Mål-specifika prober representerar ett innovativt verktyg för att analysera molekylära mekanismer, såsom proteinuttryck i olika typer av sjukdom (t.ex. inflammation, infektion och uppkomst). I denna studie beskriver vi en kvantitativ tredimensionella tomografiska bedömning av intestinal makrofag infiltration i en murin modell av kolit med F4/80-specifika fluorescens-medierad tomografi.
Murina modeller av sjukdom är oumbärliga för vetenskaplig forskning. Många diagnostiska verktyg såsom endoskopi eller datortomografisk imaging används dock inte rutinmässigt i djurmodeller. Konventionella experimentella utläsningar förlitar sig ofta på besiktning och ex vivo analyser, som förhindra inom enskilda uppföljande undersökningar och öka antalet studie djur behövs. Fluorescens-medierad datortomografi gör det möjligt för icke-invasiv, repetitiva, kvantitativa, tredimensionella bedömningen av fluorescerande sonder. Det är mycket känsliga och tillåter användning av molekylära beslutsfattare, vilket möjliggör specifika identifiering och karakterisering av olika molekylära mål. Särskilt representerar riktade sonder ett innovativt verktyg för att analysera aktivering och protein genuttryck i inflammation, autoimmun sjukdom, infektion, kärlsjukdom, cellmigration, tumourigenesis, etc. I denna artikel tillhandahåller vi stegvisa instruktioner på denna sofistikerade bildteknik för i vivo upptäckt och karakterisering av inflammation (dvs F4/80-positiva makrofag infiltration) i en allmänt använd murina modell av tarminflammation. Denna teknik kan också användas inom andra områden, såsom immun cell eller stem cell tracking.
Djurmodeller används allmänt i vetenskaplig forskning och många icke-invasiva förfaranden finns för att övervaka sjukdomsaktivitet och vitalitet, såsom kvantifiering av kroppsvikten eller analys av blod, urin och avföring. Dock är dessa endast indirekt surrogat parametrar som också omfattas av interindividuell variabilitet. De måste ofta kompletteras med obduktion analyser av vävnad exemplar, som förhindrar seriell observation vid repetitiva tidpunkter och direkt observation av fysiologiska eller patologiska processer i vivo. Sofistikerade små djur bildgivande tekniker har dykt upp, inklusive cross sectional imaging, optisk imaging och endoskopi, som möjliggör direkt visualisering av dessa processer och tillåter också för upprepade analyser av samma djur1 , 2 , 3. Dessutom möjligheten att upprepande övervaka olika stadier av sjukdomen på samma djur kan minska antalet djur som behövs, vilket kan vara önskvärt ur ett djuretik synvinkel.
Det finns flera olika optisk imaging tekniker för i vivo fluorescens imaging. Ursprungligen anställdes confocal imaging att studera och under markytan fluorescerande händelser4,5. Nyligen har dock har tomografiska system som möjliggör kvantitativa tredimensionella vävnad bedömningar varit utvecklade6. Detta har åstadkommits genom utveckling av fluorescerande sonder som avger ljus i det nära infraröda (NIR) spektrumet, erbjuder låg absorption, känsliga detektorer och monokromatiskt ljus källor7. Medan traditionella cross-sectioning avbildningstekniker, såsom datortomografi (CT), magnetkamera (MRI) eller ultraljud (USA), främst förlitar sig på fysiska parametrar och visualisera morfologi, kan optisk imaging ge ytterligare information på underliggande molekylära processer sonder med hjälp av endogena eller exogena fluorescerande8.
Framstegen inom molekylärbiologi har bidragit till att underlätta genereringen av smart och riktade fluorescerande molekylära sonder för ett ökande antal mål. Till exempel kan receptormedierad upptag och distribution i en given målområdet visualiseras med hjälp av carbocyanine derivat-märkt antikroppar9. Överflödet av tillgängliga antikroppar, som kan vara märkt för att fungera som specifika spårämnen i annars otillgängliga områden av kroppen, ger oöverträffad insikter molekylära och cellulära processer i modeller av uppkomst och neurodegenerativa, hjärt-, immunologiska och inflammatoriska sjukdomar7.
I denna studie beskriver vi användningen av fluorescens-medierad tomografi i en murin modell av kolit. Dextran natriumsulfat (DSS)-inducerad kolit är en standard kemiskt inducerad musmodell av tarminflammation som liknar upphetsande läkt sjukdom (IBD)10. Det är särskilt användbart för utvärdering av bidraget av det medfödda immunsystemet till utvecklingen av tarm inflammation11. Eftersom den rekrytering, aktivering och infiltration av monocyter och makrofager representerar viktiga steg i patogenesen av IBD, är visualisering av deras rekrytering och kineticsen av infiltration viktigt för övervakning, till exempel effekten av potentiella terapeutiska ämnen i en preklinisk inställning12. Vi beskriva induktion av DSS kolit och Visa tomografi-medierad karakterisering av makrofag infiltration i tarmslemhinnan i med hjälp av fluorescens molekylär tomografi för specifika visualisering av monocyt/makrofag markören F4/80 13. Dessutom kan vi illustrera hjälppersonal och kompletterande förfaranden, såsom antikropp märkning. den experimentella setup; och analys och tolkning av erhållna bilderna, i samband med konventionella utläsningar såsom sjukdom aktivitet index, flöde flödescytometri och histologisk analys och immunohistokemi. Vi diskutera begränsningar av denna teknik och jämförelser till andra avbildningsmetoder.
Även om medicinska bildgivande tekniker har utvecklats snabbt under de senaste åren, är vi fortfarande begränsade i vår förmåga att upptäcka inflammatoriska processer eller tumörer, samt andra sjukdomar, i sina tidigaste utvecklingsstadier. Detta är dock viktigt att förstå tumörtillväxt, invasion, eller metastaser utveckling och cellulära processer i utvecklingen av inflammatoriska sjukdomar och degenerativa, kardiovaskulära och immunologiska sjukdomar. Medan traditionella avbildningstekniker förlitar si…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Ms. Sonja Dufentester, Ms. Elke Weber och Mrs Klaudia Niepagenkämper med utmärkta tekniska bistånd.
Reagents | |||
Alfalfa-free diet | Harlan Laboritories, Madison, USA | 2014 | |
Bepanthen eye ointment | Bayer, Leverkusen, Germany | 80469764 | |
Dextran sulphate sodium (DSS) | TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden | DB001 | |
Eosin | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 4382 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 9884 | |
Florene 100V/V | Abbott, Wiesbaden, Germany | B506 | |
Haematoxylin | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | HHS32-1L | |
O.C.T. Tissue Tek compound | Sakura, Zoeterwonde, Netherlands | 4583 | fixative for histological analyses |
Phosphate buffered saline, PBS | Lonza, Verviers, Belgium | 4629 | |
Sodium Chloride 0,9% | Braun, Melsungen, Germany | 5/12211095/0411 | |
Sodium bicarbonate powder | Sigma Aldrich Deisenhofen, Germany | S5761 | |
Standard diet | Altromin, Lage, Germany | 1320 | |
Tissue-Tek Cryomold | Sakura, Leiden, Netherlands | 4566 | |
Hemoccult (guaiac paper test) | Beckmann Coulter, Germany | 3060 | |
Biotin rat-anti-mouse anti-F4/80 antibody | Serotec, Oxford, UK | MCA497B | |
Biotin rat-anti-mouse anti-GR-1 | BD Pharmingen, Heidelberg Germany | 553125 | |
Streptavidin-Alexa546 | Molecular Probes, Darmstadt, Germany | S-11225 | excitation/emission maximum: 556/573nm |
Anti-CD11b rat-anti-mouse antibody TC | Calteg, Burlingame, USA | R2b06 | |
Purified anti-mouse F4/80 antibody | BioLegend, London, UK | 123102 | |
DAPI | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | D9542 | |
FITC-conjugated anti-Ly6C rat-anti-mouse antibody | BD Pharmingen, Heidelberg, Germany | 553104 | |
FACS buffer | BD Pharmingen, Heidelberg, Germany | 342003 | |
Cy7 NHS Ester | GE Healthcare Europe, Freiburg, Germany | PA17104 | |
MPO ELISA | Immundiagnostik AG, Bensheim, Germany | K 6631B | |
Cy5.5 labeled anti-mouse F4/80 antibody | BioLegend, London, UK | 123127 | ready to use labelled Antibodies (alternative) |
Anti-Mouse F4/80 Antigen PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience, Waltham, USA | 45-4801-80 | ready to use labelled Antibodies (alternative) |
DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 67-68-5 | |
Isoflurane | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 792632 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 64-17-5 | |
Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | A4612 | |
Tris Buffered Saline Solution (TBS) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | SRE0032 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
FACS Calibur Flow Cytometry System | BD Biosciences GmbH, Heidelberg, Germany | ||
FMT 2000 In Vivo Imaging System | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | FMT2000 | |
True Quant 3.1 Imaging Analysis Software | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | included in FMT2000 | |
Leica DMLB Fluorescent Microscope | Leica, 35578 Wetzlar, Germany | DMLB | |
Bandelin Sonopuls HD 2070 | Bandelin, 12207 Berlin, Germany | HD 2070 | ultrasonic homogenizer |
Disposable scalpel No 10 | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z692395-10EA | |
Metzenbaum scissors 14cm | Ehrhardt Medizinprodukte GmbH, Geislingen, Germany | 22398330 | |
luer lock syringe 5ml | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z248010 | |
syringe needles | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z192368 | |
Falcon Tube 50ml | BD Biosciences, Erembodegem, Belgium | 352070 |