Semiautomatizado Longitudinal basado en la tomografía Microcomputed cuantitativo análisis estructural de un modelo de rata desnuda fractura Vertebral relacionada con la Osteoporosis
Summary
El objetivo de este protocolo es generar un modelo de fractura de compresión vertebral relacionada con la osteoporosis rata desnudo que puede ser evaluados longitudinalmente en vivo usando un microcomputed semiautomatizado basado en tomografía cuantitativa análisis estructural.
Abstract
Las fracturas de compresión vertebrales relacionadas con la osteoporosis (OVCFs) son una necesidad común y clínicamente no satisfecha con el aumento de prevalencia como las edades de la población de mundo. Modelos OVCF animales son esenciales para el desarrollo preclínico de estrategias de ingeniería de tejido traslacional. Mientras que en la actualidad existe un número de modelos, este protocolo describe un método optimizado para la inducción de defectos vertebrales altamente reproducibles múltiples en una sola rata desnuda. Una tomografía de la novela microcomputed semiautomatizado longitudinal (µCT)-basado en análisis estructural cuantitativa de los defectos vertebrales también se detallan. Brevemente, las ratas fueron reflejadas en múltiples puntos de tiempo post operatorio. La exploración de día 1 fue reorientada a la posición estándar y se define un volumen de interés. Exploraciones posteriores µCT de cada rata fueron registradas automáticamente para la exploración del día 1 por lo que el mismo volumen de interés entonces se analizaron para evaluar para la nueva formación del hueso. Este enfoque versátil adaptable a una variedad de otros modelos donde análisis longitudinal basado en la proyección de imagen podrían beneficiarse de una alineación exacta 3D. semiautomatizada. Tomados en conjunto, este protocolo describe un sistema fácilmente cuantificable y fácilmente reproducible para la investigación de la osteoporosis y del hueso. El protocolo sugerido toma 4 meses para inducir osteoporosis en ratas ovariectomizadas desnudas y entre 2,7 y 4 h para generar, de la imagen y analizar dos defectos vertebrales, dependiendo del tamaño del tejido y el equipo.
Introduction
Más de 200 millones de personas en todo el mundo sufren de osteoporosis1. Patológico subyacente disminución de la densidad mineral ósea (DMO) y microarquitectura ósea alterada aumentar la fragilidad del hueso y, consecuentemente, el riesgo relativo de fractura2. La osteoporosis es tan frecuente y nocivo para la salud que la OMS ha definido una preocupación de salud pública importante. Además, como la población mundial se espera que a la edad, osteoporosis se espera llegar a ser aún más común.
Las fracturas de compresión vertebrales osteoporóticas son las fracturas más comunes de fragilidad, estimadas en más de 750.000 al año en los Estados Unidos. Se asocian con morbilidad significativa y tanto como una mortalidad mayor de nueve veces la tarifa3. En los ensayos clínicos, actualmente disponibles intervenciones quirúrgicas, como la vertebroplastia y cifoplastia, fueron encontradas para no ser más eficaz que un impostor tratamiento4,5, dejando sólo el tratamiento del dolor disponible para estos pacientes. Puesto que los tratamientos actuales de OVCF son limitados, es imprescindible para el desarrollo de un modelo animal que puede replicar el desorden6,7,8. Tales modelos animales podrían facilitar la investigación de los métodos actuales de tratamiento y el desarrollo de nuevas terapias que se traducirá en la práctica clínica. La osteoporosis ha sido inducida y sostenido en animales modelo mediante la administración de una dieta baja en calcio (LCD) en conjunto con ovariectomía1,9,10,11, 12 , 13 , 14 , 15. para modelar aún más la pérdida de hueso asociada con OVCFs, defectos óseos vertebrales se establecieron en las ratas inmunocompetentes 16,17,18,19, 20,21,22,23,24. En este trabajo se presenta un modelo de defecto vertebral de immunocompromised ratas con osteoporosis modelada. Este nuevo modelo puede utilizarse para evaluar terapias celulares con células de diferentes fuentes y especies para la reparación de fracturas difíciles, tales como OVCFs.
La proyección de imagen del hueso es una parte crucial de la evaluación de fracturas y enfermedades óseas. Métodos de proyección de imagen avanzados fueron desarrollados para la evaluación precisa de cambios óseos estructurales y de estrategias de regeneración25. Entre ellos, la proyección de imagen µCT ha surgido como un método no invasivo, de fácil de usar y de bajo costo que ofrece imágenes 3D de alta resolución. La proyección de imagen µCT tiene varias ventajas sobre otras modalidades en la evaluación de pacientes de osteoporosis, ya que ofrece alta resolución 3D osea microarquitectura26 que luego pueden ser analizadas cuantitativamente. Este último puede entonces utilizarse para comparar los efectos terapéuticos de tratamientos propuestos. De hecho, en vivo µCT la proyección de imagen es un estándar de oro para la regeneración de defectos vertebrales monitoreo1,16,27. Sin embargo, algunas publicaciones28,29,30,31 han empleado herramientas de registro automatizado para minimizar la dependencia del usuario, sesgo de interpolación y error de precisión de µCT Análisis basado en la proyección de imagen. Recientemente, fuimos los primeros en utilizar un procedimiento de registro para mejorar el análisis de la regeneración ósea en un hueso estandarizado vacío, como se explica en este protocolo32 .
El método aquí descrito se puede utilizar para estudiar el efecto de terapias celulares nuevos para OVCFs, unhindered por host respuestas de células T que pueden rechazar las células alogénicas o xenogeneicos. La osteoporosis es inducida en ratas jóvenes a través de la ovariectomía (OVX) y 4 meses de un LCD. La edad de las ratas OVX, combinado con la pantalla LCD, nos permitió alcanzar una masa ósea pico baja, imitando la osteoporosis postmenopáusica conduciendo a la pérdida ósea irreversible. Esto puede explicarse en parte por el hecho de que, en la pantalla LCD y alrededor de 3 meses de edad, la transición de las ratas del hueso modelado para remodelación de la fase en la vértebras lumbares33, aumentando así la probabilidad de mantener la osteoporosis tiempo. Utilizando animales jóvenes hace que este modelo más rentable, como cuestan menos. Sin embargo, está limitada por intrínsecamente no son responsables de los cambios biológicos en el animal de envejecimiento.
Protocol
Representative Results
Discussion
La osteoporosis es la causa más frecuente de las fracturas de compresión vertebral causada por una carga mayor sobre la columna vertebral y que resultan en el colapso del cuerpo vertebral. Sin embargo, es prácticamente imposible generar una lesión en un roedor que auténticamente Replica similar colapso vertebral. En cambio, los investigadores crean un vacío cilíndrico en el centro del cuerpo vertebral para imitar OVCFs16,17,18<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La investigación fue apoyada por una beca del Instituto de California de medicina regenerativa (CIRM) (TR2-01780).
Materials
| Isoflurane | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 501017 | |
| BetadineSolution | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 4677 | |
| Chlorhexidine Gluconate2%scrub | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 510083 | |
| Isopropyl Alcohol 70%-quart | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 501044 | |
| Carprofen | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 26357 | |
| Buprenorphine0.3mg/mL | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 56163 | |
| Ovariectomized Athymic nude rats | Harlan Laboratories, Indianapolis, IN | Hsd:RH-Foxn1 rnu | |
| Low calcium food | Newco Distributors, Inc., CA | 1814948 (5AV8 AIN-93M w/low calcium) | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies Corporation | 14190250 | |
| Dermabond | J AND J ETHICON | DHVM12 | |
| Anesthesia machine | Patterson Scientific | TEC 3EX | |
| Slide Top Induction Chambers | Patterson Scientific | 78917833 | |
| ProStation Heated Workstation | Patterson Scientific | 78914731 | |
| Surgical drape | HALYARD HEALTH INC | 89101 | |
| Magnetic fixator retraction system | Fine Science Tools, Inc., CA | 18200-50 | |
| Dissecting Scissors, 10cm, Curved, SS | World Precision Instruments, FL | 14394 | |
| Iris Scissors, 11.5cm, 45°Angle, Serrated, Sharp/Sharp | World Precision Instruments, FL | 503225 | |
| Forceps, no. 5 | World Precision Instruments, FL | 555048FT | |
| Micro Mosquito Hemostatic Forceps | World Precision Instruments, FL | 503360 | |
| Sterile cotton gauze | Medtronic, MINNEAPOLIS, MN | 9024 | |
| Absorption Spears – Mounted/Sterile | Fine Science Tools, CA | 18105-01 | |
| Syringe, 1 ml | TERUMO TERUMO MED | SS-01T | |
| Needle, 25gauge | BD MED SYS INJECTION SYS | 305127 | |
| Laminar flow hood | Baker | SterilGARD e3-Class II Type A2 Biosafety Cabinet | |
| Thermal Cautery Unit | World Precision Instruments, FL | 501292 | |
| Micro-Drill OmniDrill115/230V | World Precision Instruments, FL | 503598 | |
| Trephines for Micro Drill, 2mm diameter | Fine Science Tools, CA | 18004-20 | |
| 3-0 Vicryl undyed 27” SH taper | J AND J ETHICON | 1663G | |
| 4-0 Ethilon black 18” PC3 conventional cutting | J AND J ETHICON | 1954G | |
| Conebeam in vivo microCT (vivaCT 40) | Scanco Medical | vivaCT 40 | |
| SCANCO Medical microCT systems software suite | Scanco Medical | vivaCT 40 | |
| Analyze software | Biomedical Imaging, Mayo Clinic, Rochester, MN | Analyze 12 | Image analysis software |
| Veterenery eye ointment | |||
References
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