JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

سيميوتوماتيد طولية المستندة إلى التصوير المقطعي ميكروكومبوتيد التحليل الكمي لهيكلية نموذج كسر العمود الفقري المتصلة بمرض هشاشة العظام في الفئران عارية

Published: September 28, 2017
doi:
10.3791/55928
, , , , ,
1Skeletal Biotech Laboratory,Hebrew University-Hadassah Faculty of Dental Medicine, 2Department of Surgery,Cedars-Sinai Medical Center, 3Board of Governors Regenerative Medicine Institute,Cedars-Sinai Medical Center, 4Biomedical Imaging Research Institute,Cedars-Sinai Medical Center, 5Department of Orthopedics,Cedars-Sinai Medical Center

Summary

والهدف من هذا البروتوكول هو إنشاء نموذج كسر ضغط الفقرات المتعلقة بهشاشة العظام التي يمكن تقييمها طوليا في فيفو استخدام ميكروكومبوتيد سيميوتوماتيد على أساس التصوير المقطعي كمي هيكلية تحليل الفئران عارية.

Abstract

الكسور المتعلقة بهشاشة العظام ضغط العمود الفقري (أوفكفس) حاجة لم تلب سريرياً والمشتركة مع زيادة انتشار كسن سكان العالم. نماذج حيوانية أوفكف ضرورية لتطوير استراتيجيات هندسة الأنسجة متعدية الإكلينيكية. على الرغم من وجود عدد من نماذج حاليا، يصف هذا البروتوكول أسلوب أمثل لحمل عدة عيوب العمود الفقري استنساخه بدرجة عالية في الفئران عارية واحدة. ميكروكومبوتيد سيمياوتوماتيد طولية رواية التصوير المقطعي (µCT)-كما هو مفصل استناداً إلى التحليل الهيكلي الكمية من عيوب العمود الفقري. باختصار، تم تصويرها الفئران في نقاط متعددة وقت بعد العملية. المسح يوم 1 توجيه إلى موضع قياسية، ومعرف وحدة تخزين قياسية للفائدة. وسجلت µCT اللاحقة بالأشعة لكل الفئران تلقائياً للمسح يوم 1 حيث كان ثم تحليل نفس الحجم من الاهتمام تقييم لتكوين العظام الجديدة. هذا النهج متعدد الاستخدامات يمكن تكييفها مع مجموعة متنوعة من نماذج أخرى حيث يمكن أن تستفيد التحليل القائم على التصوير الطولي من محاذاة سيميوتوماتيد 3D دقيقة. أخذت معا، يصف هذا البروتوكول نظام سهولة قابلة للقياس الكمي واستنساخه بسهولة لأبحاث هشاشة العظام والعظام. البروتوكول المقترح يأخذ 4 أشهر للحث على هشاشة العظام في الفئران ovariectomized عارية وبين 2.7 و 4 ح لتوليد والصورة، وتحليل عيوب العمود الفقري اثنين، تبعاً لحجم الأنسجة والمعدات.

Introduction

أكثر من 200 مليون شخص في العالم يعانون من مرض هشاشة العظام1. المرضية الكامنة وراء الانخفاض في كثافة المعادن في العظام (BMD)، وزيادة المصغرة غيرت العظام وهشاشة العظام، ونتيجة لذلك، الخطر النسبي للكسر2. ترقق العظام من ذلك انتشارا ومضرة بالصحة أن منظمة الصحة العالمية قد عرف أنه أحد الشواغل رئيسية لصحة العامة. وعلاوة على ذلك، كما سكان العالم المتوقع أن العمر، ترقق العظام يتوقع أن تصبح أكثر شيوعاً.

كسور في العظام هشاشة ضغط العمود الفقري هي كسور هشاشة الأكثر شيوعاً، ﺑ أكثر من 000 750 سنوياً في الولايات المتحدة. أنها ترتبط باعتلال كبير وقدر حسب معدل وفيات أعلى تسع مرات3. حاليا في التجارب السريرية، وعثر على التدخلات الجراحية المتاحة، مثل فيرتيبروبلاستي وكيفوبلاستي، أن يكون لا أكثر فعالية من شام معاملة4،5، تاركة فقط إدارة الألم المتاحة لهؤلاء المرضى. حيث أن العلاجات أوفكف الحالية محدودة، من الضروري استحداث نموذج لحيوانات التي يمكن إجراء نسخ متماثل اضطراب6،،من78. ويمكن تسهيل هذه النماذج الحيوانية التحقيق في أساليب العلاج الحالية وتطوير علاجات جديدة سوف تترجم إلى الممارسة السريرية. تم التي يسببها ترقق العظام والمستدام في الحيوانات النموذجية من خلال إدارة نظام غذائي منخفض الكالسيوم (LCD) بالاقتران مع أوفاريكتومي1،،من910،11، 12 , 13 , 14 , 15-كذلك نموذج فقدان العظام المرتبطة أوفكفس، أنشئ عيوب العمود الفقري العظام في الفئران الأشخاص العظام هشاشة 16،17،،من1819، 20،،من2122،،من2324. في هذا العمل، يقدم نموذجا عيب العمود الفقري للفئران المناعة مع هشاشة العظام على غرار. يمكن استخدام هذا النموذج الجديد لتقييم يستند إلى الخلية العلاجات المتعلقة بالخلايا الجذعية المشتقة من مختلف المصادر والأنواع للإصلاح الكسور الصعبة، مثل أوفكفس.

تصوير العظام جزء حاسم من تقييم الكسور وأمراض العظام. تم وضع أساليب التصوير المتقدم للتقييم الدقيق للتغيرات الهيكلية العظام و استراتيجيات التجديد25. فيما بينها، برز تصوير µCT كطريقة غير الغازية، وسهلة الاستخدام، وغير مكلفة توفر صور ثلاثية الأبعاد عالية الدقة. تصوير µCT مزايا عديدة على طرائق أخرى في تقييم مرضى هشاشة العظام، كما أنها توفر 3D عالية الدقة العظام المصغرة26 ثم يمكن تحليلها كمياً. هذا الأخير يمكن ثم استخدامها لمقارنة الآثار العلاجية من العلاجات المقترحة. وفي الواقع، في فيفو التصوير µCT معيار الذهب للتجديد عيب العمود الفقري رصد1،،من1627. ومع ذلك، استخدمت بعض المنشورات28،،29،30،31 أدوات التسجيل الآلي للتقليل من المستخدم-تبعية، والتحيز الاستيفاء، وخطأ الدقة من µCT التحليل القائم على التصوير. في الآونة الأخيرة، كنا الأول من استخدم إجراء تسجيل لتحسين تحليل التجدد العظام في العظام موحدة باطلة، كما هو موضح في هذا البروتوكول32 .

يمكن استخدامها لدراسة أثر العلاجات خلية رواية عن أوفكفس الطريقة الموضحة هنا، دون عوائق من المضيف تي خلية الردود التي قد ترفض الخلايا إكسينوجينيك أو متمكنة. هي التي يسببها ترقق العظام في الفئران الصغار عن طريق أوفاريكتومي (أف) و 4 أشهر من شاشات الكريستال السائل. يسمح سن مبكرة من الفئران أوفكس، جنبا إلى جنب مع شاشات الكريستال السائل، تمكننا من الوصول إلى كتلة عظم ذروة منخفض، محاكاة ترقق العظام بعد سن إلياس التي تؤدي إلى فقدان العظام لا رجعة فيه. وهذا يمكن تفسيره جزئيا بحقيقة أنه خلال شاشات الكريستال السائل، وفي حوالي 3 أشهر من العمر، الانتقال الفئران من العظم والنمذجة لإعادة عرض المرحلة في الفقرات القطنية33، مما يزيد من احتمالات الاحتفاظ هشاشة العظام على الوقت. استخدام الحيوانات الشباب يجعل هذا النموذج أكثر فعالة من حيث التكلفة، كما أنها أقل تكلفة. على الرغم من ذلك، فإنه محدود بطبيعته لا تستأثر بالتغيرات البيولوجية في الحيوان الشيخوخة.

Protocol

أجريت جميع التجارب على الحيوانات تحت بروتوكول أقرته “رعاية الحيوان المؤسسية” واستخدام اللجنة (إياكوك) من مركز سيدرز-سيناء الطبي (البروتوكول رقم 3609). تدار التخدير لجميع الإجراءات الجراحية والتصوير. تم إيواء جميع الحيوانات وفقا للبروتوكولات المعتمدة في إياكوك- ملاحظة: التصم…

Representative Results

باستخدام هذا البروتوكول، واحد صورة والتحديد الكمي لتجديد n = 8 عيوب العمود الفقري العظام هشاشة على غرار عبر نقاط زمنية مختلفة. المباراة التشريحية التي حصل عليها إجراءات التسجيل يسمح بتحليل أصوات العراق نفسه عند كل من النقاط الزمنية. يؤدي هذا إلى تحليل هيستومورفوميتريك 3D ?…

Discussion

ترقق العظام هو السبب الأكثر شيوعاً لكسور العمود الفقري ضغط نتيجة زيادة العبء على العمود الفقري وتؤدي إلى انهيار الجسم الفقري. ومع ذلك، من المستحيل عمليا لتوليد ضرر في القوارض التي يتطابق أصلي من انهيار العمود الفقري مماثلة. بدلاً من ذلك، إنشاء الباحثين فراغاً أسطواني في مركز الهيئة العمو…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وأيد البحث على منحة من معهد كاليفورنيا للتجدد الطب (سيرم) (TR2-01780).

Materials

Isoflurane MWI Animal Health, Pasadena, CA 501017
BetadineSolution MWI Animal Health, Pasadena, CA 4677
Chlorhexidine Gluconate2%scrub MWI Animal Health, Pasadena, CA 510083
Isopropyl Alcohol 70%-quart MWI Animal Health, Pasadena, CA 501044
Carprofen MWI Animal Health, Pasadena, CA 26357
Buprenorphine0.3mg/mL MWI Animal Health, Pasadena, CA 56163
Ovariectomized Athymic nude rats Harlan Laboratories, Indianapolis, IN Hsd:RH-Foxn1 rnu
Low calcium food Newco Distributors, Inc., CA 1814948 (5AV8 AIN-93M w/low calcium)
Phosphate Buffered Saline Life Technologies Corporation 14190250
Dermabond J AND J ETHICON DHVM12
Anesthesia machine Patterson Scientific TEC 3EX
Slide Top Induction Chambers Patterson Scientific 78917833
ProStation Heated Workstation Patterson Scientific 78914731
Surgical drape HALYARD HEALTH INC 89101
Magnetic fixator retraction system Fine Science Tools, Inc., CA 18200-50
Dissecting Scissors, 10cm, Curved, SS World Precision Instruments, FL 14394
Iris Scissors, 11.5cm, 45°Angle, Serrated, Sharp/Sharp World Precision Instruments, FL 503225
Forceps, no. 5 World Precision Instruments, FL 555048FT
Micro Mosquito Hemostatic Forceps World Precision Instruments, FL 503360
Sterile cotton gauze Medtronic, MINNEAPOLIS, MN 9024
Absorption Spears – Mounted/Sterile Fine Science Tools, CA 18105-01
Syringe, 1 ml TERUMO TERUMO MED SS-01T
Needle, 25gauge BD MED SYS INJECTION SYS 305127
Laminar flow hood Baker SterilGARD e3-Class II Type A2 Biosafety Cabinet
Thermal Cautery Unit World Precision Instruments, FL 501292
Micro-Drill OmniDrill115/230V World Precision Instruments, FL 503598
Trephines for Micro Drill, 2mm diameter Fine Science Tools, CA 18004-20
3-0 Vicryl undyed 27” SH taper J AND J ETHICON 1663G
4-0 Ethilon black 18” PC3 conventional cutting J AND J ETHICON 1954G
Conebeam in vivo microCT (vivaCT 40) Scanco Medical vivaCT 40
SCANCO Medical microCT systems software suite Scanco Medical vivaCT 40
Analyze software Biomedical Imaging, Mayo Clinic, Rochester, MN Analyze 12 Image analysis software
Veterenery eye ointment
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, M. L., Massie, J., Perry, A., Garfin, S. R., Kim, C. W. A rat osteoporotic spine model for the evaluation of bioresorbable bone cements. Spine J. 7 (4), 466-474 (2007).
  2. . Consensus development conference: prophylaxis and treatment of osteoporosis. Am J Med. 90 (1), 107-110 (1991).
  3. Center, J. R., Nguyen, T. V., Schneider, D., Sambrook, P. N., Eisman, J. A. Mortality after all major types of osteoporotic fracture in men and women: an observational study. Lancet. 353 (9156), 878-882 (1999).
  4. Buchbinder, R., et al. A randomized trial of vertebroplasty for painful osteoporotic vertebral fractures. N Engl J Med. 361 (6), 557-568 (2009).
  5. Kallmes, D. F., et al. A randomized trial of vertebroplasty for osteoporotic spinal fractures. N Engl J Med. 361 (6), 569-579 (2009).
  6. Kado, D. M., et al. Vertebral fractures and mortality in older women: a prospective study. Study of Osteoporotic Fractures Research Group. Arch Intern Med. 159 (11), 1215-1220 (1999).
  7. Silverman, S. L. The clinical consequences of vertebral compression fracture. Bone. 13, S27-S31 (1992).
  8. Ross, P. D. Clinical consequences of vertebral fractures. Am J Med. 103 (2A), 30S-43S (1997).
  9. Saito, T., Kin, Y., Koshino, T. Osteogenic response of hydroxyapatite cement implanted into the femur of rats with experimentally induced osteoporosis. Biomaterials. 23 (13), 2711-2716 (2002).
  10. Koshihara, M., Masuyama, R., Uehara, M., Suzuki, K. Effect of dietary calcium: Phosphorus ratio on bone mineralization and intestinal calcium absorption in ovariectomized rats. Biofactors. 22 (1-4), 39-42 (2004).
  11. Martin-Monge, E., et al. Validation of an osteoporotic animal model for dental implant analyses: an in vivo densitometric study in rabbits. Int J Oral Maxillofac Implants. 26 (4), 725-730 (2011).
  12. Agata, U., et al. The effect of different amounts of calcium intake on bone metabolism and arterial calcification in ovariectomized rats. J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo). 59 (1), 29-36 (2013).
  13. Govindarajan, P., et al. Bone matrix, cellularity, and structural changes in a rat model with high-turnover osteoporosis induced by combined ovariectomy and a multiple-deficient diet. Am J Pathol. 184 (3), 765-777 (2014).
  14. Govindarajan, P., et al. Implications of combined ovariectomy/multi-deficiency diet on rat bone with age-related variation in bone parameters and bone loss at multiple skeletal sites by DEXA. Med Sci Monit Basic Res. 19, 76-86 (2013).
  15. Alt, V., et al. A new metaphyseal bone defect model in osteoporotic rats to study biomaterials for the enhancement of bone healing in osteoporotic fractures. Acta Biomater. 9 (6), 7035-7042 (2013).
  16. Liang, H., et al. Use of a bioactive scaffold for the repair of bone defects in a novel reproducible vertebral body defect. Bone. 47 (2), 197-204 (2010).
  17. Liang, H., Li, X., Shimer, A. L., Balian, G., Shen, F. H. A novel strategy of spine defect repair with a degradable bioactive scaffold preloaded with adipose-derived stromal cells. Spine J. 14 (3), 445-454 (2014).
  18. Fujishiro, T., et al. Histological evaluation of an impacted bone graft substitute composed of a combination of mineralized and demineralized allograft in a sheep vertebral bone defect. J Biomed Mater Res A. 82 (3), 538-544 (2007).
  19. Sheyn, D., et al. Gene-modified adult stem cells regenerate vertebral bone defect in a rat model. Mol Pharm. 8 (5), 1592-1601 (2011).
  20. Phillips, F. M., et al. In vivo BMP-7 (OP-1) enhancement of osteoporotic vertebral bodies in an ovine model. Spine J. 6 (5), 500-506 (2006).
  21. Kobayashi, H., et al. Long-term evaluation of a calcium phosphate bone cement with carboxymethyl cellulose in a vertebral defect model. J Biomed Mater Res A. 88 (4), 880-888 (2009).
  22. Turner, T. M., et al. Vertebroplasty comparing injectable calcium phosphate cement compared with polymethylmethacrylate in a unique canine vertebral body large defect model. Spine J. 8 (3), 482-487 (2008).
  23. Zhu, X. S., et al. A novel sheep vertebral bone defect model for injectable bioactive vertebral augmentation materials. J Mater Sci Mater Med. 22 (1), 159-164 (2011).
  24. Vanecek, V., et al. The combination of mesenchymal stem cells and a bone scaffold in the treatment of vertebral body defects. Eur Spine J. 22 (12), 2777-2786 (2013).
  25. Geusens, P., et al. High-resolution in vivo imaging of bone and joints: a window to microarchitecture. Nat Rev Rheumatol. 10 (5), 304-313 (2014).
  26. Genant, H. K., Engelke, K., Prevrhal, S. Advanced CT bone imaging in osteoporosis. Rheumatology (Oxford). 47, 9-16 (2008).
  27. Kallai, I., et al. Microcomputed tomography-based structural analysis of various bone tissue regeneration models. Nature Protocols. 6 (1), 105-110 (2011).
  28. Lambers, F. M., Kuhn, G., Schulte, F. A., Koch, K., Muller, R. Longitudinal assessment of in vivo bone dynamics in a mouse tail model of postmenopausal osteoporosis. Calcif Tissue Int. 90 (2), 108-119 (2012).
  29. de Bakker, C. M., et al. muCT-based, in vivo dynamic bone histomorphometry allows 3D evaluation of the early responses of bone resorption and formation to PTH and alendronate combination therapy. Bone. 73, 198-207 (2015).
  30. Lan, S. H., et al. 3D image registration is critical to ensure accurate detection of longitudinal changes in trabecular bone density, microstructure, and stiffness measurements in rat tibiae by in vivo microcomputed tomography (μCT). Bone. 56 (1), 83-90 (2013).
  31. Nishiyama, K. K., Campbell, G. M., Klinck, R. J., Boyd, S. K. Reproducibility of bone micro-architecture measurements in rodents by in vivo micro-computed tomography is maximized with three-dimensional image registration. Bone. 46 (1), 155-161 (2010).
  32. Sheyn, D., et al. PTH Induces Systemically Administered Mesenchymal Stem Cells to Migrate to and Regenerate Spine Injuries. Mol Ther. 24 (2), 318-330 (2016).
  33. Lelovas, P. P., Xanthos, T. T., Thoma, S. E., Lyritis, G. P., Dontas, I. A. The laboratory rat as an animal model for osteoporosis research. Comp Med. 58 (5), 424-430 (2008).
  34. Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. J Bone Miner Res. 25 (7), 1468-1486 (2010).
  35. de Lange, G. L., et al. A histomorphometric and micro-computed tomography study of bone regeneration in the maxillary sinus comparing biphasic calcium phosphate and deproteinized cancellous bovine bone in a human split-mouth model. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol. 117 (1), 8-22 (2014).
  36. Ramalingam, S., et al. Guided bone regeneration in standardized calvarial defects using beta-tricalcium phosphate and collagen membrane: a real-time in vivo micro-computed tomographic experiment in rats. Odontology. 104 (2), 199-210 (2016).
  37. Leary, S., et al. . AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2013 edition. , (2013).
  38. Wang, M. L., Massie, J., Allen, R. T., Lee, Y. P., Kim, C. W. Altered bioreactivity and limited osteoconductivity of calcium sulfate-based bone cements in the osteoporotic rat spine. Spine J. 8 (2), 340-350 (2008).
  39. Liang, H., Li, X., Shimer, A. L., Balian, G., Shen, F. H. A novel strategy of spine defect repair with a degradable bioactive scaffold preloaded with adipose-derived stromal cells. Spine J. 14 (3), 445-454 (2013).
  40. Sheyn, D., et al. PTH induces systemically administered mesenchymal stem cells to migrate to and regenerate spine injuries. Mol Ther. 24 (2), 318-330 (2015).
  41. Matthieu, R., et al. A new rat model for translational research in bone regeneration. Tissue Eng Part C Methods. , (2015).
  42. Turner, A. S. Animal models of osteoporosis–necessity and limitations. Eur Cell Mater. 1, 66-81 (2001).

Tags

SemiautomatedLongitudinalMicrocomputed TomographyQuantitative Structural AnalysisNude RatOsteoporosisVertebral Fracture ModelGlial Regenerative MedicineBone RegenerationIn VivoAnesthesiaSurgical ProcedureAbdominal CavityLumbar SpineVertebral Bodies
check_url/55928?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Shapiro, G., Bez, M., Tawackoli, W., Gazit, Z., Gazit, D., Pelled, G. Semiautomated Longitudinal Microcomputed Tomography-based Quantitative Structural Analysis of a Nude Rat Osteoporosis-related Vertebral Fracture Model. J. Vis. Exp. (127), e55928, doi:10.3791/55928 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image