Semiautomated longitudinale Microcomputed tomografie gebaseerde kwantitatieve structurele analyse van een naakt-Rat Vertebrale fractuur osteoporose-gerelateerde Model
Summary
Het doel van dit protocol is het genereren van een naakte rat Vertebrale compressie osteoporose bedrijfsgerelateerde fractuur model dat kan worden beoordeeld op overlangs in vivo met behulp van een semiautomated microcomputed tomografie gebaseerde kwantitatieve structurele analyse.
Abstract
Osteoporose-gerelateerde Vertebrale compressie fracturen (OVCFs) zijn een gemeenschappelijk en klinisch onvervulde behoefte met toenemende prevalentie als de wereld bevolking vergrijst. Diermodellen OVCF zijn essentieel voor de preklinische ontwikkeling van translationeel weefsel engineering strategieën. Terwijl een aantal modellen bestaat, beschrijft dit protocol een geoptimaliseerde methode om meerdere zeer reproduceerbaar Vertebrale gebreken in een enkele naakt-rat. Een roman longitudinale semiautomated microcomputed tomografie (µCT)-gebaseerde kwantitatieve structurele analyse van de wervel gebreken is ook gedetailleerd. Ratten werden kort beeld op meerdere tijd punten post-op. De dag 1 scan werd omgevormd naar een standaard positie, en een standaard volume van belang was gedefinieerd. Latere µCT scans van elk rat werden automatisch geregistreerd voor de dag 1 scan dus hetzelfde volume van belang was vervolgens geanalyseerd om te beoordelen voor nieuwe biomineralisatie. Deze veelzijdige aanpak kan worden aangepast aan een verscheidenheid van andere modellen waar longitudinale imaging gebaseerde analyse zouden kunnen van nauwkeurige 3D semiautomated uitlijning profiteren. Samen genomen, beschrijft dit protocol een gemakkelijk meetbare en gemakkelijk reproduceerbaar systeem voor onderzoek van de osteoporose en bot. Het voorgestelde protocol duurt 4 maanden voor het opwekken van osteoporose in naakt ovariectomized ratten en tussen 2.7 en 4 h te genereren, beeld, en analyseren van twee Vertebrale gebreken, afhankelijk van de grootte van het weefsel en apparatuur.
Introduction
Meer dan 200 miljoen mensen wereldwijd lijden aan osteoporose1. De onderliggende pathologische afname Botmineraaldichtheid (BMD) en gewijzigde bot-microarchitectuur verhogen bot kwetsbaarheid en, bijgevolg, het relatieve risico van breuk2. Osteoporose is zo veel phishingtrucs en schadelijk voor de gezondheid dat de WHO een belangrijke openbare gezondheids-zorg heeft gedefinieerd. Bovendien, als de wereldbevolking naar verwachting aan leeftijd, osteoporose naar verwachting zelfs meer gemeengoed geworden.
Osteoporotisch Vertebrale compressie fracturen zijn de meest voorkomende onstabiele fracturen, geschat op meer dan 750.000 per jaar in de VS. Ze worden geassocieerd met significante morbiditeit en zo veel als een negen-maal hogere sterfte3. Klinische testen momenteel beschikbaar chirurgische ingrepen, zoals vertebroplasty en kyphoplasty, bleken te zijn niet effectiever dan een schijnvertoning behandeling4,5, verlaten alleen pijnbeheersing beschikbaar voor deze patiënten. Aangezien huidige behandelingen van de OVCF beperkt zijn, is het noodzakelijk om een dierlijk model dat de stoornis6,7,8kunt repliceren. Dergelijke dierlijke modellen kunnen vergemakkelijken zowel het onderzoek naar de huidige behandelingsmethoden en de ontwikkeling van nieuwe therapieën die in de klinische praktijk vertalen zal. Osteoporose is geïnduceerde en aanhoudend in model dieren door de administratie van een lage-calcium dieet (LCD) in combinatie met ovariotomie1,9,10,11, 12 , 13 , 14 , 15. om het model verder het botverlies gekoppeld aan OVCFs, Vertebrale bot gebreken werden opgericht in osteoporotisch immunocompetent ratten 16,17,18,19, 20,21,22,23,24. In dit werk, wordt een model van de wervel defect van immuungecompromitteerde ratten met gemodelleerde osteoporose weergegeven. Dit nieuwe model kan worden gebruikt ter beoordeling van cel-gebaseerde therapieën stamcellen afkomstig uit verschillende bronnen en soorten voor de reparatie van uitdagende fracturen, zoals OVCFs.
Bot imaging is een cruciaal onderdeel van de evaluatie van fracturen en ziekten van het bot. Geavanceerde beeldvormende methoden zijn ontwikkeld voor de nauwkeurige beoordeling van het bot van de structurele veranderingen en regeneratie strategieën25. Onder hen, heeft µCT imaging ontpopt als een niet-invasieve, easy-to-use en goedkope methode waarmee high-resolution 3D-beelden. µCT imaging heeft diverse voordelen ten opzichte van andere modaliteiten bij de evaluatie van osteoporose-patiënten, want het biedt hoge resolutie 3D bone microarchitectuur26 dat vervolgens kwantitatief geanalyseerd kunnen worden. De laatste kan vervolgens worden gebruikt om te vergelijken de therapeutische effecten van de voorgestelde behandelingen. Inderdaad, in vivo µCT imaging is een gouden standaard voor Vertebrale defect regeneratie toezicht van1,16,27. Echter, enkele publicaties28,29,30,31 geautomatiseerde registratie hulpmiddelen tot een minimum beperken van de gebruiker-afhankelijkheid, interpolatie bias en precisie fout van µCT hebt gebruikt Imaging-gebaseerde analyse. Onlangs waren wij de eerste met een registratieprocedure te verbeteren van de analyse van bot regeneratie in een gestandaardiseerde bone void, zoals uiteengezet in dit protocol32 .
De hier beschreven methode kan worden gebruikt voor het bestuderen van het effect van nieuwe celtherapieën voor OVCFs, ongehinderd door host T-cel-respons die XENOGENECELLEN of allogene cellen kunnen verwerpen. Osteoporose wordt bij jonge ratten door middel van ovariotomie (OVX) en 4 maanden voor een LCD veroorzaakt. De jonge leeftijd van de OVX rats, gecombineerd met de LCD toegestaan, ons te bereiken van een piek van de lage botmassa, het nabootsen van postmenopauzale osteoporose door leiden tot onomkeerbare botverlies. Dit kan worden verklaard ten dele door het feit dat tijdens het LCD-scherm en bij ongeveer 3 maanden oud, de overgang van de ratten van het bot modellering te remodelleren fase in het lumbale wervels33, waardoor de kans op behoud van de osteoporose over tijd. Met behulp van jonge dieren maakt dit model rendabeler, aangezien ze minder kosten. Echter, het wordt beperkt door inherent niet boekhouding voor de biologische veranderingen in het dier veroudering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Osteoporose is de meest voorkomende oorzaak van Vertebrale compressie fracturen veroorzaakt door een hogere belasting op de rug en dat resultaat in de ineenstorting van de wervel lichaam. Het is echter praktisch onmogelijk voor het genereren van een blessure in een knaagdier die authentiek een soortgelijke Vertebrale ineenstorting repliceert. In plaats daarvan, onderzoekers maken een cilindrische leegte in het midden van de wervel lichaam na te bootsen OVCFs16,17…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het onderzoek werd gesteund door een subsidie van het California Institute voor regeneratieve geneeskunde (CIRM) (TR2-01780).
Materials
| Isoflurane | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 501017 | |
| BetadineSolution | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 4677 | |
| Chlorhexidine Gluconate2%scrub | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 510083 | |
| Isopropyl Alcohol 70%-quart | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 501044 | |
| Carprofen | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 26357 | |
| Buprenorphine0.3mg/mL | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 56163 | |
| Ovariectomized Athymic nude rats | Harlan Laboratories, Indianapolis, IN | Hsd:RH-Foxn1 rnu | |
| Low calcium food | Newco Distributors, Inc., CA | 1814948 (5AV8 AIN-93M w/low calcium) | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies Corporation | 14190250 | |
| Dermabond | J AND J ETHICON | DHVM12 | |
| Anesthesia machine | Patterson Scientific | TEC 3EX | |
| Slide Top Induction Chambers | Patterson Scientific | 78917833 | |
| ProStation Heated Workstation | Patterson Scientific | 78914731 | |
| Surgical drape | HALYARD HEALTH INC | 89101 | |
| Magnetic fixator retraction system | Fine Science Tools, Inc., CA | 18200-50 | |
| Dissecting Scissors, 10cm, Curved, SS | World Precision Instruments, FL | 14394 | |
| Iris Scissors, 11.5cm, 45°Angle, Serrated, Sharp/Sharp | World Precision Instruments, FL | 503225 | |
| Forceps, no. 5 | World Precision Instruments, FL | 555048FT | |
| Micro Mosquito Hemostatic Forceps | World Precision Instruments, FL | 503360 | |
| Sterile cotton gauze | Medtronic, MINNEAPOLIS, MN | 9024 | |
| Absorption Spears – Mounted/Sterile | Fine Science Tools, CA | 18105-01 | |
| Syringe, 1 ml | TERUMO TERUMO MED | SS-01T | |
| Needle, 25gauge | BD MED SYS INJECTION SYS | 305127 | |
| Laminar flow hood | Baker | SterilGARD e3-Class II Type A2 Biosafety Cabinet | |
| Thermal Cautery Unit | World Precision Instruments, FL | 501292 | |
| Micro-Drill OmniDrill115/230V | World Precision Instruments, FL | 503598 | |
| Trephines for Micro Drill, 2mm diameter | Fine Science Tools, CA | 18004-20 | |
| 3-0 Vicryl undyed 27” SH taper | J AND J ETHICON | 1663G | |
| 4-0 Ethilon black 18” PC3 conventional cutting | J AND J ETHICON | 1954G | |
| Conebeam in vivo microCT (vivaCT 40) | Scanco Medical | vivaCT 40 | |
| SCANCO Medical microCT systems software suite | Scanco Medical | vivaCT 40 | |
| Analyze software | Biomedical Imaging, Mayo Clinic, Rochester, MN | Analyze 12 | Image analysis software |
| Veterenery eye ointment | |||
References
- Wang, M. L., Massie, J., Perry, A., Garfin, S. R., Kim, C. W. A rat osteoporotic spine model for the evaluation of bioresorbable bone cements. Spine J. 7 (4), 466-474 (2007).
- . Consensus development conference: prophylaxis and treatment of osteoporosis. Am J Med. 90 (1), 107-110 (1991).
- Center, J. R., Nguyen, T. V., Schneider, D., Sambrook, P. N., Eisman, J. A. Mortality after all major types of osteoporotic fracture in men and women: an observational study. Lancet. 353 (9156), 878-882 (1999).
- Buchbinder, R., et al. A randomized trial of vertebroplasty for painful osteoporotic vertebral fractures. N Engl J Med. 361 (6), 557-568 (2009).
- Kallmes, D. F., et al. A randomized trial of vertebroplasty for osteoporotic spinal fractures. N Engl J Med. 361 (6), 569-579 (2009).
- Kado, D. M., et al. Vertebral fractures and mortality in older women: a prospective study. Study of Osteoporotic Fractures Research Group. Arch Intern Med. 159 (11), 1215-1220 (1999).
- Silverman, S. L. The clinical consequences of vertebral compression fracture. Bone. 13, S27-S31 (1992).
- Ross, P. D. Clinical consequences of vertebral fractures. Am J Med. 103 (2A), 30S-43S (1997).
- Saito, T., Kin, Y., Koshino, T. Osteogenic response of hydroxyapatite cement implanted into the femur of rats with experimentally induced osteoporosis. Biomaterials. 23 (13), 2711-2716 (2002).
- Koshihara, M., Masuyama, R., Uehara, M., Suzuki, K. Effect of dietary calcium: Phosphorus ratio on bone mineralization and intestinal calcium absorption in ovariectomized rats. Biofactors. 22 (1-4), 39-42 (2004).
- Martin-Monge, E., et al. Validation of an osteoporotic animal model for dental implant analyses: an in vivo densitometric study in rabbits. Int J Oral Maxillofac Implants. 26 (4), 725-730 (2011).
- Agata, U., et al. The effect of different amounts of calcium intake on bone metabolism and arterial calcification in ovariectomized rats. J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo). 59 (1), 29-36 (2013).
- Govindarajan, P., et al. Bone matrix, cellularity, and structural changes in a rat model with high-turnover osteoporosis induced by combined ovariectomy and a multiple-deficient diet. Am J Pathol. 184 (3), 765-777 (2014).
- Govindarajan, P., et al. Implications of combined ovariectomy/multi-deficiency diet on rat bone with age-related variation in bone parameters and bone loss at multiple skeletal sites by DEXA. Med Sci Monit Basic Res. 19, 76-86 (2013).
- Alt, V., et al. A new metaphyseal bone defect model in osteoporotic rats to study biomaterials for the enhancement of bone healing in osteoporotic fractures. Acta Biomater. 9 (6), 7035-7042 (2013).
- Liang, H., et al. Use of a bioactive scaffold for the repair of bone defects in a novel reproducible vertebral body defect. Bone. 47 (2), 197-204 (2010).
- Liang, H., Li, X., Shimer, A. L., Balian, G., Shen, F. H. A novel strategy of spine defect repair with a degradable bioactive scaffold preloaded with adipose-derived stromal cells. Spine J. 14 (3), 445-454 (2014).
- Fujishiro, T., et al. Histological evaluation of an impacted bone graft substitute composed of a combination of mineralized and demineralized allograft in a sheep vertebral bone defect. J Biomed Mater Res A. 82 (3), 538-544 (2007).
- Sheyn, D., et al. Gene-modified adult stem cells regenerate vertebral bone defect in a rat model. Mol Pharm. 8 (5), 1592-1601 (2011).
- Phillips, F. M., et al. In vivo BMP-7 (OP-1) enhancement of osteoporotic vertebral bodies in an ovine model. Spine J. 6 (5), 500-506 (2006).
- Kobayashi, H., et al. Long-term evaluation of a calcium phosphate bone cement with carboxymethyl cellulose in a vertebral defect model. J Biomed Mater Res A. 88 (4), 880-888 (2009).
- Turner, T. M., et al. Vertebroplasty comparing injectable calcium phosphate cement compared with polymethylmethacrylate in a unique canine vertebral body large defect model. Spine J. 8 (3), 482-487 (2008).
- Zhu, X. S., et al. A novel sheep vertebral bone defect model for injectable bioactive vertebral augmentation materials. J Mater Sci Mater Med. 22 (1), 159-164 (2011).
- Vanecek, V., et al. The combination of mesenchymal stem cells and a bone scaffold in the treatment of vertebral body defects. Eur Spine J. 22 (12), 2777-2786 (2013).
- Geusens, P., et al. High-resolution in vivo imaging of bone and joints: a window to microarchitecture. Nat Rev Rheumatol. 10 (5), 304-313 (2014).
- Genant, H. K., Engelke, K., Prevrhal, S. Advanced CT bone imaging in osteoporosis. Rheumatology (Oxford). 47, 9-16 (2008).
- Kallai, I., et al. Microcomputed tomography-based structural analysis of various bone tissue regeneration models. Nature Protocols. 6 (1), 105-110 (2011).
- Lambers, F. M., Kuhn, G., Schulte, F. A., Koch, K., Muller, R. Longitudinal assessment of in vivo bone dynamics in a mouse tail model of postmenopausal osteoporosis. Calcif Tissue Int. 90 (2), 108-119 (2012).
- de Bakker, C. M., et al. muCT-based, in vivo dynamic bone histomorphometry allows 3D evaluation of the early responses of bone resorption and formation to PTH and alendronate combination therapy. Bone. 73, 198-207 (2015).
- Lan, S. H., et al. 3D image registration is critical to ensure accurate detection of longitudinal changes in trabecular bone density, microstructure, and stiffness measurements in rat tibiae by in vivo microcomputed tomography (μCT). Bone. 56 (1), 83-90 (2013).
- Nishiyama, K. K., Campbell, G. M., Klinck, R. J., Boyd, S. K. Reproducibility of bone micro-architecture measurements in rodents by in vivo micro-computed tomography is maximized with three-dimensional image registration. Bone. 46 (1), 155-161 (2010).
- Sheyn, D., et al. PTH Induces Systemically Administered Mesenchymal Stem Cells to Migrate to and Regenerate Spine Injuries. Mol Ther. 24 (2), 318-330 (2016).
- Lelovas, P. P., Xanthos, T. T., Thoma, S. E., Lyritis, G. P., Dontas, I. A. The laboratory rat as an animal model for osteoporosis research. Comp Med. 58 (5), 424-430 (2008).
- Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. J Bone Miner Res. 25 (7), 1468-1486 (2010).
- de Lange, G. L., et al. A histomorphometric and micro-computed tomography study of bone regeneration in the maxillary sinus comparing biphasic calcium phosphate and deproteinized cancellous bovine bone in a human split-mouth model. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol. 117 (1), 8-22 (2014).
- Ramalingam, S., et al. Guided bone regeneration in standardized calvarial defects using beta-tricalcium phosphate and collagen membrane: a real-time in vivo micro-computed tomographic experiment in rats. Odontology. 104 (2), 199-210 (2016).
- Leary, S., et al. . AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2013 edition. , (2013).
- Wang, M. L., Massie, J., Allen, R. T., Lee, Y. P., Kim, C. W. Altered bioreactivity and limited osteoconductivity of calcium sulfate-based bone cements in the osteoporotic rat spine. Spine J. 8 (2), 340-350 (2008).
- Liang, H., Li, X., Shimer, A. L., Balian, G., Shen, F. H. A novel strategy of spine defect repair with a degradable bioactive scaffold preloaded with adipose-derived stromal cells. Spine J. 14 (3), 445-454 (2013).
- Sheyn, D., et al. PTH induces systemically administered mesenchymal stem cells to migrate to and regenerate spine injuries. Mol Ther. 24 (2), 318-330 (2015).
- Matthieu, R., et al. A new rat model for translational research in bone regeneration. Tissue Eng Part C Methods. , (2015).
- Turner, A. S. Animal models of osteoporosis–necessity and limitations. Eur Cell Mater. 1, 66-81 (2001).
