causes cell competition in mammalian cells. J Cell Sci. 125 (1), 59-66 (2012).
- Wagstaff, L., et al. Mechanical cell competition kills cells via induction of lethal p53 levels. Nat Commun. 7, 1-14 (2016).
- Kajita, M., Fujita, Y. EDAC: Epithelial defence against cancer-cell competition between normal and transformed epithelial cells in mammals. J Biochem. 158 (1), 15-23 (2015).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Jory, A., et al. A survey of 6,300 genomic fragments for cis-regulatory activity in the imaginal discs of Drosophila melanogaster. Cell Rep. 2 (4), 1014-1024 (2012).
- McGuire, S. E., Le, P. T., Osborn, A. J., Matsumoto, K., Davis, R. L. Spatiotemporal rescue of memory dysfunction in Drosophila. Science. 302 (5651), 1765-1768 (2003).
- Rodrigues, A. B., et al. Activated STAT regulates growth and induces competitive interactions independently of Myc, Yorkie, Wingless and ribosome biogenesis. Development. 139 (21), 4051-4061 (2012).
- Khan, S. J., et al. Epithelial neoplasia in Drosophila entails switch to primitive cell states. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (24), E2163-E2172 (2013).
- Pagliarini, R. A., Xu, T. A genetic screen in Drosophila for metastatic behavior. Science. 302 (5648), 1227-1231 (2003).
- Gonzalez, C. Drosophila melanogaster: a model and a tool to investigate malignancy and identify new therapeutics. Nat Rev Cancer. 13 (3), 172-183 (2013).
- Patel, P. H., Edgar, B. A. Tissue design: how Drosophila tumors remodel their neighborhood. Semin Cell Dev Biol. 28, 86-95 (2014).
- Nakajima, Y. -. I., Meyer, E. J., Kroesen, A., McKinney, S. A., Gibson, M. C. Epithelial junctions maintain tissue architecture by directing planar spindle orientation. Nature. 500 (7462), 359-362 (2013).
- Colombani, J., Andersen, D. S., Léopold, P. Secreted peptide Dilp8 coordinates Drosophila tissue growth with developmental timing. Science. 336 (6081), 582-585 (2012).
- Garelli, A., Gontijo, A. M., Miguela, V., Caparros, E., Dominguez, M. Imaginal discs secrete insulin-like peptide 8 to mediate plasticity of growth and maturation. Science. 336 (6081), 579-582 (2012).
