Semiautomated האורך מבוסס-טומוגרפיה Microcomputed כמותיים ניתוח מבנה של מודל הקשורות אוסטיאופורוזיס שבר בחוליות עכברוש עירום
Summary
המטרה של פרוטוקול זה היא ליצור מודל שבר הקשורות אוסטאופורוזיס בחוליות עירום עכברוש יכול להיות הערכה longitudinally ויוו באמצעות semiautomated microcomputed מבוססי טומוגרפיה כמותיים וניתוח מבני.
Abstract
שברי לחץ בחוליות הקשורים לאוסטאופורוזיס (OVCFs) הם צורך נפוצות, קליניות קלינית עם הגדלת שכיחות כמו גילאי אוכלוסיית העולם. מודלים OVCF בעלי חיים חיוניים לפיתוח אסטרטגיות הנדסת רקמות translational פרה. בעוד מספר מודלים קיימת כעת, פרוטוקול זה מתאר שיטת אופטימיזציה עבור גרימת מספר פגמים בחוליות מאוד לשחזור חולדה עירום בודד. טומוגרפיה ממוחשבת הרומן האורך microcomputed semiautomated (µCT)-המבוססת על ניתוח מבנה כמותית של הליקויים בחוליות גם מפורט. בקצרה, חולדות היו עם תמונה-הזמן מרובות נקודות לאחר הניתוח. יום 1 הסריקה הייתה reoriented למיקום סטנדרטי, אמצעי אחסון רגיל עניין הוגדרה. µCT הבאים סריקות של כל עכברוש נרשמו באופן אוטומטי כדי לסרוק את יום 1 אז באותו אמצעי אחסון של עניין היה מכן נותחו כדי להעריך על היווצרות עצם חדשה. גישה זו תכליתי ניתן להתאים מגוון רחב של דגמים אחרים שבו ניתוח מבוססת הדמיה האורך יכול להפיק תועלת יישור מדויק של semiautomated תלת-ממד. יחדיו, פרוטוקול זה מתאר מערכת ברצון לכימות בקלות לשחזור למחקר אוסטאופורוזיס ועצמות. הפרוטוקול המוצע לוקח 4 חודשים כדי לגרום לאוסטאופורוזיס בחולדות ovariectomized עירום ובין h 2.7 ו- 4 כדי ליצור תמונה, לנתח שני פגמים בחוליות, בהתאם לגודל רקמות וציוד.
Introduction
יותר מ-200 מיליון אנשים ברחבי העולם סובלים אוסטאופורוזיס1. הבסיסית פתולוגיים הדירי צפיפות המינרלים של העצם (BMD) ולהגדיל המיקרו-ארכיטקטורה עצם שינו העצמות השבריריות, וכתוצאה מכך את הסיכון היחסי של שבר2. אוסטאופורוזיס היא נפוצה כל כך מזיק לבריאות אשר הגדיר זאת יש חשיבות מרכזית בבריאות הציבור. יתר על כן, כאשר אוכלוסיית העולם צפוי גיל, אוסטאופורוזיס צפוי להפוך שכיחה אפילו יותר.
שברי לחץ בחוליות osteoporotic נמצאים השברים הנפוצים השבריריות, מוערך יותר 750,000 לשנה בארצות הברית. והם קשורים עם תחלואה משמעותית, באותה מידה כפי שיעור התמותה גבוה יותר פי 9-3. בניסויים קליניים, כעת זמין התערבויות כירורגיות, כגון vertebroplasty ו- kyphoplasty, נמצאו להיות לא אפקטיבי יותר מאשר שאם הטיפול4,5, עוזב רק לניהול כאב הזמינים לחולים אלה. מאז טיפולים שוטפים OVCF מוגבלים, זה הכרחי כדי לפתח מודל חיה שיכולים לשכפל את עצמם הפרעת6,7,8. מודלים בעלי חיים כזה יכול להקל על החקירה של שיטות הטיפול הנוכחי והן לפיתוח טיפולים זה יתורגם הקלינית. אוסטאופורוזיס המושרה ומתמשכת בחיות מודל דרך המינהל של דיאטה נמוכה-סידן (LCD) בשילוב עם ovariectomy1,9,10,11, 12 , 13 , 14 , 15. לדגמן עוד יותר את איבוד העצם המשויך OVCFs, פגמים העצם בחוליות הוקמו חולדות immunocompetent osteoporotic 16,17,18,19, 20,21,22,23,24. בעבודה זו, מוצג מודל פגם בחוליות של חולדות immunocompromised עם אוסטיאופורוזיס מעוצבת. מודל חדש זה יכול לשמש כדי להעריך טיפולים מבוססי תאים מעורבים בתאי גזע שמקורם מקורות שונים, מינים עבור התיקון של שברים מאתגר, כגון OVCFs.
עצם הדמיה היא חלק חיוני של הערכת של שברים, מחלות עצם. שיטות הדמיה מתקדמות פותחו עבור הערכה מדויקת של שינויים מבניים עצם והתחדשות אסטרטגיות25. ביניהם, µCT הדמיה התפתחה שיטה לא פולשנית, קל לשימוש, וזולה שמספקת תמונות תלת-ממד ברזולוציה גבוהה. הדמיה µCT יש כמה יתרונות על פני באופנים בהערכת חולי אוסטיאופורוזיס, כפי שהוא מציע תלת-ממד ברזולוציה גבוהה עצם המיקרו-ארכיטקטורה26 ואז ניתן לנתח באופן כמותי. האחרון יכול לשמש לאחר מכן כדי להשוות את ההשפעות הטיפוליות הטיפולים המוצע. אכן, אין ויוו µCT הדמיה הוא תקן הזהב עבור התחדשות פגם בחוליות ניטור16,1,27. עם זאת, מספר פרסומים28,29,30,31 המועסקים הרשמה אוטומטית כלים כדי לצמצם את התלות המשתמש, אינטרפולציה משוא דיוק שגיאה של µCT הדמיה המבוססת על ניתוח. לאחרונה, היינו הראשונים להשתמש הליך רישום כדי לשפר את הניתוח של התחדשות העצם ב עצם מתוקננת void, כמוסבר זה פרוטוקול32 .
השיטה המתוארת כאן יכול לשמש כדי לחקור את ההשפעה של טיפולים חדשניים תא עבור OVCFs, באין מפריע על-ידי מארח התגובות T-cell שידחה תאים xenogeneic או allogeneic. אוסטאופורוזיס מושרה בחולדות צעירות דרך ovariectomy (OVX) ו- 4 חודשים של LCD. בגילו הצעיר של החולדות OVX, בשילוב עם צג ה-LCD מותר, לנו להגיע של מסת העצם שיא נמוך, מחקה באוסטיאופורוזיס בגיל המעבר על ידי המוביל אובדן עצם בלתי הפיך. זו יכולה להיות מוסברת חלקית על ידי העובדה כי, במהלך ה-LCD ו- בסביבות 3 חודשים של גיל, המעבר חולדות העצם כדי שיפוצים שלב לחוליות המותניים,33, ובכך מגדיל את הסבירות של שמירה על אוסטאופורוזיס מעל הגיע הזמן. באמצעות חיות צעירות הופך מודל זה יותר חסכוני, כפי שהם עולים פחות. בכל זאת, זה מוגבל על ידי מטבעו לא והיוו השינויים הביולוגיים לחיה המזדקנת.
Protocol
Representative Results
Discussion
אוסטאופורוזיס היא הגורם הנפוץ ביותר של שברים בחוליות הנגרמת על ידי עומס גובר על עמוד השדרה ועל התוצאה בקריסת הגוף בחוליות. עם זאת, כמעט בלתי אפשרי לייצר פציעה מכרסם אותנטי משכפל התמוטטות בחוליות דומה. במקום זאת, החוקרים ליצור חלל גלילי במרכז הגוף בחוליות לחקות OVCFs16,<sup clas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחקר נתמך על ידי מענק ממכון קליפורניה עבור הרגנרציה לרפואה (CIRM) (TR2-01780).
Materials
| Isoflurane | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 501017 | |
| BetadineSolution | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 4677 | |
| Chlorhexidine Gluconate2%scrub | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 510083 | |
| Isopropyl Alcohol 70%-quart | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 501044 | |
| Carprofen | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 26357 | |
| Buprenorphine0.3mg/mL | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 56163 | |
| Ovariectomized Athymic nude rats | Harlan Laboratories, Indianapolis, IN | Hsd:RH-Foxn1 rnu | |
| Low calcium food | Newco Distributors, Inc., CA | 1814948 (5AV8 AIN-93M w/low calcium) | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies Corporation | 14190250 | |
| Dermabond | J AND J ETHICON | DHVM12 | |
| Anesthesia machine | Patterson Scientific | TEC 3EX | |
| Slide Top Induction Chambers | Patterson Scientific | 78917833 | |
| ProStation Heated Workstation | Patterson Scientific | 78914731 | |
| Surgical drape | HALYARD HEALTH INC | 89101 | |
| Magnetic fixator retraction system | Fine Science Tools, Inc., CA | 18200-50 | |
| Dissecting Scissors, 10cm, Curved, SS | World Precision Instruments, FL | 14394 | |
| Iris Scissors, 11.5cm, 45°Angle, Serrated, Sharp/Sharp | World Precision Instruments, FL | 503225 | |
| Forceps, no. 5 | World Precision Instruments, FL | 555048FT | |
| Micro Mosquito Hemostatic Forceps | World Precision Instruments, FL | 503360 | |
| Sterile cotton gauze | Medtronic, MINNEAPOLIS, MN | 9024 | |
| Absorption Spears – Mounted/Sterile | Fine Science Tools, CA | 18105-01 | |
| Syringe, 1 ml | TERUMO TERUMO MED | SS-01T | |
| Needle, 25gauge | BD MED SYS INJECTION SYS | 305127 | |
| Laminar flow hood | Baker | SterilGARD e3-Class II Type A2 Biosafety Cabinet | |
| Thermal Cautery Unit | World Precision Instruments, FL | 501292 | |
| Micro-Drill OmniDrill115/230V | World Precision Instruments, FL | 503598 | |
| Trephines for Micro Drill, 2mm diameter | Fine Science Tools, CA | 18004-20 | |
| 3-0 Vicryl undyed 27” SH taper | J AND J ETHICON | 1663G | |
| 4-0 Ethilon black 18” PC3 conventional cutting | J AND J ETHICON | 1954G | |
| Conebeam in vivo microCT (vivaCT 40) | Scanco Medical | vivaCT 40 | |
| SCANCO Medical microCT systems software suite | Scanco Medical | vivaCT 40 | |
| Analyze software | Biomedical Imaging, Mayo Clinic, Rochester, MN | Analyze 12 | Image analysis software |
| Veterenery eye ointment | |||
References
- Wang, M. L., Massie, J., Perry, A., Garfin, S. R., Kim, C. W. A rat osteoporotic spine model for the evaluation of bioresorbable bone cements. Spine J. 7 (4), 466-474 (2007).
- . Consensus development conference: prophylaxis and treatment of osteoporosis. Am J Med. 90 (1), 107-110 (1991).
- Center, J. R., Nguyen, T. V., Schneider, D., Sambrook, P. N., Eisman, J. A. Mortality after all major types of osteoporotic fracture in men and women: an observational study. Lancet. 353 (9156), 878-882 (1999).
- Buchbinder, R., et al. A randomized trial of vertebroplasty for painful osteoporotic vertebral fractures. N Engl J Med. 361 (6), 557-568 (2009).
- Kallmes, D. F., et al. A randomized trial of vertebroplasty for osteoporotic spinal fractures. N Engl J Med. 361 (6), 569-579 (2009).
- Kado, D. M., et al. Vertebral fractures and mortality in older women: a prospective study. Study of Osteoporotic Fractures Research Group. Arch Intern Med. 159 (11), 1215-1220 (1999).
- Silverman, S. L. The clinical consequences of vertebral compression fracture. Bone. 13, S27-S31 (1992).
- Ross, P. D. Clinical consequences of vertebral fractures. Am J Med. 103 (2A), 30S-43S (1997).
- Saito, T., Kin, Y., Koshino, T. Osteogenic response of hydroxyapatite cement implanted into the femur of rats with experimentally induced osteoporosis. Biomaterials. 23 (13), 2711-2716 (2002).
- Koshihara, M., Masuyama, R., Uehara, M., Suzuki, K. Effect of dietary calcium: Phosphorus ratio on bone mineralization and intestinal calcium absorption in ovariectomized rats. Biofactors. 22 (1-4), 39-42 (2004).
- Martin-Monge, E., et al. Validation of an osteoporotic animal model for dental implant analyses: an in vivo densitometric study in rabbits. Int J Oral Maxillofac Implants. 26 (4), 725-730 (2011).
- Agata, U., et al. The effect of different amounts of calcium intake on bone metabolism and arterial calcification in ovariectomized rats. J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo). 59 (1), 29-36 (2013).
- Govindarajan, P., et al. Bone matrix, cellularity, and structural changes in a rat model with high-turnover osteoporosis induced by combined ovariectomy and a multiple-deficient diet. Am J Pathol. 184 (3), 765-777 (2014).
- Govindarajan, P., et al. Implications of combined ovariectomy/multi-deficiency diet on rat bone with age-related variation in bone parameters and bone loss at multiple skeletal sites by DEXA. Med Sci Monit Basic Res. 19, 76-86 (2013).
- Alt, V., et al. A new metaphyseal bone defect model in osteoporotic rats to study biomaterials for the enhancement of bone healing in osteoporotic fractures. Acta Biomater. 9 (6), 7035-7042 (2013).
- Liang, H., et al. Use of a bioactive scaffold for the repair of bone defects in a novel reproducible vertebral body defect. Bone. 47 (2), 197-204 (2010).
- Liang, H., Li, X., Shimer, A. L., Balian, G., Shen, F. H. A novel strategy of spine defect repair with a degradable bioactive scaffold preloaded with adipose-derived stromal cells. Spine J. 14 (3), 445-454 (2014).
- Fujishiro, T., et al. Histological evaluation of an impacted bone graft substitute composed of a combination of mineralized and demineralized allograft in a sheep vertebral bone defect. J Biomed Mater Res A. 82 (3), 538-544 (2007).
- Sheyn, D., et al. Gene-modified adult stem cells regenerate vertebral bone defect in a rat model. Mol Pharm. 8 (5), 1592-1601 (2011).
- Phillips, F. M., et al. In vivo BMP-7 (OP-1) enhancement of osteoporotic vertebral bodies in an ovine model. Spine J. 6 (5), 500-506 (2006).
- Kobayashi, H., et al. Long-term evaluation of a calcium phosphate bone cement with carboxymethyl cellulose in a vertebral defect model. J Biomed Mater Res A. 88 (4), 880-888 (2009).
- Turner, T. M., et al. Vertebroplasty comparing injectable calcium phosphate cement compared with polymethylmethacrylate in a unique canine vertebral body large defect model. Spine J. 8 (3), 482-487 (2008).
- Zhu, X. S., et al. A novel sheep vertebral bone defect model for injectable bioactive vertebral augmentation materials. J Mater Sci Mater Med. 22 (1), 159-164 (2011).
- Vanecek, V., et al. The combination of mesenchymal stem cells and a bone scaffold in the treatment of vertebral body defects. Eur Spine J. 22 (12), 2777-2786 (2013).
- Geusens, P., et al. High-resolution in vivo imaging of bone and joints: a window to microarchitecture. Nat Rev Rheumatol. 10 (5), 304-313 (2014).
- Genant, H. K., Engelke, K., Prevrhal, S. Advanced CT bone imaging in osteoporosis. Rheumatology (Oxford). 47, 9-16 (2008).
- Kallai, I., et al. Microcomputed tomography-based structural analysis of various bone tissue regeneration models. Nature Protocols. 6 (1), 105-110 (2011).
- Lambers, F. M., Kuhn, G., Schulte, F. A., Koch, K., Muller, R. Longitudinal assessment of in vivo bone dynamics in a mouse tail model of postmenopausal osteoporosis. Calcif Tissue Int. 90 (2), 108-119 (2012).
- de Bakker, C. M., et al. muCT-based, in vivo dynamic bone histomorphometry allows 3D evaluation of the early responses of bone resorption and formation to PTH and alendronate combination therapy. Bone. 73, 198-207 (2015).
- Lan, S. H., et al. 3D image registration is critical to ensure accurate detection of longitudinal changes in trabecular bone density, microstructure, and stiffness measurements in rat tibiae by in vivo microcomputed tomography (μCT). Bone. 56 (1), 83-90 (2013).
- Nishiyama, K. K., Campbell, G. M., Klinck, R. J., Boyd, S. K. Reproducibility of bone micro-architecture measurements in rodents by in vivo micro-computed tomography is maximized with three-dimensional image registration. Bone. 46 (1), 155-161 (2010).
- Sheyn, D., et al. PTH Induces Systemically Administered Mesenchymal Stem Cells to Migrate to and Regenerate Spine Injuries. Mol Ther. 24 (2), 318-330 (2016).
- Lelovas, P. P., Xanthos, T. T., Thoma, S. E., Lyritis, G. P., Dontas, I. A. The laboratory rat as an animal model for osteoporosis research. Comp Med. 58 (5), 424-430 (2008).
- Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. J Bone Miner Res. 25 (7), 1468-1486 (2010).
- de Lange, G. L., et al. A histomorphometric and micro-computed tomography study of bone regeneration in the maxillary sinus comparing biphasic calcium phosphate and deproteinized cancellous bovine bone in a human split-mouth model. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol. 117 (1), 8-22 (2014).
- Ramalingam, S., et al. Guided bone regeneration in standardized calvarial defects using beta-tricalcium phosphate and collagen membrane: a real-time in vivo micro-computed tomographic experiment in rats. Odontology. 104 (2), 199-210 (2016).
- Leary, S., et al. . AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2013 edition. , (2013).
- Wang, M. L., Massie, J., Allen, R. T., Lee, Y. P., Kim, C. W. Altered bioreactivity and limited osteoconductivity of calcium sulfate-based bone cements in the osteoporotic rat spine. Spine J. 8 (2), 340-350 (2008).
- Liang, H., Li, X., Shimer, A. L., Balian, G., Shen, F. H. A novel strategy of spine defect repair with a degradable bioactive scaffold preloaded with adipose-derived stromal cells. Spine J. 14 (3), 445-454 (2013).
- Sheyn, D., et al. PTH induces systemically administered mesenchymal stem cells to migrate to and regenerate spine injuries. Mol Ther. 24 (2), 318-330 (2015).
- Matthieu, R., et al. A new rat model for translational research in bone regeneration. Tissue Eng Part C Methods. , (2015).
- Turner, A. S. Animal models of osteoporosis–necessity and limitations. Eur Cell Mater. 1, 66-81 (2001).
