Bestimmung der Zelloberflächenexpression und der endozytischen Rate von Proteinen in primären Astrozytenkulturen unter Verwendung von Biotinylierung
Summary
Zwei biotinylierungsbasierte Verfahren zur Bestimmung der Zelloberflächenexpression und der endozytischen Rate von Proteinen, die an der Plasmamembran exprimiert werden, sind in diesem Bericht dargestellt.
Abstract
Zelloberflächenproteine vermitteln eine Vielzahl von Funktionen. In vielen Fällen wird ihre Aktivität durch endozytische Prozesse reguliert, die ihre Niveaus an der Plasmamembran modulieren. Hier stellen wir detaillierte Protokolle für 2 Methoden vor, die das Studium solcher Prozesse erleichtern, die beide auf dem Prinzip der Biotinylierung von Zelloberflächenproteinen basieren. Die erste ist so konzipiert, dass sie die semi-quantitative Bestimmung der relativen Ebenen eines bestimmten Proteins an der Zelloberfläche ermöglicht. In ihr werden die Lysinreste der Plasmamembranproteine der Zellen zunächst mit einer Biotineinheit markiert. Sobald die Zellen lysiert sind, können diese Proteine dann spezifisch durch die Verwendung von Agarose-immobilisiertem Streptavidin ausgefällt werden, indem sie die natürliche Affinität der letzteren für Biotin ausnutzen. Die so isolierten Proteine können dann über einen Standard-Western-Blotting-Ansatz analysiert werden. Die zweite Methode liefert ein Mittel zur Bestimmung der endozytischen Rate einer PartikelAr Zell-Oberfläche Ziel über einen Zeitraum von Zeit. Zelloberflächenproteine werden zuerst mit einem Biotinderivat modifiziert, das eine spaltbare Disulfidbindung enthält. Die Zellen werden dann wieder auf normale Kulturbedingungen verschoben, was die endozytische Aufnahme eines Anteils an biotinylierten Proteinen bewirkt. Als nächstes werden die Disulfidbindungen von nicht internalisierten Biotin-Gruppen unter Verwendung des membranundurchlässigen Reduktionsmittels Glutathion reduziert. Über diesen Ansatz können damit endozytierte Proteine mit hohem Spezifitätsgrad isoliert und quantifiziert werden.
Introduction
Proteine an der Zelloberfläche spielen eine Vielzahl von Rollen, die zentral für die Aufrechterhaltung der Zellfunktion sind. In zahlreichen Fällen ist ihre Aktivität von endozytischen Prozessen abhängig oder moduliert, die sie entweder vorübergehend in intrazellulären Stellen sequestrieren oder sie auf abgebrochene Wege 1 , 2 , 3 , 4 , 5 richten. Hier heben wir 2 Biotinylierungs-basierte Ansätze hervor, die es dem Anwender ermöglichen, die an der Plasmamembran ausgedrückten Proteine spezifisch zu markieren und zu isolieren, und diejenigen, die neu verinnerlicht sind. Über diese Methoden kann die Zelloberflächenexpression und die endozytische Rate eines beliebigen Proteins von Interesse quantifiziert werden, so dass eine klarere Beurteilung seiner Regulation erreicht werden kann.
Bestimmung der relativen Zelloberflächen-Proteinexpression durch Biotinylierung
Biotin oder Vitamin B7, früher bekannt als Vitamin H 6 , ist ein kleines wasserlösliches Molekül, das zur chemischen Modifizierung von reaktiven Amin-, Sulfhydryl- und Carboxylgruppen biologischer Moleküle verwendet werden kann. Die gegenwärtige Ernte von Zelloberflächen-Biotinylierungsreagenzien besteht hauptsächlich aus membranimpermenden sulfonierten N-Hydroxysuccinimid (Sulfo-NHS) -estern von Biotin oder seinen Derivaten, die so konstruiert sind, dass sie mit den Aminen reagieren, die an den Seitenketten von Lysinresten von Proteinen, die in Die Zelloberfläche, wenn diese unter basischen Bedingungen deprotoniert werden, was dazu führt, dass letztere eine Amidbindung mit dem Biotinrest 7 bildet . So können modifizierte, Zelloberflächenproteine dann über die Verwendung von Avidin, einem 66 – 69 kDa tetrameren Protein, das eine große Affinität für Biotin besitzt, isoliert werden, wobei die Bindung an diese mit einer Dissoziationskonstante von etwa 10 & supmin; & sup5; & supmin; & sup5; Stärkste nichtkovalente Wechselwirkungen bekannt 8 </suP> , 9
Eine Reihe von alternativen Verfahren zur Quantifizierung der Proteinexpression an der Zelloberfläche wurden in früheren Studien verwendet. Die Etikettierung von nichtpermeabilisierten Zellen unter Verwendung von fluoreszenzmarkierten Antikörpern, die für das interessierende Protein spezifisch sind, gefolgt von der Visualisierung über Fluoreszenzmikroskopie, ist zum Beispiel ein allgemein angewandter Ansatz, ist aber stark abhängig von der Verfügbarkeit von Antikörpern, die an extrazelluläre Epitope binden können. In jüngerer Zeit wurden auch Verfahren, die die Verwendung von chimären Proteinen mit pH-empfindlichen Fluorophoren einschließen, die auf saures Medium ausgesetzt sind, erfolgreich eingesetzt worden 10 . Jedoch beinhalten solche Assays gewöhnlich die exogene Expression dieser Konstrukte in Zelllinien, in denen das Protein von Interesse nicht nativ gefunden wird. Diese Ansätze sind dennoch in der Lage, wertvolle Informationen über die subzelluläre Lokalisierung und exozytische Route derZiel-Protein und sollte daher in Verbindung mit den hier beschriebenen biotinylierungsbasierten Ansätzen verwendet werden, wenn die Werkzeuge verfügbar sind.
In einem typischen Biotinylierungsassay werden die Zellen zunächst gründlich in 4 ° C PBS gewaschen. Dadurch werden Spuren von Serumproteinen, die durch das Kulturmedium eingeführt werden, entfernt, wodurch sichergestellt wird, dass diese im nächsten Schritt keine überschüssigen Mengen an Biotin verbrauchen werden. Noch wichtiger ist, dass die Verringerung der Temperatur die Endozytose deutlich verlangsamt. Das Biotinylierungsreagenz wird dann zugegeben. Als nächstes werden die Zellen wieder gewaschen und dann mit einem Quenchpuffer, der entweder Glycin oder NH & sub4; Cl enthält, inkubiert, wobei der Zweck darin besteht, alle verbleibenden Spuren von nicht umgesetztem Biotin zu inaktivieren. Die Zellen werden dann lysiert, wonach Agarose-immobilisiertes Streptavidin zugegeben wird, um die biotinylierten Proteine auszufällen. Die Analyse wird üblicherweise über Western-Blotting durchgeführt, was die relative Zelloberflächen-Expression verschiedener pr ermöglichtOteins zu quantifizieren.
Aufgrund der Basis dieses Assays eignet es sich nur für die Verwendung von Proteinen, die Teile aufweisen, die der extrazellulären Umgebung ausgesetzt sind. Multipass-Transmembranproteine, die wahrscheinlich eine Anzahl reaktiver Lysine innerhalb ihrer Schleifenregionen besitzen, sind für diese Methode am geeignetsten, während Single-Pass-Proteine dazu neigen, weniger anfällig für biotinyliert zu sein. Auch in diesen Fällen besteht die Möglichkeit, dass Konformationsänderungen oder intermolekulare Wechselwirkungen bestimmte reaktive Stellen verschließen können, was zu einer niedrigeren als erwarteten Biotinylierungsausbeute führt.
Bestimmung der Internalisierungsrate von Zelloberflächenproteinen durch Biotinylierung
Die Prinzipien dieses Assays ähneln weitgehend denen der Zelloberflächen-Biotinylierung mit einer Anzahl von Ausnahmen, wobei die wichtigste davon die Verwendung von reversiblen Biotinylierungsreagenzien ist. Die Biotin-Gruppen (davon) besitzen disuLfide Bindungen, in ihren Strukturen, die anfällig für Reduktionsmittel sind; Dies wird ausgenutzt, um sicherzustellen, dass nur Zelloberflächenproteine, die während der Testphase in intrazelluläre Stellen aufgenommen wurden, biotinyliert bleiben. Ein Assay findet in der Regel auf folgende Weise statt. Die Zellen werden zuerst gewaschen und mit kalten Reagenzien biotinyliert, dann wird das Zellkulturmedium bei 37 ° C wieder eingeführt und die Zellen werden in den Inkubator zurückgeführt; Dies bewirkt, dass die markierten Zelloberflächenproteine einer Endozytose unterliegen. Das Reduktionsmittel Glutathion, das die Membran nicht durchdringen kann, wird dann zugegeben, um die Disulfidbindungen der Biotinreste zu brechen, die an Proteinen gebunden sind, die auf der Zelloberfläche verbleiben. Schließlich werden die gebrochenen Disulfidbindungen mit Iodacetamid umgesetzt, wobei die labilen Thiolgruppen verbraucht werden und die Bindungen daran gehindert werden, sich zu reformieren. Wie zuvor werden die Zellen dann lysiert und die markierten Proteine werden unter Verwendung von Streptavidin-Agarose ausgefällt.
Die BeschränkungsscheibeIm vorangegangenen Abschnitt gelten auch hier wegen der Ähnlichkeiten, die zwischen den Methoden geteilt werden. Darüber hinaus lohnt es sich zu bedenken, dass die an diesem Assay beteiligten Temperaturverschiebungen die genaue Bestimmung verhindern, wieviel Protein für jedes Zeitintervall endozytiert wird, insbesondere bei schnell verinnerlichten oder schnell recyclierenden Proteinen. Der Assay liefert daher nur eine semiquantitative Schätzung der endozytischen Raten. Total interne Reflexions-Fluoreszenzmikroskopie kann verwendet werden, um die Aufnahme jedes geladenen Vesikels zu verfolgen und eine genauere Messung der Kinetik der Endozytose zu liefern. Es kann daher eine sehr nützliche Ergänzung zu diesem Assay liefern, vorausgesetzt, dass ein fluoreszenzmarkiertes chimäres Konstrukt des Proteins von Interesse verfügbar ist 11 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Änderungen:
Da diese Verfahren für die Verwendung mit adhärenten Zellen entworfen wurden, haben wir die Verwendung von PBS mit 100 mg / l MgCl 2 ∙ 6H 2 O und angegeben
100 mg / l CaCl 2 (CM-PBS) für die Waschschritte und als Basis von bestimmten Puffern, um sicherzustellen, dass die Zellen an der Kulturoberfläche gebunden bleiben und dass Zell-Zell-Übergänge nicht unterbrochen werden. Jedoch können die Protokolle auch auf nic…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dieses Projekt wurde vom kanadischen Institut für Gesundheitsforschung PG # 20R47867 unterstützt.
Materials
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Fisher Scientific | A661-500 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9647-50 | |
| Bromophenol blue | Bio-Rad | #1610404 | |
| cOmplete protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| Disodium ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA) | Bio-Rad | #1610729 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | #1610611 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 11960-044 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Fisher Scientific | #21335 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotin | Thermo Fisher Scientific | #21331 | |
| Fetal bovine serum | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Iodoacetamide | Bio-Rad | #163-2109 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma-Aldrich | L2020 | Thaw on ice. |
| L-glutamine | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
| Mouse monoclonal anti-β-actin antibody (AC-15) | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| Mouse monoclonal anti-β-dystroglycan antibody (43DAG1/8D5) | Leica Biosystems | B-DG-CE | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 715-035-150 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-045 | |
| Phosphate buffer saline | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Reduced glutathione | Sigma-Aldrich | G6529 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 862010 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318-100 | |
| Streptavidin agarose resin | Thermo Fisher Scientific | #20347 | |
| Rabbit polyclonal anti-AQP4 antibody | Alomone | AQP-004 | |
| Tris base (Trizma base) | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-1 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 |
References
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