Определение экспрессии клеточной поверхности и эндоцитарной скорости белков в культурах первичных астроцитов с использованием биотинилирования
Summary
В этом отчете представлены два метода на основе биотинилирования, предназначенных для определения экспрессии клеток и эндоцитарной скорости белков, экспрессируемых в плазматической мембране.
Abstract
Белки клеточной поверхности опосредуют широкий спектр функций. Во многих случаях их активность регулируется эндоцитарными процессами, которые модулируют их уровни на плазматической мембране. Здесь мы приводим подробные протоколы для 2 методов, которые облегчают изучение таких процессов, оба из которых основаны на принципе биотинилирования белков клеточной поверхности. Первая из них предназначена для полуколичественного определения относительных уровней конкретного белка на поверхности клетки. В нем лизиновые остатки белков плазматической мембраны сначала мечены биотиновой частью. После того, как клетки лизируются, эти белки могут затем быть специально осаждены с использованием иммобилизованного агарозой стрептавидина, используя природную аффинность последнего для биотина. Белки, выделенные таким образом, затем могут быть проанализированы с помощью стандартного метода вестерн-блоттинга. Второй способ обеспечивает средство определения скорости эндоцитовAr-клеточной поверхности в течение определенного периода времени. Белки клеточной поверхности сначала модифицируют производным биотина, содержащим расщепляемую дисульфидную связь. Затем клетки переносятся обратно в нормальные условия культивирования, что приводит к поглощению эндоцитов доли биотинилированных белков. Затем дисульфидные связи неинниционированных групп биотина восстанавливаются с использованием мембранонепроницаемого восстановителя глутатиона. Благодаря этому подходу эндоцитозные белки могут быть выделены и количественно определены с высокой степенью специфичности.
Introduction
Белки на поверхности клеток играют множество ролей, центральных для поддержания функции клеток. Во многих случаях их активность зависит от или модулируется эндоцитарными процессами, которые либо временно секвестрируют их во внутриклеточных сайтах, либо направляют их на деградирующие пути 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . Здесь мы выделяем два подхода на основе биотинилирования, предназначенные для того, чтобы пользователь мог специфически маркировать и изолировать белки, выраженные на плазматической мембране, и те, которые были недавно интернализованы. С помощью этих методов экспрессия клеточной поверхности и скорость эндоцитов любого представляющего интерес белка могут быть количественно определены, что позволяет получить более четкую оценку его регулирования.
Определение относительной экспрессии белка клеточной поверхности путем биотинилирования
Биотин или витамин B7, ранее известный как витамин H 6 , представляет собой небольшую водорастворимую молекулу, которая может быть использована для химического изменения реакционноспособных аминов, сульфгидрильных и карбоксильных групп биологических молекул. Текущая культура биотинилирующих реагентов на поверхности клеток состоит в основном из мембранно-непроницаемых сульфированных N-гидроксисукцинимидных (сульфо-NHS) эфиров биотина или его производных, предназначенных для взаимодействия с аминами, присутствующими на боковых цепях лизиновых остатков белков, выраженных в Клеточной поверхности, когда они депротонированы в основных условиях, в результате чего последний образует амидную связь с биотиновой частью 7 . Таким образом, модифицированные белки клеточной поверхности затем могут быть выделены с использованием авидина, теримерного белка 66-69 кДа, обладающего большим сродством к биотину, связывающегося с ним с константой диссоциации приблизительно 10-15 , отмечая ее как одну из Самые сильные нековалентные взаимодействия, известные 8 </suP> , 9 .
В предыдущих исследованиях использовался ряд альтернативных методов количественного определения экспрессии белка на поверхности клетки. Маркировка неперфинансированных клеток с использованием флуоресцентно меченных антител, специфичных для интересующего белка, с последующей визуализацией с помощью флуоресцентной микроскопии, например, является обычно используемым подходом, но в значительной степени зависит от наличия антител, которые могут связываться с внеклеточными эпитопами. Совсем недавно были успешно применены методы, связанные с использованием химерных белков, несущих рН-чувствительные флуорофоры, которые реагируют на воздействие кислых сред. 10 . Однако такие анализы обычно включают экзогенную экспрессию этих конструкций в клеточных линиях, в которых интересующий белок изначально не обнаружен. Эти подходы, тем не менее, могут предоставить ценную информацию о субклеточной локализации и экзоцитарном маршрутеЦелевого белка, и поэтому его следует использовать в сочетании с подходами на основе биотинилирования, описанными здесь, если инструменты доступны.
В типичном анализе биотинилирования клетки сначала тщательно промывают в PBS при 4 ° С. Это удаляет любые следы белков сыворотки, вводимых культуральной средой, тем самым гарантируя, что они не будут потреблять избыточные количества биотина на следующем этапе. Что еще более важно, снижение температуры приводит к значительному замедлению эндоцитоза. Затем добавляют биотинилирующий реагент. Затем клетки снова промывают и затем инкубируют с закалочным буфером, содержащим либо глицин, либо NH 4 Cl, целью которого является инактивация всех оставшихся следов непрореагировавшего биотина. Затем клетки лизируют, после чего добавляют агароз-иммобилизованный стрептавидин для осаждения биотинилированных белков. Анализ обычно проводят через вестерн-блоттинг, позволяя относительную экспрессию клеточной поверхности различных пр.Катехинов, подлежащих количественному определению.
Благодаря основанию этого анализа он подходит для использования только с белками, обладающими участками, подверженными воздействию внеклеточной среды. Наиболее эффективными для этого являются мультимные трансмембранные белки, которые, вероятно, обладают рядом реакционноспособных лизинов в их петлевых областях, в то время как однопроходные белки, как правило, менее восприимчивы к биотинилированию. Даже в этих случаях сохраняется вероятность того, что конформационные изменения или межмолекулярные взаимодействия могут перекрывать некоторые реакционноспособные сайты, что приводит к более низким, чем ожидалось, выходам биотинилирования.
Определение скорости интернализации белков клеточной поверхности путем биотинилирования
Принципы этого анализа во многом аналогичны принципам биотинилирования клеточной поверхности, за некоторыми исключениями, наиболее важным из которых является использование обратимых реагентов биотинилирования. Группы биотина (из них) обладают дисуВ пределах их структур, которые восприимчивы к восстановителям; Это используется для обеспечения того, чтобы только белки клеточной поверхности, взятые во внутриклеточные сайты в течение периода анализа, оставались биотинилированными. Анализ обычно проводится следующим образом. Клетки сначала промывают и биотинилируют с помощью холодных реагентов, затем снова добавляют среду для культивирования клеток при 37 ° С и клетки возвращают в инкубатор; Это приводит к тому, что меченые белки клеточной поверхности подвергаются эндоцитозу. Затем добавляют глутатион восстановителя, который не может проникать через мембрану, для разрыва дисульфидных связей биотиновых остатков, связанных с белками, остающимися на поверхности клетки. Наконец, сломанные дисульфидные связи реагируют с иодацетамидом, потребляя лабильные тиольные группы и препятствуя реформированию связей. Как и раньше, клетки затем лизируют, и меченые белки осаждаются с использованием стрептавидин-агарозы.
Ограничение дискаИспользуемые в предыдущем разделе, также применимы здесь из-за сходства между методами. Кроме того, следует иметь в виду, что температурные сдвиги, участвующие в этом анализе, исключают точное определение того, сколько белка эндоцитозу для каждого возрастания времени, особенно в случае быстро интернализованных или быстро рециркулирующих белков. Поэтому анализ дает только полуколичественную оценку показателей эндоцитов. Общая флуоресцентная микроскопия внутреннего отражения может использоваться для отслеживания поглощения каждого загруженного везикула и обеспечения более точного измерения кинетики эндоцитоза. Поэтому он может служить очень полезным дополнением к этому анализу, предполагая, что имеется флуоресцентно меченная химерная конструкция представляющего интерес белка 11 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Модификации:
Поскольку эти методы были разработаны для использования с адгезивными клетками, мы указали использование PBS, содержащего 100 мг / л MgCl 2 ∙ 6H 2 O и
100 мг / л CaCl 2 (CM-PBS) для этапов промывки и в качестве основы некоторых буферов, чтобы гар?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Этот проект был поддержан Канадским Институтом Исследования Здравоохранения PG # 20R47867.
Materials
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Fisher Scientific | A661-500 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9647-50 | |
| Bromophenol blue | Bio-Rad | #1610404 | |
| cOmplete protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| Disodium ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA) | Bio-Rad | #1610729 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | #1610611 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 11960-044 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Fisher Scientific | #21335 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotin | Thermo Fisher Scientific | #21331 | |
| Fetal bovine serum | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Iodoacetamide | Bio-Rad | #163-2109 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma-Aldrich | L2020 | Thaw on ice. |
| L-glutamine | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
| Mouse monoclonal anti-β-actin antibody (AC-15) | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| Mouse monoclonal anti-β-dystroglycan antibody (43DAG1/8D5) | Leica Biosystems | B-DG-CE | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 715-035-150 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-045 | |
| Phosphate buffer saline | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Reduced glutathione | Sigma-Aldrich | G6529 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 862010 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318-100 | |
| Streptavidin agarose resin | Thermo Fisher Scientific | #20347 | |
| Rabbit polyclonal anti-AQP4 antibody | Alomone | AQP-004 | |
| Tris base (Trizma base) | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-1 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 |
References
- Baskin, G., Schenker, S., Frosto, T., Henderson, G. Transforming growth factor beta 1 inhibits epidermal growth factor receptor endocytosis and down-regulation in cultured fetal rat hepatocytes. J Biol Chem. 266 (20), 13238-13242 (1991).
- Hazum, E., Cuatrecasas, P., Marian, J., Conn, P. M. Receptor-mediated internalization of fluorescent gonadotropin-releasing hormone by pituitary gonadotropes. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (11), 6692-6695 (1980).
- Hemmaplardh, D., Morgan, E. H. Transferrin uptake and release by reticulocytes treated with proteolytic enzymes and neuraminidase. Biochim Biophys Acta. 426 (3), 385-398 (1976).
- Katsura, T., et al. Constitutive and regulated membrane expression of aquaporin 1 and aquaporin 2 water channels in stably transfected LLC-PK1 epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (16), 7212-7216 (1995).
- Li, Y., Cam, J., Bu, G. Low-density lipoprotein receptor family: endocytosis and signal transduction. Mol Neurobiol. 23 (1), 53-67 (2001).
- Gyorgy, P., Melville, D. B., Burk, D., Du Vigneaud, V. The possible identity of vitamin H with biotin and coenzyme R. Science. 91 (2358), 243-245 (1940).
- Cole, S. R., Ashman, L. K., Ey, P. L. Biotinylation: an alternative to radioiodination for the identification of cell surface antigens in immunoprecipitates. Mol Immunol. 24 (7), 699-705 (1987).
- Green, N. M. Avidin 1. the use of [14-C]biotin for kinetic studies and for assay. Biochem J. 89 (3), 585-591 (1963).
- Korpela, J. Avidin, a high affinity biotin-binding protein, as a tool and subject of biological research. Med Biol. 62 (1), 5-26 (1984).
- Li, Y., et al. Imaging pHluorin-tagged receptor insertion to the plasma membrane in primary cultured mouse neurons. J Vis Exp. (69), e4450 (2012).
- Soohoo, A. L., Bowersox, S. L., Puthenveedu, M. A. Visualizing clathrin-mediated endocytosis of G protein-coupled receptors at single-event resolution via TIRF microscopy. J Vis Exp. (92), e51805 (2014).
- Noel, G., Tham, D. K., Moukhles, H. Interdependence of laminin-mediated clustering of lipid rafts and the dystrophin complex in astrocytes. J Biol Chem. 284 (29), 19694-19704 (2009).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Madrid, R., et al. Polarized trafficking and surface expression of the AQP4 water channel are coordinated by serial and regulated interactions with different clathrin-adaptor complexes. EMBO J. 20 (24), 7008-7021 (2001).
- Tham, D. K., Joshi, B., Moukhles, H. Aquaporin-4 Cell-Surface Expression and Turnover Are Regulated by Dystroglycan, Dynamin, and the Extracellular Matrix in Astrocytes. PLoS One. 11 (10), 0165439 (2016).
