Bepaling van de expressie van de celoppervlakte en de endocytische snelheid van eiwitten in primaire astrocytekulturen met behulp van biotinylering
Summary
Twee biotinylatie-gebaseerde methoden, ontworpen voor het bepalen van de expressie van de celoppervlak en de endocytische snelheid van eiwitten uitgedrukt in het plasmamembraan, worden in dit rapport weergegeven.
Abstract
Cell-oppervlakte eiwitten bemiddelen een breed scala aan functies. In veel gevallen wordt hun activiteit gereguleerd door endocytische processen die hun niveaus op het plasmamembraan moduleren. Hier presenteren we gedetailleerde protocollen voor 2 methoden die de studie van dergelijke processen vergemakkelijken, die beide gebaseerd zijn op het principe van biotinylering van celoppervlakte-eiwitten. De eerste is ontworpen om de semi-kwantitatieve bepaling van de relatieve niveaus van een bepaald eiwit op het celoppervlak toe te staan. Daarin worden de lysine residuen van de plasmamembraan eiwitten van cellen eerst gemerkt met een biotine groep. Zodra de cellen zijn gelicht, kunnen deze eiwitten dan specifiek worden geprecipiteerd via het gebruik van agarose-geïmmobiliseerde streptavidine door de natuurlijke affiniteit van deze laatste voor biotine te exploiteren. De op dergelijke wijze geïsoleerde eiwitten kunnen dan worden geanalyseerd via een standaard western blotting benadering. De tweede methode verschaft een middel om de endocytische snelheid van een deeltje te bepalenHet doel van het celoppervlak over een periode van tijd. Cell-oppervlakte eiwitten worden eerst gemodificeerd met een biotin derivaat dat een splitsbare disulfide binding bevat. De cellen worden dan teruggeschoven naar normale kweekomstandigheden, waardoor de endocytische opname van een aandeel biotinyleerde eiwitten wordt veroorzaakt. Vervolgens worden de disulfidebindingen van niet-geïnternaliseerde biotine groepen verminderd met gebruikmaking van het membraan-impermeabele reductiemiddel glutathion. Via deze aanpak kunnen geëntocytoseerde eiwitten worden geïsoleerd en gekwantificeerd met een hoge mate van specificiteit.
Introduction
Proteïnen op het celoppervlak spelen een verscheidenheid aan rollen die centraal zijn om de celfunctie te behouden. In talrijke gevallen is hun activiteit afhankelijk van of gemoduleerd door endocytische processen die hen tijdelijk in intracellulaire plaatsen sequesteren, of die hen leiden tot afbrekende wegen 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . Hier worden 2 biotinylatiegebaseerde benaderingen benadrukt die zijn ontworpen om de gebruiker in staat te stellen specifiek te taggen en isoleren van eiwitten die uitgedrukt zijn in het plasmamembraan, en die recent geïnternaliseerd. Via deze methoden kan de celoppervlak expressie en endocytische snelheid van elk eiwit van belang worden gekwantificeerd, waardoor een duidelijkere beoordeling van de regulering ervan kan worden bereikt.
Bepalen van relatieve celoppervlakte eiwit expressie door biotinylatie
Biotine, of vitamine B7, voorheen bekend als vitamine H6, is een klein wateroplosbaar molecuul dat kan worden gebruikt om reactieve amine-, sulfhydryl- en carboxylgroepen biologische moleculen chemisch te wijzigen. Het huidige gewas biotinyleringsreagens van celoppervlak bestaat hoofdzakelijk uit membraan-impermeante gesulfoneerde N-hydroxysuccinimide (sulfo-NHS) esters van biotine of derivaten daarvan, die zijn ontworpen om te reageren met de aanwezige aminen aan de zijketens van lysine residuen van eiwitten uitgedrukt in Het celoppervlak wanneer deze worden gedeprotoneerd onder basisomstandigheden, waardoor de laatste een amidebinding met het biotine-gedeelte 7 vormt . Zodoende gemodificeerde celoppervlakte-eiwitten kunnen dan worden geïsoleerd via het gebruik van avidin, een 66-69 kDa tetramerisch eiwit dat grote affiniteit voor biotine bezit, die bindt aan de laatste met een dissociatieconstante van ongeveer 10-15, het markeren als een van de Sterkste niet-covalente interacties bekend 8 </suP> , 9 .
Een aantal alternatieve methoden voor het kwantificeren van eiwituitdrukking bij het celoppervlak zijn in eerdere studies gebruikt. De etikettering van niet-gemanimaliseerde cellen die gebruik maken van fluorescent gemerkte antilichamen die specifiek zijn voor het eiwit van belang, gevolgd door visualisatie via fluorescentiemicroscopie, is bijvoorbeeld een veelgebruikte aanpak, maar is sterk afhankelijk van de beschikbaarheid van antilichamen die kunnen binden aan extracellulaire epitopen. Meer recentelijk zijn ook methoden die het gebruik van chimere eiwitten met pH-gevoelige fluoroforen bevatten die reageren op blootstelling aan zure media 10 toegepast. Echter, dergelijke assays betreffen gewoonlijk de exogene expressie van deze constructen in cellijnen waarin het eiwit van belang niet natief gevonden wordt. Deze benaderingen zijn niettemin in staat om waardevolle informatie te verstrekken over de subcellulaire lokalisatie en exocytische route van deDoelwit eiwit, en moet daarom worden gebruikt in combinatie met de biotinylatie-gebaseerde benaderingen die hier worden beschreven als de gereedschappen beschikbaar zijn.
Bij een typische biotinyleringsassay worden de cellen eerst grondig gewassen in 4 ° C PBS. Dit verwijdert eventuele sporen van serumproteïnen die door het kweekmedium worden geïntroduceerd, waardoor men ervoor zorgt dat deze niet in de volgende stap overmatige hoeveelheden biotine zullen verbruiken. Belangrijker nog, de vermindering van de temperatuur veroorzaakt endocytose om aanzienlijk te vertragen. Het biotinyleringsreagens wordt vervolgens toegevoegd. Vervolgens worden de cellen opnieuw gewassen en vervolgens geïncubeerd met een blusbuffer die glycine of NH4Cl bevat, die alle resterende sporen van niet gereageerd biotine inactivert. De cellen worden vervolgens gelicht, waarna agarose-geïmmobiliseerde streptavidine wordt toegevoegd om de biotinyleerde eiwitten te precipiteren. Analyse wordt gewoonlijk uitgevoerd via western blotting, waardoor de relatieve celoppervlak expressie van verschillende prOteins worden gekwantificeerd.
Door de basis van deze analyse is het alleen geschikt voor gebruik met eiwitten die porties hebben blootgesteld aan de extracellulaire omgeving. Multipass transmembrane eiwitten, die waarschijnlijk een aantal reactieve lysinen bezitten binnen hun lusregio's, zijn de meest vatbaar voor deze methode, terwijl enkel-pass eiwitten minder gevoelig zijn voor biotinyleerde. Zelfs in deze gevallen blijft er een mogelijkheid dat conformatieve veranderingen of intermoleculaire interacties bepaalde reactieve plaatsen kunnen afsluiten, wat resulteert in een lager dan verwachte biotinylatieopbrengst.
Bepalen van de internaliseringssnelheid van celoppervlakte-eiwitten door biotinylering
De principes van deze analyse zijn grotendeels vergelijkbaar met die van de celoppervlakbiotinylatie, met een aantal uitzonderingen, waarvan het belangrijkste het gebruik is van omkeerbare biotinyleringsreagentia. De biotine groepen (van deze) bezitten disuLfide bindingen, in hun structuren die gevoelig zijn voor reductiemiddelen; Dit wordt geëxploiteerd om ervoor te zorgen dat alleen celoppervlakte-eiwitten die in intracellulaire plaatsen worden genomen gedurende de testperiode biotinyleren zullen worden gelaten. Een assay vindt over het algemeen plaats op de volgende wijze. De cellen worden eerst gewassen en biotinyleerd met koude reagentia, vervolgens wordt celcultuurmedium bij 37 ° C opnieuw geïntroduceerd en worden de cellen teruggebracht naar de incubator; Dit zorgt ervoor dat de gelabelde celoppervlakte-eiwitten endocytose ondergaan. Het reductiemiddel glutathion – dat het membraan niet kan binnendringen – wordt vervolgens toegevoegd om de disulfidebindingen van de biotine-delen te verbreken die zijn gehecht aan eiwitten die overblijven op het celoppervlak. Tenslotte worden de gebroken disulfidebindingen gereageerd met iodoacetamide, waarbij de labiele thiolgroepen worden verbruikt en de bindingen voorkomen worden van hervorming. Zoals eerder worden de cellen gelyseerd en worden de gelabelde eiwitten neergeslagen met behulp van streptavidine-agarose.
De beperkingen schijfToegepast in het vorige gedeelte, gelden hier ook als gevolg van de overeenkomsten die tussen de methoden worden gedeeld. Bovendien is het de moeite waard in gedachten te houden dat de temperatuurverschuivingen die bij deze analyse betrokken zijn, de precieze bepaling van hoeveel eiwit voor elke tijdsvermindering endocytose verloopt, in het bijzonder bij snel geïnternaliseerde of snel recycle eiwitten voorkomt. De analyse verschaft daarom alleen een semiquantitatieve schatting van endocytische percentages. Totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie kan gebruikt worden om de opname van elke geladen vesikel op te sporen en een nauwkeuriger meting van de kinetiek van endocytose te geven. Het kan derhalve een zeer nuttige aanvulling op deze bepaling verschaffen, ervan uitgaande dat een fluorescerend gemerkte chimere construct van het geïnde eiwit 11 beschikbaar is.
Protocol
Representative Results
Discussion
wijzigingen:
Aangezien deze methoden zijn ontworpen voor gebruik met hechtende cellen, hebben we het gebruik van PBS die 100 mg / L MgCl 2 × 6H 2 O bevat en
100 mg / l CaCl2 (CM-PBS) voor de wasstappen en als basis van bepaalde buffers om ervoor te zorgen dat de cellen vast blijven aan het kweekoppervlak en dat celcelverbindingen niet verstoord raken. De protocollen kunnen echter ook toegepast worden op niet-adherente celtypes als de cellen tuss…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit project werd ondersteund door het Canadese Instituut voor Gezondheidsonderzoek PG # 20R47867.
Materials
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Fisher Scientific | A661-500 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9647-50 | |
| Bromophenol blue | Bio-Rad | #1610404 | |
| cOmplete protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| Disodium ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA) | Bio-Rad | #1610729 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | #1610611 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 11960-044 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Fisher Scientific | #21335 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotin | Thermo Fisher Scientific | #21331 | |
| Fetal bovine serum | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Iodoacetamide | Bio-Rad | #163-2109 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma-Aldrich | L2020 | Thaw on ice. |
| L-glutamine | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
| Mouse monoclonal anti-β-actin antibody (AC-15) | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| Mouse monoclonal anti-β-dystroglycan antibody (43DAG1/8D5) | Leica Biosystems | B-DG-CE | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 715-035-150 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-045 | |
| Phosphate buffer saline | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Reduced glutathione | Sigma-Aldrich | G6529 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 862010 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318-100 | |
| Streptavidin agarose resin | Thermo Fisher Scientific | #20347 | |
| Rabbit polyclonal anti-AQP4 antibody | Alomone | AQP-004 | |
| Tris base (Trizma base) | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-1 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 |
References
- Baskin, G., Schenker, S., Frosto, T., Henderson, G. Transforming growth factor beta 1 inhibits epidermal growth factor receptor endocytosis and down-regulation in cultured fetal rat hepatocytes. J Biol Chem. 266 (20), 13238-13242 (1991).
- Hazum, E., Cuatrecasas, P., Marian, J., Conn, P. M. Receptor-mediated internalization of fluorescent gonadotropin-releasing hormone by pituitary gonadotropes. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (11), 6692-6695 (1980).
- Hemmaplardh, D., Morgan, E. H. Transferrin uptake and release by reticulocytes treated with proteolytic enzymes and neuraminidase. Biochim Biophys Acta. 426 (3), 385-398 (1976).
- Katsura, T., et al. Constitutive and regulated membrane expression of aquaporin 1 and aquaporin 2 water channels in stably transfected LLC-PK1 epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (16), 7212-7216 (1995).
- Li, Y., Cam, J., Bu, G. Low-density lipoprotein receptor family: endocytosis and signal transduction. Mol Neurobiol. 23 (1), 53-67 (2001).
- Gyorgy, P., Melville, D. B., Burk, D., Du Vigneaud, V. The possible identity of vitamin H with biotin and coenzyme R. Science. 91 (2358), 243-245 (1940).
- Cole, S. R., Ashman, L. K., Ey, P. L. Biotinylation: an alternative to radioiodination for the identification of cell surface antigens in immunoprecipitates. Mol Immunol. 24 (7), 699-705 (1987).
- Green, N. M. Avidin 1. the use of [14-C]biotin for kinetic studies and for assay. Biochem J. 89 (3), 585-591 (1963).
- Korpela, J. Avidin, a high affinity biotin-binding protein, as a tool and subject of biological research. Med Biol. 62 (1), 5-26 (1984).
- Li, Y., et al. Imaging pHluorin-tagged receptor insertion to the plasma membrane in primary cultured mouse neurons. J Vis Exp. (69), e4450 (2012).
- Soohoo, A. L., Bowersox, S. L., Puthenveedu, M. A. Visualizing clathrin-mediated endocytosis of G protein-coupled receptors at single-event resolution via TIRF microscopy. J Vis Exp. (92), e51805 (2014).
- Noel, G., Tham, D. K., Moukhles, H. Interdependence of laminin-mediated clustering of lipid rafts and the dystrophin complex in astrocytes. J Biol Chem. 284 (29), 19694-19704 (2009).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Madrid, R., et al. Polarized trafficking and surface expression of the AQP4 water channel are coordinated by serial and regulated interactions with different clathrin-adaptor complexes. EMBO J. 20 (24), 7008-7021 (2001).
- Tham, D. K., Joshi, B., Moukhles, H. Aquaporin-4 Cell-Surface Expression and Turnover Are Regulated by Dystroglycan, Dynamin, and the Extracellular Matrix in Astrocytes. PLoS One. 11 (10), 0165439 (2016).
