Target-specifikke sonder repræsenterer et innovativt værktøj til at analysere molekylære mekanismer, såsom protein udtryk i forskellige typer af sygdomme (fx inflammation, infektion og tumordannelse). I denne undersøgelse beskriver vi en kvantitativ tredimensionale tomografisk vurdering af intestinal makrofag infiltration i en murine model af colitis bruger F4/80-specifikke fluorescens-medieret tomografi.
Murine modeller af sygdommen er uundværlige for videnskabelig forskning. Men mange diagnostiske værktøjer som endoskopi eller tomografisk imaging er ikke rutinemæssigt ansat i dyremodeller. Konventionelle eksperimentelle udlæsninger afhængige ofte slagtningen og ex vivo analyser, der forhindre intra individuelle opfølgende undersøgelser og øge antallet af undersøgelse dyr behov. Fluorescens-medieret tomografi gør det muligt for en ikke-invasiv, repetitive, kvantitative, tre-dimensionelle vurdering af fluorescerende sonder. Det er yderst følsom og tillader brug af molekylære beslutningstagere, som giver mulighed for specifikke påvisning og karakterisering af forskellige molekylære mål. Især repræsenterer målrettet sonder et innovativt værktøj til at analysere genekspression aktivering og protein i inflammation, autoimmun sygdom, infektion, karsygdom, celle migration, tumordannelse, osv. I denne artikel giver vi trinvise instruktioner på denne avancerede imaging-teknologi til i vivo påvisning og karakterisering af betændelse (dvs. F4/80-positive makrofager infiltration) i en udbredte murine model af tarmbetændelse. Denne teknik kan også anvendes i andre forskningsområder som immun celle eller stamceller tracking.
Dyremodeller er meget udbredt i videnskabelig forskning, og mange ikke-invasive procedurer findes til skærm sygdomsaktivitet og vitalitet, som kvantificering af kroppens vægtændringer eller analyse af blod, urin og afføring. Disse er imidlertid kun indirekte surrogat parametre, der er også omfattet af indbyrdes individuelle variation. De skal ofte suppleres med slagtningen analyser af væv modellen, som forhindrer seriel observation på gentagne gang point og direkte observation af fysiologiske eller patologiske processer in vivo. Sofistikeret lille dyr Billeddannende teknikker er dukket op, herunder grænseoverskridende Sektional imaging, optiske billeddannelse og endoskopi, som giver mulighed for direkte visualisering af disse processer og også giver mulighed for gentagne analyser af de samme dyr1 , 2 , 3. Derudover mulighed for at gentagne overvåge forskellige stater af sygdom i den samme dyr kan reducere antallet af dyr behov, der måtte være ønskeligt fra en Dyreetik synspunkt.
Flere forskellige optiske billeddannelse teknikker findes i vivo fluorescens billeddannelse. Oprindeligt, Konfokal imaging var ansat til at studere overflade og undergrund fluorescerende begivenheder4,5. For nylig har tomografisk systemer, der giver mulighed for kvantitative tredimensionale væv vurderinger blevet udviklet6. Dette er opnået gennem udvikling af fluorescerende sonder, der udsender lys i nær-infrarødt (NIR) spektrum, tilbyder lav absorption, følsomme detektorer og monokromatiske lys kilder7. Mens traditionelle tværsnittet Billeddannende teknikker, såsom computertomografi (CT), magnetisk resonans imaging (MR) eller ultralyd (USA), for det meste er afhængige af fysiske parametre og visualisere morfologi, kan optiske billeddannelse give yderligere oplysninger på underliggende molekylære processer sonder ved hjælp af endogen eller eksogen fluorescerende8.
Fremskridt inden for Molekylærbiologi har bidraget til at lette generation af smart og målrettede fluorescerende molekylære sonder til et stigende antal mål. For eksempel, kan receptor-medieret udbredelse og distribution i en given målområdet visualiseres ved hjælp af carbocyanine derivat-mærket antistoffer9. Overfloden af tilgængelige antistoffer, som kan mærkes for at fungere som specifikke røbestoffer i ellers utilgængelige områder af kroppen, giver hidtil uset indsigt i molekylære og cellulære processer i modeller af tumordannelse og neurodegenerative, hjerte-kar-, immunologiske og inflammatoriske sygdomme7.
I denne undersøgelse beskriver vi brugen af fluorescens-medieret tomografi i en murine model af colitis. Dextran natriumsulfat (DSS)-induceret colitis er en standard kemisk inducerede musemodel af tarmbetændelse, der ligner inflammatoriske tarm sygdom (IBD)10. Det er især nyttigt at vurdere bidrag af den medfødte immunsystem til udviklingen af gut betændelse11. Da ansættelse, aktivering og infiltration af monocytter og makrofager repræsenterer afgørende trin i patogenesen af IBD, er visualisering af deres ansættelse og kinetik af infiltration afgørende for overvågning, for eksempel effekten af potentielle terapeutiske stoffer i en prækliniske indstilling12. Vi beskriver induktion af DSS colitis og påvise-tomografi-medieret karakterisering af makrofag perkolatnedsivning i tarm mucosa ved hjælp af fluorescens molekylære tomografi for specifikke visualisering af monocyt/makrofag markør F4/80 13. Derudover vi illustrere hjælpeansatte og supplerende procedurer, såsom antistof mærkning; opsætningen af eksperimenterende; og analyse og fortolkning af de fremkomne billeder, i sammenhæng med konventionelle udlæsninger som sygdom aktivitet indekser, flow flowcytometri og histologiske analyse og Immunhistokemi. Vi diskutere begrænsninger af denne teknik og sammenligninger med andre billeddiagnostiske modaliteter.
Selv om medicinske Billeddannende teknikker har udviklet sig hurtigt i de seneste år, er vi stadig begrænset vores evne til at detektere inflammatoriske processer eller tumorer, samt andre sygdomme i deres tidligste udviklingsfaser. Dette er imidlertid afgørende at forståelse tumorvækst, invasion, eller udvikling af metastaser og cellulære processer i udviklingen af inflammatoriske sygdomme og degenerative, hjerte-kar- og immunologiske sygdomme. Mens traditionelle Billeddannende teknikker er afhængige af fysiske e…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Ms. Sonja Dufentester, Ms. Elke Weber og Mrs Klaudia Niepagenkämper for den fremragende teknisk bistand.
Reagents | |||
Alfalfa-free diet | Harlan Laboritories, Madison, USA | 2014 | |
Bepanthen eye ointment | Bayer, Leverkusen, Germany | 80469764 | |
Dextran sulphate sodium (DSS) | TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden | DB001 | |
Eosin | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 4382 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 9884 | |
Florene 100V/V | Abbott, Wiesbaden, Germany | B506 | |
Haematoxylin | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | HHS32-1L | |
O.C.T. Tissue Tek compound | Sakura, Zoeterwonde, Netherlands | 4583 | fixative for histological analyses |
Phosphate buffered saline, PBS | Lonza, Verviers, Belgium | 4629 | |
Sodium Chloride 0,9% | Braun, Melsungen, Germany | 5/12211095/0411 | |
Sodium bicarbonate powder | Sigma Aldrich Deisenhofen, Germany | S5761 | |
Standard diet | Altromin, Lage, Germany | 1320 | |
Tissue-Tek Cryomold | Sakura, Leiden, Netherlands | 4566 | |
Hemoccult (guaiac paper test) | Beckmann Coulter, Germany | 3060 | |
Biotin rat-anti-mouse anti-F4/80 antibody | Serotec, Oxford, UK | MCA497B | |
Biotin rat-anti-mouse anti-GR-1 | BD Pharmingen, Heidelberg Germany | 553125 | |
Streptavidin-Alexa546 | Molecular Probes, Darmstadt, Germany | S-11225 | excitation/emission maximum: 556/573nm |
Anti-CD11b rat-anti-mouse antibody TC | Calteg, Burlingame, USA | R2b06 | |
Purified anti-mouse F4/80 antibody | BioLegend, London, UK | 123102 | |
DAPI | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | D9542 | |
FITC-conjugated anti-Ly6C rat-anti-mouse antibody | BD Pharmingen, Heidelberg, Germany | 553104 | |
FACS buffer | BD Pharmingen, Heidelberg, Germany | 342003 | |
Cy7 NHS Ester | GE Healthcare Europe, Freiburg, Germany | PA17104 | |
MPO ELISA | Immundiagnostik AG, Bensheim, Germany | K 6631B | |
Cy5.5 labeled anti-mouse F4/80 antibody | BioLegend, London, UK | 123127 | ready to use labelled Antibodies (alternative) |
Anti-Mouse F4/80 Antigen PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience, Waltham, USA | 45-4801-80 | ready to use labelled Antibodies (alternative) |
DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 67-68-5 | |
Isoflurane | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 792632 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 64-17-5 | |
Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | A4612 | |
Tris Buffered Saline Solution (TBS) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | SRE0032 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
FACS Calibur Flow Cytometry System | BD Biosciences GmbH, Heidelberg, Germany | ||
FMT 2000 In Vivo Imaging System | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | FMT2000 | |
True Quant 3.1 Imaging Analysis Software | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | included in FMT2000 | |
Leica DMLB Fluorescent Microscope | Leica, 35578 Wetzlar, Germany | DMLB | |
Bandelin Sonopuls HD 2070 | Bandelin, 12207 Berlin, Germany | HD 2070 | ultrasonic homogenizer |
Disposable scalpel No 10 | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z692395-10EA | |
Metzenbaum scissors 14cm | Ehrhardt Medizinprodukte GmbH, Geislingen, Germany | 22398330 | |
luer lock syringe 5ml | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z248010 | |
syringe needles | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z192368 | |
Falcon Tube 50ml | BD Biosciences, Erembodegem, Belgium | 352070 |