बायोटिनिलेशन का उपयोग करते हुए प्राइमरी एस्ट्रोसाइट संस्कृतियों में प्रोटीन की कोशिका-सतह अभिव्यक्ति और एन्डोसाइटिक दर निर्धारित करना
Summary
प्लाज्मा झिल्ली पर व्यक्त प्रोटीनों की कोशिका-सतह अभिव्यक्ति और एन्दोयोटीक दर निर्धारित करने के लिए डिज़ाइन किए गए दो बायोटिनिलेशन आधारित विधियों को इस रिपोर्ट में प्रस्तुत किया गया है।
Abstract
कोशिका-सतह प्रोटीन कार्य की एक विस्तृत सरणी में मध्यस्थता करता है। कई मामलों में, उनकी गतिविधि एंडोकैटिक प्रक्रियाओं द्वारा नियंत्रित होती है जो प्लाज्मा झिल्ली पर अपने स्तर को व्यवस्थित करती हैं। यहां, हम ऐसे 2 तरीकों के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो ऐसी प्रक्रियाओं के अध्ययन की सुविधा देते हैं, जो दोनों कोशिका-सतह प्रोटीन के बायोटिनेलिटिंग के सिद्धांत पर आधारित हैं। पहले सेल-सतह पर एक विशेष प्रोटीन के रिश्तेदार स्तरों के अर्द्ध-मात्रात्मक निर्धारण के लिए अनुमति देने के लिए डिज़ाइन किया गया है। इसमें, प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन कोशिकाओं के लाइसिन अवशेषों को पहले बायोटिन आधा भाग के साथ लेबल किया जाता है। एक बार कोशिका लिस्ड हो जाने के बाद, इन प्रोटीन को बायोटिन के बाद के प्राकृतिक आत्मीयता का शोषण करके एगरोज़-अचल सफ़ेदविदिन के उपयोग के द्वारा विशेष रूप से उपजी हो सकता है। ऐसे तरीके से पृथक प्रोटीनों को एक मानक पश्चिमी ब्लोटिंग दृष्टिकोण के माध्यम से विश्लेषण किया जा सकता है। दूसरी विधि एक particul के एंडोसिटिक दर का निर्धारण करने के साधन प्रदान करती हैसमय की अवधि में सेल सतह लक्ष्य। कोशिका-सतह प्रोटीन को पहले बायोटिन व्युत्पन्न के साथ संशोधित किया गया था जिसमें क्लेविएबल डाइस्फ़ाफ़ाइड बॉन्ड होता था। तब कोशिकाओं को फिर से सामान्य संस्कृति की स्थिति में स्थानांतरित कर दिया जाता है, जिससे बायोटिनिलेटेड प्रोटीन के अनुपात में एन्डोसाइटैटिक तेज होता है। इसके बाद, गैर-आंतरीकृत बायोटिन समूहों के डिस्लाफ़ाइड बांड झिल्ली-अभेद्य कम करने वाले एजेंट ग्लुटाथियोन का उपयोग करके कम हो जाते हैं। इस दृष्टिकोण के माध्यम से, एन्डोसाइटेटेड प्रोटीन को पृथक किया जा सकता है और उच्च स्तर की विशिष्टता के साथ मात्रा निर्धारित किया जा सकता है।
Introduction
सेल की सतह पर प्रोटीन कोशिका फ़ंक्शन को बनाए रखने के लिए केंद्रीय रूप से भिन्न भूमिका निभाते हैं। कई उदाहरणों में, उनकी गतिविधि अंतःकाशीय प्रक्रियाओं पर निर्भर करती है, या उनको नियंत्रित करती है जो कि अस्थायी रूप से इंट्रासेल्युलर साइट्स में अलग-थलग कर देते हैं या 1 , 2 , 3 , 4 , 5 की दिशा में दिशा में हैं। यहां, हम 2 बायोटिनिलेशन-आधारित दृष्टिकोण को हाइलाइट करते हैं, जो उपयोगकर्ता को प्लाज्मा झिल्ली पर व्यक्त प्रोटीनों को विशेष रूप से टैग और अलग करने की अनुमति देने के लिए डिज़ाइन किया गया है, इन तरीकों के माध्यम से, किसी भी प्रोटीन की ब्याज की कोशिका-सतह की अभिव्यक्ति और एन्डोकीटिक दर मात्रा निर्धारित की जा सकती है, इस प्रकार इस प्रकार इसकी विनियमन का स्पष्ट आकलन प्राप्त करने की अनुमति मिल सकती है।
Biotinylation द्वारा सापेक्ष सेल-सतह प्रोटीन अभिव्यक्ति का निर्धारण करना
बायोटिन, या विटामिन बी 7, जिसे पहले विटामिन एच 6 कहा जाता है, एक छोटे से पानी घुलनशील अणु है जिसे रासायनिक रूप से प्रतिक्रियाशील अमाइन, सल्फ़हाइड्रील, और जैविक अणुओं के कार्बोक्सील समूह को संशोधित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। कोशिका-सतह बायोटिनिलेशन अभिकर्मकों की वर्तमान फसल में मुख्य रूप से झिल्ली-अवरुद्ध सल्फोनेटेड एन-हाइड्रोक्सिसुकिनिमाइड (सल्फो-एनएचएस) बायोटिन या इसके डेरिवेटिव के एस्टर शामिल होते हैं, जो कि प्रोटीन के लाइसिन अवशेषों के साइड-चेन पर उपस्थित एमी के साथ प्रतिक्रिया करने के लिए डिज़ाइन होते हैं। कोशिका की सतह जब इन्हें मूल स्थितियों के तहत वंचित किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप उत्परिवर्तक बायोटिन मुक्ति 7 के साथ एमेड बांड बनाते हैं। इस प्रकार से संशोधित, कोशिका-सतह प्रोटीन को एविडिन के प्रयोग से अलग किया जा सकता है, एक 66 – 69 केडीए टेट्रामेरिक प्रोटीन जिसे बायोटिन के लिए बहुत अच्छा लगा है, लगभग 10 -15 की असंतुलन स्थिरता के साथ बाध्यकारी है, इसे एक के रूप में चिह्नित करता है सबसे मजबूत noncovalent बातचीत 8 ज्ञात </suP> , 9
पिछले अध्ययनों में कोशिका की सतह पर प्रोटीन की अभिव्यक्ति को मापने के कई वैकल्पिक तरीकों का इस्तेमाल किया गया है। उदाहरण के लिए प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के माध्यम से विज़ुअलाइज़ेशन के बाद, ब्याज की प्रोटीन के लिए विशेष रूप से फ्लोरोसेंटली टैग एंटीबॉडी का इस्तेमाल करते हुए अनपरिबाइलाइज्ड कोशिकाओं का लेबलिंग, आमतौर पर नियोजित दृष्टिकोण है, लेकिन एंटीबॉडी की उपलब्धता पर भारी निर्भर है जो बाह्य कोशिकाओं से बाँध सकते हैं। हाल ही में, अम्लीय मीडिया के संपर्क में आने के लिए प्रतिक्रिया करने वाले पीएच-संवेदनशील फ्लोरोफोर्स वाले क्रोमरिक प्रोटीन के प्रयोग से जुड़े तरीकों को भी सफलतापूर्वक 10 को नियोजित किया गया है। हालांकि, ऐसे assays आमतौर पर सेल लाइनों में इन constructs के exogenous अभिव्यक्ति शामिल है जिसमें ब्याज की प्रोटीन natively पाया नहीं है इन तरीकों के बावजूद subcellular स्थानीयकरण और exocytic यात्रा कार्यक्रम के बारे में बहुमूल्य जानकारी प्रदान करने में सक्षम हैंलक्ष्य प्रोटीन, और इसलिए यहां वर्णित बायोटिनिलेशन-आधारित तरीकों के साथ संयोजन के रूप में उपयोग किया जाना चाहिए यदि उपकरण उपलब्ध हैं
एक ठेठ बायोटिनिलेशन परख में, कोशिकाओं को पहले 4 डिग्री सेल्सियस पीबीएस में अच्छी तरह से धोया जाता है। इससे संस्कृति माध्यम द्वारा शुरू की गई सीरम प्रोटीन के किसी भी निशान को हटा दिया जाता है, इस प्रकार यह सुनिश्चित करता है कि ये अगले चरण में बायोटिन की अधिक मात्रा का उपभोग नहीं करेंगे। इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि, तापमान में कमी से एन्डोसाइटोसिस का कारण बढ़ने से काफी कम हो जाता है तब बायोटिनिलेशन अभिकर्मक जोड़ा जाता है। इसके बाद, कोशिकाओं को फिर से धोया जाता है, और फिर या तो ग्लाइसीन या एनएच 4 सीएल युक्त शमन बफर के साथ उकसाया जाता है, जिसके उद्देश्य से अनरेक्टेड बायोटिन के सभी शेष निशानों को निष्क्रिय करना है। तब कोशिकाओं को लियड किया जाता है, जिसके बाद बायोटीनिलेटेड प्रोटीन का वेग बढ़ने के लिए agarose-immobilized streptavidin को जोड़ा जाता है। विश्लेषण आमतौर पर पश्चिमी ब्लोटिंग के माध्यम से किया जाता है, जिससे विभिन्न जनसंपर्क के रिश्तेदार सेल-सतह अभिव्यक्ति की अनुमति मिलती हैओटीएन्स को मापने के लिए
इस परख के आधार के कारण, यह बाहरी वातावरण के संपर्क में आने वाले भाग रखने वाले प्रोटीनों के उपयोग के लिए उपयुक्त है। Multipas ट्रांसमैमब्रन प्रोटीन, जो कि उनके लूप क्षेत्रों के भीतर कई प्रतिक्रियाशील lysines के पास हैं, इस पद्धति के लिए सबसे अधिक अनुकूल हैं, जबकि एकल पास प्रोटीन बायोटिनिलाटेड होने के लिए कम संवेदी होते हैं। यहां तक कि इन मामलों में, एक संभावना बनी हुई है कि गठनात्मक बदलाव या इंटरमॉलेक्यूलर इंटरैक्शन कुछ प्रतिक्रियाशील साइटें प्रदर्शित कर सकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप कम-अपेक्षित बायोटिनेलिटी उपज उत्पन्न होता है।
बायोटिनिलेशन द्वारा सेल-सतह प्रोटीन की आंतरिकता दर निर्धारित करना
इस परख के सिद्धांत बड़े पैमाने पर सेल-सतह बायोटिनिलेशन के समान हैं, जिनमें कई अपवाद हैं, जिनमें से सबसे महत्वपूर्ण प्रतिवर्ती बायोटिनिलेशन अभिकर्मकों का उपयोग होता है। बायोटिन समूह (इनमें से) के पास अनुशासन हैएलफाईड बॉन्ड्स, उनके ढांचे के भीतर, जो एजेंटों को कम करने के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं; इसका उपयोग यह सुनिश्चित करने के लिए किया जाता है कि परख अवधि के दौरान इंट्रासेल्युलर साइट्स में ले जाने वाले सेल-सतह प्रोटीनों को बायोटिनिलाटेड छोड़ दिया जाएगा। एक परख आम तौर पर निम्नलिखित तरीके से होता है: कोशिकाओं को पहले धोया जाता है और ठंड अभिकर्मकों के साथ बायोटिनिलाटेड होता है, फिर 37 डिग्री सेल्सियस पर सेल संस्कृति माध्यम को पुन: पेश किया जाता है, और कोशिकाओं को इनक्यूबेटर में वापस कर दिया जाता है; यह लेबल सेल-सतह प्रोटीन को एन्डोकिटोसिस से गुजरना पड़ता है। कम करने वाले एजेंट ग्लुटाथिऑन – जो झिल्ली को घुसना नहीं कर सकते हैं – फिर कोशिका की सतह पर शेष प्रोटीन से जुड़े बायोटिन मोएटियों के डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड को तोड़ने के लिए जोड़ा गया है। अंत में, टूटी डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड को आयोडोएसिटामाइड से प्रतिक्रिया दी जाती है, लेबिल थियोल समूहों का सेवन करती है और सुधारों से बांड को रोकता है। पहले की तरह, कोशिकाओं को लिसाइड किया जाता है, और लेबल प्रोटीन स्ट्रैपटैविंडिन-एगरोज़ का उपयोग कर उपजी होते हैं।
सीमा डिस्कपिछले खंड में ussed यहां भी लागू होते हैं क्योंकि समानता के बीच साझा तरीके इसके अलावा, यह ध्यान में लायक है कि तापमान पर इस परख में शामिल बदलावों का सटीक निर्धारण है कि समय के प्रत्येक वेतन वृद्धि के लिए प्रोटीन कितना प्रोटीन होता है, खासकर तेजी से आंतरिक या तेजी से रीसाइक्लिंग प्रोटीन के मामले में। इस परख केवल एन्डोकितिक दर के एक semiquantitative अनुमान प्रदान करता है कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग प्रत्येक भारित पुटिका की तेजता को ट्रैक करने के लिए किया जा सकता है और एंडोसायटोसिस के कैनेटीक्स का अधिक सटीक माप प्रदान करता है। इसलिए यह इस परख के लिए एक बहुत ही उपयोगी पूरक प्रदान कर सकता है, यह मानते हुए कि ब्याज की प्रोटीन का फ्लोरोसेंटली टैग चिरात्मक निर्माण उपलब्ध है 11 ।
Protocol
Representative Results
Discussion
संशोधन:
जैसा कि इन विधियों को पक्षपाती कोशिकाओं के साथ उपयोग करने के लिए डिज़ाइन किया गया था, हमने पीबीएस के उपयोग को 100 मिलीग्राम / एल एमजीसीएल 2 ∙ 6 एच 2 ओ और
100 मिलीग्राम / एल CaCl 2…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस परियोजना को कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान पीजी # 20R47867 द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Fisher Scientific | A661-500 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9647-50 | |
| Bromophenol blue | Bio-Rad | #1610404 | |
| cOmplete protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| Disodium ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA) | Bio-Rad | #1610729 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | #1610611 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 11960-044 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Fisher Scientific | #21335 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotin | Thermo Fisher Scientific | #21331 | |
| Fetal bovine serum | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Iodoacetamide | Bio-Rad | #163-2109 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma-Aldrich | L2020 | Thaw on ice. |
| L-glutamine | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
| Mouse monoclonal anti-β-actin antibody (AC-15) | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| Mouse monoclonal anti-β-dystroglycan antibody (43DAG1/8D5) | Leica Biosystems | B-DG-CE | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 715-035-150 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-045 | |
| Phosphate buffer saline | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Reduced glutathione | Sigma-Aldrich | G6529 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 862010 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318-100 | |
| Streptavidin agarose resin | Thermo Fisher Scientific | #20347 | |
| Rabbit polyclonal anti-AQP4 antibody | Alomone | AQP-004 | |
| Tris base (Trizma base) | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-1 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 |
References
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