קביעת הביטוי משטח תאים ושיעור אנדוציטי של חלבונים בתרבויות אסטרוציטיות ראשוניות באמצעות Biotinylation
Summary
שתי שיטות biotinylation מבוססות, שנועדו לקביעת ביטוי פני התא ואת שיעור endocytic של חלבונים לידי ביטוי בקרום פלזמה, מוצגים בדוח זה.
Abstract
חלבונים של תאים סלולריים מתווכים מגוון רחב של פונקציות. במקרים רבים, פעילותם מוסדרת על ידי תהליכים אנדוציטיים המווסתים את רמותיהם בקרום הפלזמה. כאן, אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים עבור 2 שיטות להקל על המחקר של תהליכים כאלה, אשר שניהם מבוססים על העיקרון של biotinylation של חלבונים משטח התא. הראשון נועד לאפשר את קביעת חצי כמותי של רמות היחסי של חלבון מסוים על פני התא. בתוך זה, שאריות ליזין של חלבונים קרום פלזמה של תאים מסומנים הראשון עם מחלת ביוטין. לאחר התאים lysed, חלבונים אלה עשויים להיות זירז במיוחד באמצעות שימוש agreose- משותקת streptavidin על ידי ניצול הזיקה הטבעית של האחרון עבור ביוטין. החלבונים מבודדים בצורה כזו ניתן לאחר מכן ניתח באמצעות גישה סופנית המערבי סופג. השיטה השנייה מספקת אמצעי לקביעת קצב אנדוציטי של חלקיקהמטרה של פני השטח על פני תקופה של זמן. תאים חלבונים פנימיים הם שונו לראשונה עם נגזרות ביוטין המכיל קשר disculfide חדה. התאים מועברים בחזרה לתנאי התרבות הרגילים, מה שגורם ספיגה endocytic של חלק של חלבונים biotinylated. לאחר מכן, את הקשרים דיסולפיד של קבוצות ביוטין שאינם מופחתים מופחתים באמצעות קרום בלתי חדיר צמצום גלוטתיון סוכן. באמצעות גישה זו, חלבונים endocytosed ולכן יכול להיות מבודד לכמת עם רמה גבוהה של ספציפיות.
Introduction
חלבונים על פני התא לשחק מגוון של תפקידים מרכזי לשמירה על תפקוד התא. במקרים רבים הפעילות שלהם תלויה, או מאופיינת על ידי תהליכים אנדוציטיים, כי גם לרשום אותם באופן זמני באתרים תאיים, או לכוון אותם כלפי מסלולים השפלה 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . כאן, אנו מדגישים 2 biotinylation מבוסס גישות שנועדו לאפשר למשתמש לתייג באופן ספציפי לבודד חלבונים לידי ביטוי על קרום פלזמה, ואלו החדשה הופנמו. באמצעות שיטות אלה, את פני השטח של התא ואת שיעור endocytic של כל חלבון של עניין ניתן לכמת, ובכך מאפשר הערכה ברורה של הרגולציה שלה להיות מושגת.
קביעת יחסית תא פני השטח חלבון הביטוי על ידי biotinylation
ביוטין, או ויטמין B7, המכונה בעבר ויטמין H 6 , הוא מולקולה מסיס מים קטן שניתן להשתמש בהם כדי לשנות כימית אמינים, sulfhydryl, קבוצות carboxyl של מולקולות ביולוגיות. היבול הנוכחי של ריאגנטים biotinylation פני השטח של התא מורכב בעיקר של קרום nul hydroxysuccinimide (sulfo-NHS) אסטרונומים של ביוטין או נגזרות שלה, שנועד להגיב עם אמינים נוכח על שרשראות הצד של ליסין שאריות של חלבונים לידי ביטוי ב את משטח התא כאשר אלה הופכים deprotonated בתנאים בסיסיים, וכתוצאה מכך האחרון להרכיב קשר amide עם מחלת ביוטין 7 . כך, למשל, חלבונים של תאי-תאים עשויים להיות מבודדים באמצעות שימוש ב- avidin, חלבון tetrameric של 66 – 69 kDa בעל זיקה רבה לביוטין, המחייב את השני עם קבוע דיסוציאציה של כ -15-15 , מסמן אותו כאחד אינטראקציות noncovalent החזק ביותר הידוע 8 </suP> , 9 .
מספר שיטות חלופיות לכימות ביטוי חלבון על פני התא שימשו מחקרים קודמים. תיוג של תאים unpermeabilized באמצעות נוגדנים מתויגים fluorescently ספציפי לחלבון של עניין, ואחריו ויזואליזציה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, למשל, היא גישה נפוץ, אבל הוא מסתמך במידה רבה על הזמינות של נוגדנים שיכולים להיקשר epitopes תאיים. לאחרונה, שיטות המעורבות בשימוש חלבונים chimeric הנושאת fluorophores רגישים ל- pH המגיבים לחשיפה לחומרי חומצה, הועסקו בהצלחה גם 10 . עם זאת, מבחני כזה בדרך כלל כרוך הביטוי אקסוגני של מבנים אלה בקווים התא שבו החלבון של עניין לא נמצא באופן מקורי. גישות אלה בכל זאת מסוגלים לספק מידע בעל ערך לגבי לוקליזציה תת-תאית ומסע exocytic שלחלבון היעד, ולכן יש להשתמש בשילוב עם גישות biotinylation מבוסס המתואר כאן אם הכלים זמינים.
ב assay biotinylation טיפוסי, התאים נשטפים תחילה ביסודיות 4 מעלות צלזיוס PBS. זה מסיר כל עקבות של חלבונים בסרום הציג על ידי המדיום התרבות, ובכך להבטיח כי אלה לא יצרוך כמויות עודפות של ביוטין בשלב הבא. חשוב יותר, הירידה בטמפרטורה גורמת לאנדוציטוזה להאט משמעותית. מגיב biotinylation לאחר מכן הוסיף. לאחר מכן, התאים נשטפים שוב, ולאחר מכן מודגרות עם חיץ מרווה המכיל גם גליצין או NH 4 Cl, המטרה של אשר היא להשבית את כל עקבות הנותרים של ביוטין בלתי ממומש. התאים הם lysed אז, בעקבות אשר agarose- משותק streptavidin נוסף כדי להאיץ את החלבונים biotinylated. ניתוח מבוצע בדרך כלל באמצעות סופג המערבי, ומאפשר את פני השטח של תא יחסית של יחסי ציבור שוניםOutins להיות לכמת.
בשל הבסיס של assay זה, הוא מתאים לשימוש רק עם חלבונים בעלי חלקים חשופים הסביבה תאיים. מולטיפאס טרנסממברני חלבונים, אשר סביר להניח שיש מספר lysines תגובתי בתוך אזורי לולאה שלהם, הם המתאימים ביותר לשיטה זו, ואילו חלבונים לעבור יחיד נוטים להיות רגישים פחות להיות biotinylated. אפילו במקרים אלה, נותרה אפשרות ששינויים קונפורמטיביים או אינטראקציות בין-מולקולאריות עשויים לחסום אתרים תגובתיים מסוימים, וכתוצאה מכך תשואה ביוטילינאצית נמוכה מהצפוי.
קביעת שיעור ההפנמה של חלבונים משטח התא על ידי biotinylation
העקרונות של assay זה דומים במידה רבה לאלה של biotinylation בתא השטח, עם מספר חריגים, החשוב שבהם הוא השימוש reagents biotinylation הפיך. קבוצות ביוטין (של אלה) יש disuLfide, בתוך המבנים שלהם, כי הם רגישים לצמצום סוכנים; זה מנוצל על מנת להבטיח כי רק חלבונים משטח התא נלקח לאתרים תאיים במהלך תקופת assay יישאר biotinylated. Assay מתרחשת בדרך כלל באופן הבא. התאים נשטפים הראשון biotinylated עם ריאגנטים קר, ואז בינוני תרבות התא ב 37 ° C הוא מחדש הציג, ואת התאים מוחזרים החממה; זה גורם לתאים שכותרתו חלבונים פני כדי לעבור אנדוציטוזה. הפחתת הסוכר גלוטתיון – אשר לא יכול לחדור את הממברנה – לאחר מכן הוסיף לשבור את הקשרים דיסולפיד של moieties ביוטין המצורפת חלבונים שנותרו על פני התא. לבסוף, קשרים disulfide שבור מגיבים עם iodoacetamide, לצרוך את קבוצות thiol labile ומניעת הקשרים מ רפורמה. כמו קודם, התאים הם lysed אז, ואת החלבונים שכותרתו הם זירז באמצעות streptavidin-agarose.
דיסק המגבלותבסעיף הקודם חל גם כאן בשל הדמיון המשותף בין השיטות. בנוסף, כדאי לזכור כי משמרות הטמפרטורה המעורבים assay זה למנוע את הקביעה המדויקת של כמה חלבון הוא endocytosed עבור כל תוספת של זמן, במיוחד במקרה של במהירות מופנם או במהירות מיחזור חלבונים. Assay ולכן מספק רק הערכה semiquantitative של שיעורי endocytic. סך הכל מיקרוסקופ השתקפות הקרינה הפנימית ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר ספיגה של כל שלפוחית טעון לספק מדידה מדויקת יותר של הקינטיקה של אנדוציטוזה. זה יכול ולכן לספק השלמה מאוד שימושי assay זה, בהנחה כי fluorescently מתויג chimeric לבנות של חלבון של עניין זמין 11 .
Protocol
Representative Results
Discussion
שינויים:
כמו שיטות אלה נועדו לשימוש עם תאים חסיד, ציינו את השימוש של PBS המכיל 100 מ"ג / L MgCl 2 ∙ 6H 2 O ו
100 מ"ג / L CaCl 2 (CM-PBS) על מדרגות כביסה כבסיס למאגרים מסוימים, על מנת להבטיח כי התאים להישאר מחוברים למש…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
פרויקט זה נתמך על ידי המכון הקנדי לבריאות מחקר PG # 20R47867.
Materials
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Fisher Scientific | A661-500 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9647-50 | |
| Bromophenol blue | Bio-Rad | #1610404 | |
| cOmplete protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| Disodium ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA) | Bio-Rad | #1610729 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | #1610611 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 11960-044 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Fisher Scientific | #21335 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotin | Thermo Fisher Scientific | #21331 | |
| Fetal bovine serum | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Iodoacetamide | Bio-Rad | #163-2109 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma-Aldrich | L2020 | Thaw on ice. |
| L-glutamine | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
| Mouse monoclonal anti-β-actin antibody (AC-15) | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| Mouse monoclonal anti-β-dystroglycan antibody (43DAG1/8D5) | Leica Biosystems | B-DG-CE | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 715-035-150 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-045 | |
| Phosphate buffer saline | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Reduced glutathione | Sigma-Aldrich | G6529 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 862010 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318-100 | |
| Streptavidin agarose resin | Thermo Fisher Scientific | #20347 | |
| Rabbit polyclonal anti-AQP4 antibody | Alomone | AQP-004 | |
| Tris base (Trizma base) | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-1 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 |
References
- Baskin, G., Schenker, S., Frosto, T., Henderson, G. Transforming growth factor beta 1 inhibits epidermal growth factor receptor endocytosis and down-regulation in cultured fetal rat hepatocytes. J Biol Chem. 266 (20), 13238-13242 (1991).
- Hazum, E., Cuatrecasas, P., Marian, J., Conn, P. M. Receptor-mediated internalization of fluorescent gonadotropin-releasing hormone by pituitary gonadotropes. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (11), 6692-6695 (1980).
- Hemmaplardh, D., Morgan, E. H. Transferrin uptake and release by reticulocytes treated with proteolytic enzymes and neuraminidase. Biochim Biophys Acta. 426 (3), 385-398 (1976).
- Katsura, T., et al. Constitutive and regulated membrane expression of aquaporin 1 and aquaporin 2 water channels in stably transfected LLC-PK1 epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (16), 7212-7216 (1995).
- Li, Y., Cam, J., Bu, G. Low-density lipoprotein receptor family: endocytosis and signal transduction. Mol Neurobiol. 23 (1), 53-67 (2001).
- Gyorgy, P., Melville, D. B., Burk, D., Du Vigneaud, V. The possible identity of vitamin H with biotin and coenzyme R. Science. 91 (2358), 243-245 (1940).
- Cole, S. R., Ashman, L. K., Ey, P. L. Biotinylation: an alternative to radioiodination for the identification of cell surface antigens in immunoprecipitates. Mol Immunol. 24 (7), 699-705 (1987).
- Green, N. M. Avidin 1. the use of [14-C]biotin for kinetic studies and for assay. Biochem J. 89 (3), 585-591 (1963).
- Korpela, J. Avidin, a high affinity biotin-binding protein, as a tool and subject of biological research. Med Biol. 62 (1), 5-26 (1984).
- Li, Y., et al. Imaging pHluorin-tagged receptor insertion to the plasma membrane in primary cultured mouse neurons. J Vis Exp. (69), e4450 (2012).
- Soohoo, A. L., Bowersox, S. L., Puthenveedu, M. A. Visualizing clathrin-mediated endocytosis of G protein-coupled receptors at single-event resolution via TIRF microscopy. J Vis Exp. (92), e51805 (2014).
- Noel, G., Tham, D. K., Moukhles, H. Interdependence of laminin-mediated clustering of lipid rafts and the dystrophin complex in astrocytes. J Biol Chem. 284 (29), 19694-19704 (2009).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Madrid, R., et al. Polarized trafficking and surface expression of the AQP4 water channel are coordinated by serial and regulated interactions with different clathrin-adaptor complexes. EMBO J. 20 (24), 7008-7021 (2001).
- Tham, D. K., Joshi, B., Moukhles, H. Aquaporin-4 Cell-Surface Expression and Turnover Are Regulated by Dystroglycan, Dynamin, and the Extracellular Matrix in Astrocytes. PLoS One. 11 (10), 0165439 (2016).
