Bestämning av cellytans uttryck och endocytisk hastighet för proteiner i primära astrocytkulturer med användning av biotinylering
Summary
Två biotinyleringsbaserade metoder, utformade för bestämning av cellytans uttryck och endocytiska hastighet av proteiner uttryckta i plasmamembranet presenteras i denna rapport.
Abstract
Cell-ytproteiner förmedlar ett brett spektrum av funktioner. I många fall regleras deras aktivitet av endocytiska processer som modulerar sina nivåer vid plasmamembranet. Här presenterar vi detaljerade protokoll för 2 metoder som underlättar studier av sådana processer, vilka båda bygger på principen om biotinylering av cellytproteiner. Den första är utformad för att möjliggöra den semikvantitativa bestämningen av de relativa nivåerna av ett visst protein vid cellytan. Därvid märks lysinresterna av plasmamembranproteinerna av celler först med en biotindel. När cellerna lyser, kan dessa proteiner sedan specifikt utfällas via användning av agarosimmobiliserad streptavidin genom att utnyttja den naturliga affiniteten hos den senare för biotin. Proteinerna isolerade på ett sådant sätt kan sedan analyseras via en standard western blotting approach. Den andra metoden tillhandahåller ett sätt att bestämma endocytisk hastighet hos ett partikelAr cell-yta mål över en tidsperiod. Cell-ytproteiner modifieras först med ett biotinderivat innehållande en klyvbar disulfidbindning. Cellerna skiftas därefter tillbaka till normala odlingsbetingelser, vilket orsakar endocytisk upptagning av en andel biotinylerade proteiner. Därefter reduceras disulfidbindningarna hos icke-internaliserade biotingrupper med användning av det membranogenomträngliga reduktionsmedlet glutation. Via detta tillvägagångssätt kan endocyterade proteiner sålunda isoleras och kvantifieras med en hög grad av specificitet.
Introduction
Proteiner vid cellytan spelar en rad roller som är centrala för att upprätthålla cellfunktionen. I många fall är deras aktivitet beroende av eller modulerad av endocytiska processer som antingen temporärt sekvestrerar dem på intracellulära ställen eller som leder dem mot nedbrytningsvägarna 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . Här framhäver vi 2 biotinylationsbaserade tillvägagångssätt som är utformade för att tillåta användaren att specifikt märka och isolera proteiner uttryckta i plasmamembranet och de nyligen internaliserade. Via dessa metoder kan cellytans uttryck och endocytisk hastighet för vilket protein som helst av intresse kvantifieras, så att en tydligare bedömning av dess reglering kan uppnås.
Bestämning av relativ cell-ytproteinuttryck genom biotinylering
Biotin eller vitamin B7, tidigare känt som vitamin H6, är en liten vattenlöslig molekyl som kan användas för att kemiskt modifiera reaktiva amin-, sulfhydryl- och karboxylgrupper av biologiska molekyler. Den aktuella grödan av biotinyleringsreagenser av cellytor består huvudsakligen av membran-impermeant sulfonerade N-hydroxisuccinimidestrar av biotin eller dess derivat, utformade för att reagera med aminerna närvarande på sidokedjorna av lysinrester av proteiner uttryckta i Cellytan när dessa blir deprotonerade under basiska betingelser, vilket resulterar i att de senare bildar ett amidbindning med biotindelen 7 . Således modifierade cell-ytproteiner kan sedan isoleras via användningen av avidin, ett 66-69 kDa tetrameriskt protein som har stor affinitet för biotin, bindande till den senare med en dissociationskonstant av approximativt 10-15 , vilket markerar den som en av de Starkaste icke-kovalenta interaktioner kända 8 </suP> , 9 .
Ett antal alternativa metoder för att kvantifiera proteinuttryck vid cellytan har använts i tidigare studier. Märkningen av opermeabiliserade celler med användning av fluorescensmärkta antikroppar specifika för proteinet av intresse, följt av visualisering via fluorescensmikroskopi, är till exempel ett allmänt använda tillvägagångssätt, men är starkt beroende av tillgängligheten av antikroppar som kan binda till extracellulära epitoper. Mer nyligen har metoder som involverar användningen av chimära proteiner med pH-känsliga fluoroforer som reagerar på att utsättas för sura medier har använts framgångsrikt 10 . Sådana analyser innefattar emellertid vanligen det exogena uttrycket av dessa konstruktioner i cellinjer, i vilka proteinet av intresse inte är nativt hittat. Dessa tillvägagångssätt kan ändå ge värdefull information om subcellulär lokalisering och exocytisk resväg avMålprotein och bör därför användas tillsammans med de biotinyleringsbaserade metoder som beskrivs här om verktygen är tillgängliga.
I en typisk biotinyleringsanalys tvättas cellerna först noggrant i 4 ° C PBS. Detta avlägsnar eventuella spår av serumproteiner som införs av odlingsmediet, vilket säkerställer att dessa inte kommer att förbruka överskott av biotin i nästa steg. Ännu viktigare, reduktionen av temperaturen orsakar endocytos för att decelerera signifikant. Biotinyleringsreagenset tillsättes därefter. Därefter tvättas cellerna igen och inkuberas sedan med en släckningsbuffert innehållande antingen glycin eller NH4Cl, vars syfte är att inaktivera alla återstående spår av oreagerat biotin. Cellerna lyseras därefter, varefter agarosimmobiliserad streptavidin tillsätts för att fälla ut de biotinylerade proteinerna. Analys utförs vanligtvis via western blotting, vilket tillåter det relativa cellytans uttryck av olika prOteiner att kvantifieras.
På grund av grunden för denna analys är den endast lämplig för användning med proteiner som har delar som exponeras för den extracellulära miljön. Multipass-transmembranproteiner, vilka sannolikt har ett antal reaktiva lysiner inom sina slingregioner, är mest mottagliga för denna metod, medan en-pass-proteiner tenderar att vara mindre mottagliga för att biotinyleras. Även i dessa fall finns det kvar en möjlighet att konformationsförändringar eller intermolekylära interaktioner kan utesluta vissa reaktiva ställen, vilket resulterar i ett lägre än förväntat biotinyleringsutbyte.
Bestämning av internaliseringshastigheten för cell-ytproteiner genom biotinylering
Principerna för denna analys är i stor utsträckning liknande de för cellytbiotinylering, med ett antal undantag, varav den viktigaste är användningen av reversibla biotinyleringsreagenser. Biotingrupperna (av dessa) har disuLfidbindningar, inom deras strukturer, som är mottagliga för reduktionsmedel; Detta utnyttjas för att säkerställa att endast cellytproteiner som tas in i intracellulära ställen under analysperioden lämnas biotinylerade. En analys utförs vanligtvis på följande sätt. Cellerna tvättas först och biotinyleras med kalla reagenser, därefter återintroduceras cellodlingsmedium vid 37 ° C och cellerna returneras till inkubatorn; Detta medför att de märkta cell-ytproteinerna genomgår endocytos. Reduktionsmedlet glutation – som inte kan penetrera membranet – tillsättes därefter för att bryta disulfidbindningarna hos biotindelarna fästa vid proteiner kvar på cellytan. Slutligen omsätts de brutna disulfidbindningarna med jodacetamid, förbrukar de labila tiolgrupperna och förhindrar bindningarna från att reformera. Som tidigare lyseras cellerna sedan och de märkta proteinerna utfälles med användning av streptavidin-agaros.
Begränsningarna skivanAnvänds i föregående avsnitt gäller också här på grund av likheterna som delas mellan metoderna. Dessutom är det värt att komma ihåg att temperaturförskjutningarna involverade i denna analys utesluter den exakta bestämningen av hur mycket protein som endocyteras för varje tidstakt, särskilt när det gäller snabbt internaliserade eller snabbt återvinningsproteiner. Analysen ger därför endast en semiquantitativ uppskattning av endocytiska hastigheter. Total intern reflektionsfluorescensmikroskopi kan användas för att spåra upptaget av varje laddad vesikel och ge en mer exakt mätning av kinetiken för endocytos. Det kan därför tillhandahålla ett mycket användbart komplement till denna analys, förutsatt att en fluorescensmärkt taggad chimär konstruktion av proteinet av intresse är tillgängligt 11 .
Protocol
Representative Results
Discussion
ändringar:
Eftersom dessa metoder var konstruerade för användning med vidhäftande celler har vi specificerat användningen av PBS innehållande 100 mg / L MgCl2 · 6H20 och
100 mg / 1 CaCl2 (CM-PBS) för tvättstegen och som bas av vissa buffertar för att säkerställa att cellerna förblir bundna till odlingsytan och att cellcellsförbindelserna inte störs. Protokollen kan emellertid också appliceras på icke-adherenta celltyper om cellerna pelleteras mellan v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta projekt stöddes av Canadian Institute of Health Research PG # 20R47867.
Materials
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Fisher Scientific | A661-500 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9647-50 | |
| Bromophenol blue | Bio-Rad | #1610404 | |
| cOmplete protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| Disodium ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA) | Bio-Rad | #1610729 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | #1610611 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 11960-044 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Fisher Scientific | #21335 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotin | Thermo Fisher Scientific | #21331 | |
| Fetal bovine serum | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Iodoacetamide | Bio-Rad | #163-2109 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma-Aldrich | L2020 | Thaw on ice. |
| L-glutamine | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
| Mouse monoclonal anti-β-actin antibody (AC-15) | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| Mouse monoclonal anti-β-dystroglycan antibody (43DAG1/8D5) | Leica Biosystems | B-DG-CE | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 715-035-150 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-045 | |
| Phosphate buffer saline | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Reduced glutathione | Sigma-Aldrich | G6529 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 862010 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318-100 | |
| Streptavidin agarose resin | Thermo Fisher Scientific | #20347 | |
| Rabbit polyclonal anti-AQP4 antibody | Alomone | AQP-004 | |
| Tris base (Trizma base) | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-1 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 |
References
- Baskin, G., Schenker, S., Frosto, T., Henderson, G. Transforming growth factor beta 1 inhibits epidermal growth factor receptor endocytosis and down-regulation in cultured fetal rat hepatocytes. J Biol Chem. 266 (20), 13238-13242 (1991).
- Hazum, E., Cuatrecasas, P., Marian, J., Conn, P. M. Receptor-mediated internalization of fluorescent gonadotropin-releasing hormone by pituitary gonadotropes. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (11), 6692-6695 (1980).
- Hemmaplardh, D., Morgan, E. H. Transferrin uptake and release by reticulocytes treated with proteolytic enzymes and neuraminidase. Biochim Biophys Acta. 426 (3), 385-398 (1976).
- Katsura, T., et al. Constitutive and regulated membrane expression of aquaporin 1 and aquaporin 2 water channels in stably transfected LLC-PK1 epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (16), 7212-7216 (1995).
- Li, Y., Cam, J., Bu, G. Low-density lipoprotein receptor family: endocytosis and signal transduction. Mol Neurobiol. 23 (1), 53-67 (2001).
- Gyorgy, P., Melville, D. B., Burk, D., Du Vigneaud, V. The possible identity of vitamin H with biotin and coenzyme R. Science. 91 (2358), 243-245 (1940).
- Cole, S. R., Ashman, L. K., Ey, P. L. Biotinylation: an alternative to radioiodination for the identification of cell surface antigens in immunoprecipitates. Mol Immunol. 24 (7), 699-705 (1987).
- Green, N. M. Avidin 1. the use of [14-C]biotin for kinetic studies and for assay. Biochem J. 89 (3), 585-591 (1963).
- Korpela, J. Avidin, a high affinity biotin-binding protein, as a tool and subject of biological research. Med Biol. 62 (1), 5-26 (1984).
- Li, Y., et al. Imaging pHluorin-tagged receptor insertion to the plasma membrane in primary cultured mouse neurons. J Vis Exp. (69), e4450 (2012).
- Soohoo, A. L., Bowersox, S. L., Puthenveedu, M. A. Visualizing clathrin-mediated endocytosis of G protein-coupled receptors at single-event resolution via TIRF microscopy. J Vis Exp. (92), e51805 (2014).
- Noel, G., Tham, D. K., Moukhles, H. Interdependence of laminin-mediated clustering of lipid rafts and the dystrophin complex in astrocytes. J Biol Chem. 284 (29), 19694-19704 (2009).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Madrid, R., et al. Polarized trafficking and surface expression of the AQP4 water channel are coordinated by serial and regulated interactions with different clathrin-adaptor complexes. EMBO J. 20 (24), 7008-7021 (2001).
- Tham, D. K., Joshi, B., Moukhles, H. Aquaporin-4 Cell-Surface Expression and Turnover Are Regulated by Dystroglycan, Dynamin, and the Extracellular Matrix in Astrocytes. PLoS One. 11 (10), 0165439 (2016).
