Halvautomatiserad längsgående Microcomputed tomografi-baserade kvantitativa strukturella analysen av en naken råtta osteoporosrelaterade kotfrakturer modell
Summary
Målet med detta protokoll är att generera en naken råtta benskörhetsrelaterade vertebrala komprimering fraktur modell som kan vara längdriktningen utvärderade i vivo med en halvautomatiserad microcomputed tomografi-baserade kvantitativa strukturell analys.
Abstract
Benskörhetsrelaterade vertebrala kompressionsfrakturer (OVCFs) är ett vanligt och kliniskt otillfredsställda behov med ökande prevalens i världens befolkning åldras. OVCF djurmodeller är nödvändiga för den prekliniska utvecklingen av translationell tissue engineering strategier. Medan ett antal modeller finns för närvarande, beskriver det här protokollet en optimerad metod för att inducera flera mycket reproducerbara vertebrala defekter i en enda naken råtta. En roman längsgående halvautomatiserad microcomputed tomografi (µCT)-baserade kvantitativa strukturella analysen av vertebrala defekterna är också detaljerade. Kort, råttor var avbildade på flera tid punkter efter op. Dag 1 Skanna var omorienteras till standardpositionen och en standard volym av intresse definierades. Efterföljande µCT skanningar av varje råtta registrerades automatiskt till dag 1 avsöka så samma volym av intresse var sedan analyseras för att bedöma för ny benbildning. Detta mångsidiga tillvägagångssätt kan anpassas till en mängd andra modeller där längsgående imaging-baserad analys kunde dra nytta av exakt 3D halvautomatiserad anpassning. Sammantaget beskriver det här protokollet ett lätt kvantifierbara och enkelt reproducerbar system för osteoporos och ben forskning. Föreslagna protokollet tar 4 månader att inducera osteoporos i naken ovariectomized råttor och mellan 2,7 och 4 h att generera, bild och analysera två vertebrala defekter, beroende på vävnad storlek och utrustning.
Introduction
Mer än 200 miljoner människor i världen lider av benskörhet1. Den underliggande patologiska minskning av bentätheten (BMD) och förändrad ben mikroarkitektur öka ben skörheten och, följaktligen, den relativa risken för fraktur2. Osteoporos är så utbrett och skadliga för hälsan att WHO har definierat det som ett stort folkhälsoproblem. Dessutom eftersom världens befolkning väntas ålder, förväntas osteoporos bli ännu vanligare.
Osteoporotiska vertebrala kompressionsfrakturer är de vanligaste instabila frakturer, uppskattningsvis mer än 750 000 om året i USA. De är förknippade med betydande morbiditet och så mycket som en nio-gånger högre dödlighet Betygsätt3. I kliniska prövningar befanns för närvarande tillgängliga kirurgiska ingrepp, såsom vertebroplasty och kyphoplasty, vara ingen mer effektiv än en simulerad behandling4,5, lämnar endast smärtlindring finns till dessa patienter. Eftersom nuvarande OVCF behandlingar är begränsade, är det absolut nödvändigt att utveckla en djurmodell som kan replikera den sjukdom6,7,8. Sådana modeller kan underlätta både utredningen av nuvarande behandlingsmetoder och utvecklingen av nya terapier som kommer att översätta till klinisk praxis. Osteoporos har inducerad och ihållande i modell djur genom förvaltning av en låg-kalcium kost (LCD) i samband med ovariektomi1,9,10,11, 12 , 13 , 14 , 15. för att ytterligare modell av benförlust associerad med OVCFs, vertebrala ben defekter etablerades osteoporotiska immunkompetenta råttor 16,17,18,19, 20,21,22,23,24. I detta arbete presenteras en vertebrala defekt modell av Immuninkompetenta råttor med modellerade osteoporos. Denna nya modell kan användas för att bedöma cellbaserade terapier som involverar stamceller som härrör från olika källor och arter för reparation av utmanande frakturer, såsom OVCFs.
Ben bildbehandling är en viktig del av utvärdering av frakturer och benvävnad. Avancerade avbildningsmetoder har utvecklats för korrekt bedömning av strukturella ben förändringar och förnyelse strategier25. Bland dem, har µCT imaging framträtt som en icke-invasiv, lätt-till-använda och billig metod som ger högupplöst 3D-bilder. µCT imaging har flera fördelar över andra modaliteter i utvärdera patienter med osteoporos, eftersom den erbjuder högupplösta 3D ben mikroarkitektur26 som sedan kan analyseras kvantitativt. Den senare kan sedan användas för att jämföra de terapeutiska effekterna av föreslagna behandlingar. I vivo µCT imaging är faktiskt en guld-standard för vertebrala defekt regenerering övervakning1,16,27. Dock har några publikationer28,29,30,31 anställda automatisk registrering verktyg för att minimera den användaren-beroende, interpolation bias och precision fel av µCT Imaging-baserad analys. Nyligen var vi först med att använda ett registreringsförfarande för att förbättra analysen av ben förnyelse i ett standardiserat ben ogiltiga, som förklaras i detta protokoll nr32 .
Den metod som beskrivs här kan användas för att studera effekten av romanen cellterapi för OVCFs, obehindrat av värd T-cell svar som skulle avvisa allogena eller xenogena celler. Osteoporos är induceras hos unga råttor genom ovariektomi (OVX) och 4 månader för en LCD. Ung ålder av OVX råttorna, kombinerat med LCD får oss att nå en låg maximal benmassa, härma postmenopausal osteoporos av leder till oåterkalleliga benförlust. Detta kan delvis förklaras av det faktum att, under LCD-skärmen och på cirka 3 månader, råttor övergången från benet modellering till remodeling fas på ländkotorna33, vilket ökar sannolikheten för att upprätthålla osteoporos tid. Med unga djur gör denna modell mer kostnadseffektivt, eftersom de kostar mindre. Dock begränsas av sin natur inte redovisning av de biologiska förändringarna i den åldrande djuren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Osteoporos är den vanligaste orsaken till vertebrala kompressionsfrakturer orsakade av en ökad belastning på ryggraden och som leder till kollaps av ryggraden kroppen. Det är dock omöjligt att generera en skada i en gnagare som autentiskt replikerar en liknande vertebrala kollaps. Forskare skapa i stället ett cylindriskt tomrum i mitten av ryggraden kroppen att efterlikna OVCFs16,17,18,19…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskningen stöddes av ett bidrag från California Institute för regenerativ medicin (CIRM) (TR2-01780).
Materials
| Isoflurane | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 501017 | |
| BetadineSolution | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 4677 | |
| Chlorhexidine Gluconate2%scrub | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 510083 | |
| Isopropyl Alcohol 70%-quart | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 501044 | |
| Carprofen | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 26357 | |
| Buprenorphine0.3mg/mL | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 56163 | |
| Ovariectomized Athymic nude rats | Harlan Laboratories, Indianapolis, IN | Hsd:RH-Foxn1 rnu | |
| Low calcium food | Newco Distributors, Inc., CA | 1814948 (5AV8 AIN-93M w/low calcium) | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies Corporation | 14190250 | |
| Dermabond | J AND J ETHICON | DHVM12 | |
| Anesthesia machine | Patterson Scientific | TEC 3EX | |
| Slide Top Induction Chambers | Patterson Scientific | 78917833 | |
| ProStation Heated Workstation | Patterson Scientific | 78914731 | |
| Surgical drape | HALYARD HEALTH INC | 89101 | |
| Magnetic fixator retraction system | Fine Science Tools, Inc., CA | 18200-50 | |
| Dissecting Scissors, 10cm, Curved, SS | World Precision Instruments, FL | 14394 | |
| Iris Scissors, 11.5cm, 45°Angle, Serrated, Sharp/Sharp | World Precision Instruments, FL | 503225 | |
| Forceps, no. 5 | World Precision Instruments, FL | 555048FT | |
| Micro Mosquito Hemostatic Forceps | World Precision Instruments, FL | 503360 | |
| Sterile cotton gauze | Medtronic, MINNEAPOLIS, MN | 9024 | |
| Absorption Spears – Mounted/Sterile | Fine Science Tools, CA | 18105-01 | |
| Syringe, 1 ml | TERUMO TERUMO MED | SS-01T | |
| Needle, 25gauge | BD MED SYS INJECTION SYS | 305127 | |
| Laminar flow hood | Baker | SterilGARD e3-Class II Type A2 Biosafety Cabinet | |
| Thermal Cautery Unit | World Precision Instruments, FL | 501292 | |
| Micro-Drill OmniDrill115/230V | World Precision Instruments, FL | 503598 | |
| Trephines for Micro Drill, 2mm diameter | Fine Science Tools, CA | 18004-20 | |
| 3-0 Vicryl undyed 27” SH taper | J AND J ETHICON | 1663G | |
| 4-0 Ethilon black 18” PC3 conventional cutting | J AND J ETHICON | 1954G | |
| Conebeam in vivo microCT (vivaCT 40) | Scanco Medical | vivaCT 40 | |
| SCANCO Medical microCT systems software suite | Scanco Medical | vivaCT 40 | |
| Analyze software | Biomedical Imaging, Mayo Clinic, Rochester, MN | Analyze 12 | Image analysis software |
| Veterenery eye ointment | |||
References
- Wang, M. L., Massie, J., Perry, A., Garfin, S. R., Kim, C. W. A rat osteoporotic spine model for the evaluation of bioresorbable bone cements. Spine J. 7 (4), 466-474 (2007).
- . Consensus development conference: prophylaxis and treatment of osteoporosis. Am J Med. 90 (1), 107-110 (1991).
- Center, J. R., Nguyen, T. V., Schneider, D., Sambrook, P. N., Eisman, J. A. Mortality after all major types of osteoporotic fracture in men and women: an observational study. Lancet. 353 (9156), 878-882 (1999).
- Buchbinder, R., et al. A randomized trial of vertebroplasty for painful osteoporotic vertebral fractures. N Engl J Med. 361 (6), 557-568 (2009).
- Kallmes, D. F., et al. A randomized trial of vertebroplasty for osteoporotic spinal fractures. N Engl J Med. 361 (6), 569-579 (2009).
- Kado, D. M., et al. Vertebral fractures and mortality in older women: a prospective study. Study of Osteoporotic Fractures Research Group. Arch Intern Med. 159 (11), 1215-1220 (1999).
- Silverman, S. L. The clinical consequences of vertebral compression fracture. Bone. 13, S27-S31 (1992).
- Ross, P. D. Clinical consequences of vertebral fractures. Am J Med. 103 (2A), 30S-43S (1997).
- Saito, T., Kin, Y., Koshino, T. Osteogenic response of hydroxyapatite cement implanted into the femur of rats with experimentally induced osteoporosis. Biomaterials. 23 (13), 2711-2716 (2002).
- Koshihara, M., Masuyama, R., Uehara, M., Suzuki, K. Effect of dietary calcium: Phosphorus ratio on bone mineralization and intestinal calcium absorption in ovariectomized rats. Biofactors. 22 (1-4), 39-42 (2004).
- Martin-Monge, E., et al. Validation of an osteoporotic animal model for dental implant analyses: an in vivo densitometric study in rabbits. Int J Oral Maxillofac Implants. 26 (4), 725-730 (2011).
- Agata, U., et al. The effect of different amounts of calcium intake on bone metabolism and arterial calcification in ovariectomized rats. J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo). 59 (1), 29-36 (2013).
- Govindarajan, P., et al. Bone matrix, cellularity, and structural changes in a rat model with high-turnover osteoporosis induced by combined ovariectomy and a multiple-deficient diet. Am J Pathol. 184 (3), 765-777 (2014).
- Govindarajan, P., et al. Implications of combined ovariectomy/multi-deficiency diet on rat bone with age-related variation in bone parameters and bone loss at multiple skeletal sites by DEXA. Med Sci Monit Basic Res. 19, 76-86 (2013).
- Alt, V., et al. A new metaphyseal bone defect model in osteoporotic rats to study biomaterials for the enhancement of bone healing in osteoporotic fractures. Acta Biomater. 9 (6), 7035-7042 (2013).
- Liang, H., et al. Use of a bioactive scaffold for the repair of bone defects in a novel reproducible vertebral body defect. Bone. 47 (2), 197-204 (2010).
- Liang, H., Li, X., Shimer, A. L., Balian, G., Shen, F. H. A novel strategy of spine defect repair with a degradable bioactive scaffold preloaded with adipose-derived stromal cells. Spine J. 14 (3), 445-454 (2014).
- Fujishiro, T., et al. Histological evaluation of an impacted bone graft substitute composed of a combination of mineralized and demineralized allograft in a sheep vertebral bone defect. J Biomed Mater Res A. 82 (3), 538-544 (2007).
- Sheyn, D., et al. Gene-modified adult stem cells regenerate vertebral bone defect in a rat model. Mol Pharm. 8 (5), 1592-1601 (2011).
- Phillips, F. M., et al. In vivo BMP-7 (OP-1) enhancement of osteoporotic vertebral bodies in an ovine model. Spine J. 6 (5), 500-506 (2006).
- Kobayashi, H., et al. Long-term evaluation of a calcium phosphate bone cement with carboxymethyl cellulose in a vertebral defect model. J Biomed Mater Res A. 88 (4), 880-888 (2009).
- Turner, T. M., et al. Vertebroplasty comparing injectable calcium phosphate cement compared with polymethylmethacrylate in a unique canine vertebral body large defect model. Spine J. 8 (3), 482-487 (2008).
- Zhu, X. S., et al. A novel sheep vertebral bone defect model for injectable bioactive vertebral augmentation materials. J Mater Sci Mater Med. 22 (1), 159-164 (2011).
- Vanecek, V., et al. The combination of mesenchymal stem cells and a bone scaffold in the treatment of vertebral body defects. Eur Spine J. 22 (12), 2777-2786 (2013).
- Geusens, P., et al. High-resolution in vivo imaging of bone and joints: a window to microarchitecture. Nat Rev Rheumatol. 10 (5), 304-313 (2014).
- Genant, H. K., Engelke, K., Prevrhal, S. Advanced CT bone imaging in osteoporosis. Rheumatology (Oxford). 47, 9-16 (2008).
- Kallai, I., et al. Microcomputed tomography-based structural analysis of various bone tissue regeneration models. Nature Protocols. 6 (1), 105-110 (2011).
- Lambers, F. M., Kuhn, G., Schulte, F. A., Koch, K., Muller, R. Longitudinal assessment of in vivo bone dynamics in a mouse tail model of postmenopausal osteoporosis. Calcif Tissue Int. 90 (2), 108-119 (2012).
- de Bakker, C. M., et al. muCT-based, in vivo dynamic bone histomorphometry allows 3D evaluation of the early responses of bone resorption and formation to PTH and alendronate combination therapy. Bone. 73, 198-207 (2015).
- Lan, S. H., et al. 3D image registration is critical to ensure accurate detection of longitudinal changes in trabecular bone density, microstructure, and stiffness measurements in rat tibiae by in vivo microcomputed tomography (μCT). Bone. 56 (1), 83-90 (2013).
- Nishiyama, K. K., Campbell, G. M., Klinck, R. J., Boyd, S. K. Reproducibility of bone micro-architecture measurements in rodents by in vivo micro-computed tomography is maximized with three-dimensional image registration. Bone. 46 (1), 155-161 (2010).
- Sheyn, D., et al. PTH Induces Systemically Administered Mesenchymal Stem Cells to Migrate to and Regenerate Spine Injuries. Mol Ther. 24 (2), 318-330 (2016).
- Lelovas, P. P., Xanthos, T. T., Thoma, S. E., Lyritis, G. P., Dontas, I. A. The laboratory rat as an animal model for osteoporosis research. Comp Med. 58 (5), 424-430 (2008).
- Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. J Bone Miner Res. 25 (7), 1468-1486 (2010).
- de Lange, G. L., et al. A histomorphometric and micro-computed tomography study of bone regeneration in the maxillary sinus comparing biphasic calcium phosphate and deproteinized cancellous bovine bone in a human split-mouth model. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol. 117 (1), 8-22 (2014).
- Ramalingam, S., et al. Guided bone regeneration in standardized calvarial defects using beta-tricalcium phosphate and collagen membrane: a real-time in vivo micro-computed tomographic experiment in rats. Odontology. 104 (2), 199-210 (2016).
- Leary, S., et al. . AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2013 edition. , (2013).
- Wang, M. L., Massie, J., Allen, R. T., Lee, Y. P., Kim, C. W. Altered bioreactivity and limited osteoconductivity of calcium sulfate-based bone cements in the osteoporotic rat spine. Spine J. 8 (2), 340-350 (2008).
- Liang, H., Li, X., Shimer, A. L., Balian, G., Shen, F. H. A novel strategy of spine defect repair with a degradable bioactive scaffold preloaded with adipose-derived stromal cells. Spine J. 14 (3), 445-454 (2013).
- Sheyn, D., et al. PTH induces systemically administered mesenchymal stem cells to migrate to and regenerate spine injuries. Mol Ther. 24 (2), 318-330 (2015).
- Matthieu, R., et al. A new rat model for translational research in bone regeneration. Tissue Eng Part C Methods. , (2015).
- Turner, A. S. Animal models of osteoporosis–necessity and limitations. Eur Cell Mater. 1, 66-81 (2001).
