Summary
इस अनुच्छेद में, एक संशोधित टर्मिनल प्रतिबंध टुकड़ा विश्लेषण का उपयोग करके टेलोमोरे लंबाई की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल पर चर्चा की गई है जो टेलीमोरे लंबाई के तेज और कुशल प्रत्यक्ष माप प्रदान करता है। यह तकनीक टेलोमोरे लंबाई की मात्रा निर्धारित करने के लिए डीएनए के विभिन्न सेल स्रोतों पर लागू की जा सकती है।
Abstract
टेलोमोरे की लंबाई को मापने के लिए कई अलग-अलग तकनीकों हैं, प्रत्येक के अपने फायदे और नुकसान के साथ पारंपरिक दृष्टिकोण, टेलोमेरे प्रतिबंध फ्रेगमेंट (टीआरएफ) विश्लेषण, एक डीएनए संकरण तकनीक का उपयोग करता है जिससे जीनोमिक डीएनए नमूने पाचन एंजाइमों के साथ पच रहे हैं, टेलमोरे डीएनए पुनरावृत्तियों और कुछ उप-टेलोरोमिक डीएनए को छोड़कर। इन्हें agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा अलग किया जाता है, एक फिल्टर झिल्ली को स्थानांतरित किया जाता है और ऑल्गोन्यूक्लियोटाइड जांच के लिए हाइब्रिज्ड किया जाता है, या तो कैममिलाइनेसिसेंस या रेडियोधर्मिता के साथ टेल्मोरे प्रतिबंध प्रतिबंधों को कल्पना करता है। पीसीआर जैसे अन्य तकनीकों की तुलना में डीएनए की बड़ी मात्रा की आवश्यकता होती है, तो यह दृष्टिकोण कोशिकाओं की आबादी के टेलोमोरे लंबाई वितरण को माप सकता है और पूर्ण किलोबाज़ में अभिव्यक्त माप को अनुमति देता है। यह पांडुलिपि टेलीमोरे लंबाई का निर्धारण करने के लिए संशोधित डीएनए संकरण प्रक्रिया को दर्शाता है। जीनोमिक डीएनए पहले प्रतिबंध एंजाइमों के साथ पच जाता है (जो कटौती नहीं करते हैंTelomeres) और agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा अलग। जेल तब सूख जाता है और डीएनए विकृत और रेडियोलैबैड ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड जांच के लिए स्वस्थानी रूप में संकरित होता है । यह स्वस्थानी संकरण में टेलोमरे डीएनए के नुकसान से बचा जाता है और संकेत तीव्रता में सुधार करता है। हाइब्रिडिजेशन के बाद, जैल को फॉस्फोर स्क्रीन के उपयोग से चित्रित किया जाता है और टेलोमरे लम्बाई ग्राफ़िंग प्रोग्राम का उपयोग करके मात्रा निर्धारित की जाती है। यह प्रक्रिया डीआरएस के प्रयोगशालाओं द्वारा विकसित की गई थी। वुडिंग राइट और जैरी शय टेक्सास विश्वविद्यालय के दक्षिणपश्चिमी 1 , 2 यहां, हम कुछ संशोधनों के साथ, इस प्रक्रिया का विस्तृत वर्णन प्रस्तुत करते हैं।
Introduction
गुणसूत्रों के सिरों पर स्थित टेलोमेरेस अनुक्रम TTAGGG (मानव क्रोमोसोम पर) की न्यूक्लियोटाइड दोहराता है जो सेलुलर आनुवंशिक जानकारी 3 , 4 , 5 की सुरक्षा करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। टेलोमेरेस लंबाई में कई हजार जोड़े हैं और डीएनए प्रतिकृति के दौरान बाकी गुणसूत्रों की अखंडता की रक्षा के लिए काम करते हैं। गुणसूत्रों की प्रतिकृति सही नहीं है, जिसके परिणामस्वरूप गुणसूत्र के छोर पूरी तरह से प्रतिलिपि नहीं किए जा रहे हैं। प्रतिकृति में इस अक्षमता को "अंत-प्रतिकृति समस्या" कहा जाता है और इसके परिणामस्वरूप कुछ खुराक 6 , 7 के दौरान प्रत्येक टेलेमोरे के दोहराव के नुकसान में परिणाम मिलता है। टेलोमेरेस द्वारा सेल डिवीजन के बाद टेलोमेरे की लंबाई बहाल की जा सकती है, एंजाइम खो गया टेलोमरे दृश्य 8 , 9 की जगह लेता है। टेलोमेरेस, हालांकि, नहीं हैज्यादातर मानव दैहिक कोशिकाओं में सक्रिय होता है और नतीजतन, समय के साथ, टेलोमोरेस कम हो जाएगा, अंततः सेलुलर सेलनेस 10 में परिणाम होगा। टेलोमरे को छोटा करने के कारण, telomeres उम्र बढ़ने और उम्र से संबंधित बीमारियों का खतरा biomarker के रूप में माना जाता है 11 , 12 इसके अतिरिक्त, टेलोमोरे लंबाई आनुवंशिक, पर्यावरण और जीवन शैली के कारकों और ऑक्सीडेटिव तनाव जैसे अन्य उत्तेजनाओं से प्रभावित हो सकती है, यह दर्शाता है कि टेलोमोरे लंबाई विषैविक, महामारी विज्ञान और व्यवहारिक अध्ययनों में जैवमार्कर के रूप में एक भूमिका निभा सकते हैं 13 , 14 , 15 ।
यह आलेख एक संशोधित टर्मिनल प्रतिबंध टुकड़ा (टीआरएफ) विश्लेषण का उपयोग करके टेलोमरे लम्बाई को मापने के लिए एक तकनीक को दर्शाता है जो कि मेन्डर और शै 2 और किमुरा एट अल 16 , और हर्बर्ट, शे और रेग के समानएचटी 1 और हाउसमैन और मॉक 17 परंपरागत रूप से, टीआरएफ विश्लेषण में एक दक्षिणी दाग प्रक्रिया शामिल है। दक्षिणी ब्लोट को टेलोमोरे की लंबाई के अध्ययन के लिए "सोना-मानक" माना जाता है और महामारी विज्ञान के अध्ययन में ल्यूकोसाइट टेलोमोरे लंबाई की जांच के लिए सक्रिय रूप से उपयोग किया जाता है। यह टीआरएफ विश्लेषण टेस्टोमोर दोहराव के पीछे छोड़ने वाला पचाने वाला जीनोमिक डीएनए का उपयोग करता है। डीएनए टुकड़े तब जेल वैद्युतकणसंचलन से अलग हो जाते हैं, विकृत हो जाते हैं और एक नाइट्रोकेल्यूलोज झिल्ली को स्थानांतरित कर दिया जाता है। टेलोमेरे दृश्यों को एक टेलोमेरे ऑलिगोनक्लियोटाइड जांच के लिए हाइब्रिज्ड किया गया है। अलग-अलग टेल्मोरेस को झिल्ली तक स्थानांतरित करने के बजाय, अन्य टीआरएफ तकनीक डीएनए के बिना और बिना-बिना जेल संकरण तकनीकों का उपयोग करते हैं। अंतराल टेलोमोरेस का पता लगाने पर दोषपूर्णता को शामिल करना महत्वपूर्ण है, जो कि कुछ प्रजातियों में 19 की सूचना मिली है। कार्यवाही की कमी के कारण केवल वें का पता लगाया जा सकता हैटर्मिनल टेलोमेरेस पर एकल फंसे हुए डीएनए ओवरहेन्ज और इंटरस्टिस्टिकल टेलोमरे दृश्य 18 में बाँध नहीं करेंगे।
टीआरएफ़ विश्लेषण के अलावा, टेमोमोरे की लंबाई को मापने के लिए कई अन्य तकनीकें हैं, जिनमें प्रत्येक के अपने फायदे और नुकसान हैं। फ्लो-फिश तकनीक फ्लो साइमेट्रेट्री 16 , 20 का उपयोग करते हुए एक विशिष्ट सेल प्रकार की व्यक्तिगत कोशिकाओं के औसत टेलोरोमीटर लंबाई को माप सकती है। हालांकि यह सटीक रूप से उच्च विशिष्ट जांच वाले टेल्मोरेस को टैग कर सकता है और स्वचालन के माध्यम से मानव त्रुटि को कम कर सकता है, फ्लो-एफआईएसएच महाग, कम कुशल है और ताजा नमूनों और अत्यधिक कुशल तकनीशियनों की आवश्यकता है, जिसमें महामारी विज्ञान के अध्ययन के लिए अपनी क्षमता सीमित है 16 । इसके अलावा, यह विधि सेल आबादी में गुणसूत्रों की संख्या में संभावित परिवर्तन के लिए खाता नहीं है। एक अन्य तकनीक, qPCR, महामारी विज्ञान के अध्ययन के लिए टेलोमोरे लंबाई को मापने के साधन के रूप में व्यापक रूप से स्वीकृत है
टीआरएफ प्रक्रिया की अपनी कमियां हैं जो कुछ अध्ययनों के लिए इसका उपयोग सीमित करती हैं। टीआरएफ तकनीकों को अन्य तरीकों (2 से 3 μg प्रति नमूना के बीच) की तुलना में डीएनए की बड़ी मात्रा की आवश्यकता होती है। यह चिकित्सीय नमूनों की टेलोमोरे लंबाई का परीक्षण करने के लिए तकनीक के अनुप्रयोगों को सीमित करता है जिसके लिए पर्याप्त जीनोमिक डीएनए एकत्र किया जा सकता है, और अपमानजनक डीएनए नमूनों पर इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, टीआरएफ़ विश्लेषण महंगा और परिश्रम श्रमिक है, परिणाम प्राप्त करने के लिए 4-5 दिनों की आवश्यकता होती है। हालांकि, टीआरएफ़ भिन्नता का एक कम गुणांक पैदा करता हैअपनी प्रजनन क्षमता प्रदान करना हालांकि यह प्रोटोकॉल परंपरागत दक्षिणी दाग ( सीटू जेल संकरण में उपयोग) से भिन्न है, दो तकनीकों मौलिक रूप से समान हैं।
यहां प्रस्तुत तकनीक एक दक्षिणी धब्बा और इन-जेल संकरण का संयोजन है; इन-जेल संकरण के साथ दक्षिणी ब्लोट से डीएनए denaturing चरण जोड़ना। इस संयोजन में दक्षिणी धब्बों की तुलना में बेहतर जांच सिग्नल की ताकत के अतिरिक्त लाभ हैं और हमारी प्रयोगशाला में लगातार मात्रात्मक परिणाम उत्पन्न हुए हैं। इसके अतिरिक्त, रसायनमितीय जांच के बजाय रेडियोधर्मी जांच का उपयोग उच्च संकेत तीव्रता पैदा करता है और फॉस्फोरिमेगर के साथ विजुअलाइजेशन और मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है, जो टीआरएफ उपयोगकर्ता के अनुकूल के विश्लेषण करता है।
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Protocol
1. जीनोमिक डीएनए निकालना
- निर्माता के निर्देशों के अनुसार, एक वाणिज्यिक डीएनए निष्कर्षण किट का उपयोग करके कोशिकाओं से जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण (यहाँ, सेल लाइन बीजे-एचटीआरटीटी) का विश्लेषण करना।
- स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ डीएनए एकाग्रता को मापें यदि डीएनए एकाग्रता 100 से कम माइक्रोग्राम / एमएल है, तो डीएएन को एथानोल और रेसपेंड के साथ ते बफर (10 एमएम ट्रिस-सीएल; 0.1 एमएम ईडीटीए (एथिलीनएडायाइनेटेट्रैटेसेटिक एसिड); पीएच 8.0) की एक डीएनए एकाग्रता सुनिश्चित करने के लिए, 100-600 माइक्रोग्राम / एमएल)
2. डीएनए वफ़ादारी आकलन
नोट: प्रोटोकॉल का यह हिस्सा 11 सेमी x 14 सेमी जेल के साथ एक जेल वैद्युतकणसंचलन प्रणाली का उपयोग करके एक डीएनए अखंडता मूल्यांकन की रूपरेखा करता है। अन्य सिस्टम और जेल आकार का भी उपयोग किया जा सकता है, लेकिन वोल्टेज और डीएनए प्रवासन समय भिन्न हो सकता है।
- 1 एक्स टीएई बफर के 100 एमएल में वैद्युतकणसंचलन ग्रेड एगरोज़ के 1 ग्राम को संयोजन करके 1% agarose जेल तैयार करें (40 मिमी ट्रआधार है, 20 मिमी एसिटिक एसिड; 2 मिमी ईडीटीए; पीएच 8.5) और माइक्रोवेव तक agarose भंग कर दिया है और समाधान स्पष्ट है। कमरे के तापमान पर समाधान जब तक यह 50 डिग्री सेल्सियस (लगभग 15 - 20 मिनट) तक पहुंचता है।
- जबकि agarose समाधान ठंडा है, कास्टिंग ट्रे को अंतिम गेट्स का ढांचा जोड़कर जेल कास्टिंग ट्रे तैयार करें। Agarose रिसाव को रोकने के लिए, कास्टिंग ट्रे से संलग्न करने के लिए अंत गेट 4 डिग्री सेल्सियस से पहले शांत करें।
- एक बार agarose समाधान 50 डिग्री सेल्सियस के लिए ठंडा है, 10 μL ethidium ब्रोमाइड (डीएच 2 हे में 10 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ें और जेल कास्टिंग ट्रे में agarose समाधान डालना। कास्टिंग ट्रे को कंघी जोड़ें
- कमरे के तापमान पर 45 मिनट के लिए कटाई करने के लिए agarose समाधान की अनुमति दें
- 1 एनईई बफर के जरिये 9 एनएलएल के अंतिम मात्रा में 25 एमजी जीनोमिक डीएनए को डिलीमेंट करके वैद्युतकणसंचलन के लिए डीएनए नमूने तैयार करें और 1 μL 10x लोड हो रहा डाई (0.25% (वाय / वी) ब्रोमोफेनॉल नीला, 0.25% (डब्ल्यू / वी) xylene साइनाल एफएफ, 30% (वी / वी) ग्लिसरॉल)। अच्छी तरह मिलाएं।
- लगभग 2 घंटे के लिए या जब तक ब्रोमोफिनॉल नीले डाई जेल के माध्यम से लगभग आधा रास्ता नहीं है, तब तक 100 वी पर डीएनए प्रवास चलाएं।
- जेल एक पराबैंगनी प्रकाश ट्रांसिलमिनेटर या समकक्ष का उपयोग कर छवि।
नोट: अच्छा निष्ठा के साथ डीएनए नमूने में उच्च परमाणु वजन बैंड नहीं है जो धुंधला हो रहा है (यह शेड या टूटी हुई डीएनए की वजह से है)। यदि डीएनए बैंड लिखे गए हैं, तो उनकी कम अखंडता है और दक्षिणी दाग विश्लेषण के लिए उपयुक्त नहीं हैं, और डीएनए को नए कोशिकाओं के साथ फिर से पृथक होना चाहिए।
3. जीनोमिक डीएनए पाचन
- 20-40 μL के अंतिम मात्रा में जीनोमिक डीएनए के पाचन को निष्पादित करें।
नोट: वॉल्यूम अधिक से अधिक40 से अधिक μL agarose जेल के कुओं से अधिक बह जाएगा।- 3 माइक्रोग्राम जीनोमिक डीएनए और 10x डीएनए डाइजेस्ट बफर की उचित मात्रा (प्रतिबंध एंजाइमों के साथ प्रदान की जाती है) ताकि एक माइक्रोट्यूब में अंतिम एकाग्रता 1x हो। प्रत्येक ट्यूब के लिए 1 μL रुपये प्रति प्रतिबंध एंजाइम (10,000 यू / एमएल) और 1 μ एल एचिनफी प्रतिबंध एंजाइम (10,000 यू / एमएल) जोड़ें। बाँझ, विआयनीकृत एच 2 ओ का उपयोग करके अंतिम मात्रा को समायोजित करें। संक्षेप में अपकेंद्रित्र (10 - 15 s 16,000 xg) सुनिश्चित करने के लिए कि सभी घटकों ट्यूब के नीचे हैं।
- ≥ 16 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पाचन को सेते हैं। पाचन के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस या -20 डिग्री सेल्सियस पर पचाने वाले डीएनए को 2 दिन से अधिक समय तक स्टोर करें यदि आवश्यक हो तो 17 ।
4. जीनोमिक डीएनए जेल वैद्युतकणसंचलन
नोट: प्रोटोकॉल के इस हिस्से में 20 सेमी x 25 सेमी जेल वैद्युतकणसंचलन प्रणाली का उपयोग करने के लिए एक प्रक्रिया की रूपरेखा है। विभिन्न जेल इलेक्ट्रोफ़ॉरेसिस सिस्टम का इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन इष्टतम परिणामों को प्राप्त करने के लिए कई चर को संशोधित करने की आवश्यकता हो सकती है जिसमें वोल्टेज, माइग्रेशन के समय और सिस्टम में जोड़ा गया इलेक्ट्रोफोरेसिस बफर शामिल है।
- 375 एमएल इलेक्ट्रोफोरेसिस बफर के साथ 2.25 ग्राम जेल वैद्युतकणसंचलन बफर के साथ 0.6% agarose समाधान तैयार करें, या तो 1x टीएई या 0.5x टीबीई (110 एमएम ट्रिस बेस; 90 एमएम बोरिक एसिड; 2.5 एमएम ईडीटीए, पीएच 8.3)।
नोट: 8,000 केबी से कम दूरबीन के लिए, 0.5x टीबीई की सिफारिश की जाती है जबकि 1 एक्स टीएई को दूरबीन के लिए 8,000 केबी और 20,000 केबी 1 के बीच अनुशंसित है। - जब तक agarose भंग नहीं किया गया है और समाधान स्पष्ट है, तब तक माइक्रोवेव समाधान। समाधान को कमरे के तापमान पर 15-20 मिनट के लिए शांत करने दें या जब तक Agarose 50 डिग्री सेल्सियस तक नहीं पहुंचता।
- जबकि agarose समाधान ठंडा है, चरण 2.2 में वर्णित जेल कास्टिंग के लिए जेल वैद्युतकणसंचलन प्रणाली तैयार करें। एक जेल कास्टिंग ट्रे में agarose जेल समाधान डालो। एक कंघी में रखेंजेल जेल को कमरे के तापमान पर 45 मिनट के लिए कड़ी मेहनत करने दें।
- वैद्युतकणसंचलन के लिए पचाने वाले डीएनए नमूने तैयार करें 40 यूएल प्रतिक्रिया के लिए, पचाने वाले डीएनए के प्रत्येक नमूने में 0.4 μL 10x लोडिंग डाई को जोड़ें। संक्षेप में अपकेंद्रित्र (10-15 s, 16,000 xg) यह सुनिश्चित करने के लिए कि सभी समाधान ट्यूब के निचले भाग में हैं।
- डीएनए प्रवासन के लिए जेल वैद्युतकणसंचलन प्रणाली तैयार करें। जेल से अंत गेट्स और कंबल निकालें जेल वैद्युतकणसंचलन प्रणाली को 1x टीएई या 0.5x टीबीई को भरण लाइन में भरें, यह सुनिश्चित करें कि बफर में जेल पूरी तरह से डूब गया है।
- डीएनए नमूनों के साथ जेल के कुएं लोड करें, ताकि नमूनों के बीच एक रिक्त अच्छी जगह हो। बुलबुले पैदा करने से बचें या जेल को छानने से बचें जेल के विपरीत छोर पर 10 μL डीएनए सीढ़ी कुओं में जोड़ें।
नोट: डीएनए सीढ़ी का प्रकार टेलोमोरे की लंबाई पर निर्भर करेगा, जो व्यक्ति से दूसरे व्यक्ति और कोशिका स्रोतों के बीच भिन्न होगा। - 1 पर जेल वैद्युतकणसंचलन चलाएंजेल में जल्दी से डीएनए को स्थानांतरित करने के लिए 30 मिनट के लिए 50 वी; फिर वोल्टेज को 57 वी में समायोजित करें और 18-24 घंटे के लिए चलाएं।
5. जेल फ्लोरोसेंट इमेजिंग और हाइब्रिडिज़ेशन
- 18-24 घंटे के बाद, जेल वैद्युतकणसंचलन शक्ति स्रोत को बंद करें। इलेक्ट्रोफोरेसिस बफर से जेल के साथ जेल कास्टिंग ट्रे निकालें। जेल के अभिमुखता के लिए एक संदर्भ के रूप में सेवा करने के लिए जेल के शीर्ष दाएं कोने को हटा दें।
- जेल की तुलना में थोड़ा बड़ा आकार होने के लिए पेपर काटने से फिल्टर पेपर का एक टुकड़ा तैयार करें। कास्टिंग ट्रे में जेल के ऊपर फिल्टर पेपर रखें और पेपर को जेल पर अतिरिक्त समाधान लेना चाहिए। पक्षियों के माध्यम से बुलबुले को निचोड़ने के लिए एक रोलर के रूप में फ़िल्टर पेपर और जेल के बीच हवा बुलबुले को ध्यान से हटा दें।
- जेल को जेल और फिल्टर पेपर को फ्लेप करके काली ट्रे से जेल निकालें ताकि पेपर जेल के नीचे हो। एक जेल ड्रायर के लिए फिल्टर पेपर के साथ जेल स्थानांतरण और कवरजेल प्लास्टिक की चादर के साथ एक रोलर के रूप में एक पिपेट का उपयोग करके प्लास्टिक की चादर और जेल के बीच सभी हवाई बुलबुले निकालें।
- 50 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए जेल सूखी
- सूखने के बाद, प्लास्टिक की चादर को हटा दें और जेल और फिल्टर पेपर को गिलास के डिब्बे में स्थानांतरित करें जिसमें 250 मिलीलीटर विआयनीकृत पानी (जेल को कवर करने के लिए पर्याप्त) है। फिल्टर पेपर को ध्यानपूर्वक हटाएं और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर जेल से सेवन करें। जेल फाड़ के बिना हेरफेर करने के लिए पतली, फर्म और आसान हो जाएगा।
- विआयनीकृत पानी में 5x एसएससी समाधान (750 मिमी NaCl; 75 मिमी सोडियम साइट्रेट) तैयार करें
- एक नायलॉन जाल (12 x 12 इंच में) के शीर्ष पर जेल रखो नायलॉन जाल और जेल को एक साथ रोल करें ताकि सुनिश्चित हो जाए कि जेल स्वयं के संपर्क में नहीं है। मेष और जेल को संकरण ट्यूब में रखें ( जैसे , ट्यूब में 12, व्यास में 1.5)।
नोट: जब ठीक से रोल किया जाता है, तो जेल दोनों पक्षों पर नायलॉन मेष के संपर्क में होगा। - 100 एमएल 5x एसएससी और 12 μL का हरी फ्लोरोसेंट न्यूक्लिक एसीआईडी का दाग, और संकरण ट्यूब में जगह। रोशनी से समाधान को सुरक्षित रखें और 42 डिग्री सेल्सियस पर रोटेशन के साथ एक संकरण ओवन में 30 मिनट के लिए सेते।
- संकरण ट्यूब से नायलॉन जाल / जेल निकालें, एक गिलास के डिब्बे में सपाट खोलें, जिसमें 250 मिलीलीटर विआयनीकृत पानी होता है और धीरे-धीरे नायलॉन जाल को हटा दें। एक फॉस्फोरिमगर का उपयोग कर जेल छवि फ्लोरोसेंट सेटिंग्स का उपयोग करें: 520 बीपी, 40 ब्लू और 488 एनएम। Photomultiplier ट्यूब (पीएमटी) को 375 तक सेट करें, फोकल हवाई जहाज़ +3 मिमी और सामान्य के प्रति संवेदनशीलता। छवि को एक फ़ाइल में सहेजें
6. संकरण
- रेडियोधर्मी टेलोमरे जांच तैयार करें।
- 2 μL (2 एनजी) टेलोमेरे प्रोब (5- (सीसीसी टीएए) 4 3 '), 2.5 μL 10x पॉलिन्यूक्लिओक्टाइड किनेज प्रतिक्रिया बफर, 3 μL γ 32 पी-डीएटीपी (6000 सीआई / एमएमओएल), 4 टीएल के 4 μL पोलिन्यूक्लियोटाइड किनेज और डीएनज मुक्त, बाँझ विआयनीकृत पानी को एक माइक्रोन में 20 μL की अंतिम मात्रा मेंओसीट्र्रिज ट्यूब
सतर्कता: रेडियोधर्मिता का उपयोग करते समय सुविधाओं का रेडियोधर्मी सुरक्षा और नियमों का पालन करें।
- 2 μL (2 एनजी) टेलोमेरे प्रोब (5- (सीसीसी टीएए) 4 3 '), 2.5 μL 10x पॉलिन्यूक्लिओक्टाइड किनेज प्रतिक्रिया बफर, 3 μL γ 32 पी-डीएटीपी (6000 सीआई / एमएमओएल), 4 टीएल के 4 μL पोलिन्यूक्लियोटाइड किनेज और डीएनज मुक्त, बाँझ विआयनीकृत पानी को एक माइक्रोन में 20 μL की अंतिम मात्रा मेंओसीट्र्रिज ट्यूब
- संक्षेप में अपकेंद्रित्र (10 से 30 s 16,000 xg) और पानी स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए सेते हैं। 10 से 30 एस के लिए अपकेंद्रित्र 16,000 XG और 65 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए प्रतिक्रिया रोकना।
- जी -25 क्रोमैटोग्राफी माइक्रोबिन कॉलम का इस्तेमाल करते हुए, स्तंभ की सामग्री को छेड़छाड़ से मिलाएं, फिर कमरे के तापमान पर 700 x ग्रा में 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित करें। छानना त्यागें
- जी -25 क्रोमैटोग्राफी कॉलम में रेडियोधर्मी जांच समाधान और 700 मिनट में 2 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र लोड करें छानना बचाओ
नोट: छानना बनाए रखें क्योंकि इसमें रेडियोधर्मी टेलोमरे जांच है। यदि आवश्यक हो तो रेडियोधर्मी जांच को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है - बाँझ विआयनीकृत पानी में 1.5 एम NaCl और 0.5 M NaOH से बना 250 मिलीलीटर का डेंटलिंग समाधान तैयार करें।
- जेल को एक गिलास के डिब्बे में डालें जिसमें 250 एमएल का डेंस्टरिंग समाधान और इन्क्यूब हैकमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए खा लिया। डेंस्टरिंग समाधान निकालें और 250 एमएल बाँझ विआयनीकृत पानी के साथ बदलें। कमरे के तापमान पर एक कक्षीय प्रकार के बरतन (40 - 50 आरपीएम) पर 10 मिनट के लिए सेते हैं।
- 1.5 NaCl और 0.5 एम ट्राइस-हाइड्रोक्लोरिक एसिड, पीएच 8.0 बाँझ विआयनीकृत पानी से बना हुआ 250 एमएल का निषेचन समाधान तैयार करें।
- विआयनीकृत पानी निकालें और 250 एमएल निष्पक्ष समाधान के साथ बदलें और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए सेते हैं।
- निरूपण समाधान में ऊष्मायन के दौरान, 5x एसएससी, 5x डेनहार्ड के समाधान (0.1% गैर-आयनिक सिंथेटिक बहुलक; 0.1% पॉलीविनाइल पायरोलीइडाइन; 0.1% गोजातीय सीरम एल्बुमिन), 10 मिमी डिस्डियम फॉस्फेट (ना 2 एचपीओ) से बना 50 एमएल संकरण समाधान तैयार करें। 4 ) और 1 एमएम सोडियम पाइरोफॉस्फेट टेट्राबासिक डेकाहैडेट (ना 4 पी 2 ओ 7। 10 एच 2 हे) बाँझ विआयनीकृत पानी में।
- नायलॉन जाल में जेल रोल करें और संकरण ट्यूब में कदम (चरण5.7)। संकरण समाधान के 20 एमएल जोड़ें और 42 डिग्री सेल्सियस पर हाइब्रिडिजेशन ओवन में 10 मिनट के लिए रोटेशन के साथ सेते हैं।
- संकरण समाधान निकालें और ताजा संकरण समाधान के 20 एमएल के साथ बदलें। पूरी तरह से टेलोमोरे जांच को जोड़ें और 42 डिग्री सेल्सियस पर रोटेशन के साथ रातोंरात हाइब्रिडिजेशन ओवन में सेवन करें।
7. जेल वॉशिंग, फॉस्फोर स्क्रीन एक्सपोजर, और रेडियो इमेजिंग
- बाँझ विआयनीकृत पानी में 500 एमएल 2x एसएससी समाधान (300 मिमी NaCl, 30 मिमी सोडियम साइटेट) तैयार करें।
- वियोजित जल में 250 एमएल का 0.1x एसएससी (15 मिमी NaCl; 1.5 एमएम सोडियम साइट्रेट) और 0.1% सोडियम डाइडसायलिक सल्फेट (एसडीएस) तैयार करें।
- संकरण ट्यूब से जेल और जाल निकालें और 2x एसएससी के 250 एमएल वाले गिलास के डिब्बे में रखें। पकवान से नायलॉन जाल को हटा दें और निकालें। एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर कांच के डिब्बे रखें और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए सेते हैं।
- 2x एसएससी निकालें और 250 एमएल का 0.1x एसएससी और 0 से बदलें.1% एसडीएस समाधान, और कमरे के तापमान पर एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर 15 मिनट के लिए सेते हैं।
- ऊष्मायन के दौरान, फॉस्फोर स्क्रीन को 15 मिनट के लिए छवि इरेज़र में दिखाएं।
- 0.1x एसएससी और 0.1% एसडीएस समाधान निकालें और 2x एसएससी के 250 एमएल के साथ बदलें। एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर 15 मिनट के लिए सेते हैं
- 2x एसएससी समाधान से जेल निकालें और या तो प्लास्टिक की जांघ में जेल लपेटें या गर्मी सीलबस पाउच में रखें। जेल और प्लास्टिक की चादर या प्लास्टिक की थैली के बीच सभी बुलबुले और वायु जेब निकालें। Phopshor स्क्रीन के साथ जेल को एक एक्सपोजर कैसेट में रखें। रातोंरात जेल को फॉस्फोर स्क्रीन का खुलासा करें।
- एक फॉस्फोरिमगर का उपयोग करते हुए उजागर फॉस्फोर स्क्रीन छवि।
8. टेलोमेरे लंबाई मात्रा
- हरे फ्लोरोसेंट न्यूक्लिक एसिड-सना हुआ जेल ( चित्रा 1 ) की फ्लोरोसेंट इमेज युक्त फॉस्फोरीमेगर फ़ाइल खोलें।
- 'उपकरण' और फिर 'पिक्सेल दूरी का चयन करें9 ;. माउस का उपयोग करते हुए, अच्छी तरह से जेल के नीचे से पहले मार्कर बैंड के बीच में एक रेखा खींचना और दूरी रिकॉर्ड करें। प्रत्येक मार्कर बैंड के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं ( चित्रा 2 )। ये दूरी नीचे वर्णित ग्राफिंग प्रोग्राम में उपयोग किए जाएंगे।
- रेडियोलैलेबेल्ड जेल ( चित्रा 3 ) का फास्फोरियम खोलें। 'ऑब्जेक्ट मैनेजर' और उसके बाद 'ग्रिड' का चयन करें ग्रिड को 1 कॉलम और 150 पंक्तियों में सेट करें। ग्रिड को समायोजित करें ताकि यह जेल के ऊपर से जेल के नीचे तक फैला हो। ग्रिड की चौड़ाई के बराबर ग्रिड की चौड़ाई को समायोजित करें, ग्रिड के किनारे पर क्लिक करके और ग्रिड की चौड़ाई को लेन की चौड़ाई के बराबर खींचकर समायोजित करें।
- इस ग्रिड की प्रतिलिपि बनाएं (ताकि बॉक्स की चौड़ाई और ऊंचाई एक समान रहे) और दूसरी ग्रिड को खाली लेन में ले जाएं (पृष्ठभूमि उद्देश्यों के लिए) अतिरिक्त नमूना लेन के लिए अतिरिक्त ग्रिड कॉपी और स्थानांतरित करना जारी रखें।
नोट: जब समाप्त हो, तो होना चाहिएप्रत्येक नमूना लेन के लिए ग्रिड और पृष्ठभूमि के लिए एक खाली लेन का एक ग्रिड ( चित्रा 4 )। - 'विश्लेषण' और उसके बाद 'वॉल्यूम रिपोर्ट' चुनें। रिपोर्ट के लिए सभी ग्रिड चुनें। एक बार वॉल्यूम रिपोर्ट प्रदर्शित की जाती है, स्प्रैडशीट प्रोग्राम को सक्रिय करने के लिए रिपोर्ट पर डबल क्लिक करें। स्प्रैडशीट फ़ाइल सहेजें। इस फाइल का डेटा होगा 'वॉल्यूम' लेन के तहत
- एक उपयुक्त ग्राफिंग प्रोग्राम खोलें और एक नया डेटा और तालिका बनाएं। चुनें 'वाई: प्रत्येक बिंदु के लिए एक एकल वाई मान दर्ज करें और फिर प्लॉट करें' फिर 'बनाएँ' चुनें।
- 'मापित दूरी' के रूप में प्रथम स्तंभ (स्तंभ X) को लेबल करें और दूसरे कॉलम (कॉलम वाई) को 'आणविक वजन' के रूप में लेबल करें। कॉलम वाई में प्रत्येक मार्कर बैंड के मार्कर आणविक भार दर्ज करें। प्रत्येक आणविक वजन मार्कर के लिए चरण 8.2 में प्राप्त माइग्रेशन दूरी दर्ज करें।
- 'विश्लेषण' पर जाएं और 'विश्लेषण करें' चुनें और फिर 'गैर-रेखीय रिग्रेसी'पर (वक्र फिट) 'और' ओके 'का चयन करें अगली स्क्रीन पर, 'घातीय और फिर' एक चरण क्षय 'चुनें 'रेंज' टैब का चयन करें और '150 अंक में' अंक की संख्या जो कि वक्र को परिभाषित करता है 'दर्ज करें और' एक अन्य प्रोग्राम को वक्र निर्यात या प्रतिलिपि बनाने के लिए XY निर्देशांक की तालिका बनाएँ 'को चेक करें।
नोट: नतीजा, 'डाटा 1 के गैर लाइनर फिट' में, वाई पंक्ति में प्रत्येक दूरी के लिए आणविक वजन होता है। - नमूना लेन के विश्लेषण के लिए, वास्तविक टेलोमरे बैंड के ऊपर और नीचे के विश्लेषण का एक क्षेत्र चुनें। लेन की पूरी लंबाई का उपयोग न करें ( चित्रा 5 )। प्रत्येक लेन के विश्लेषण के क्षेत्र के लिए ग्रिड स्थान निर्धारित करें।
- 'फ़ाइल', 'नया' 'नई तालिका और ग्राफ़ बनाएं' चुनें चुनें 'वाई: प्रत्येक बिंदु के लिए एक एकल वाई मान दर्ज करें और फिर प्लॉट करें' फिर 'बनाएँ' चुनें। स्प्रेडशीट फ़ाइल से पृष्ठभूमि लेन मात्रा मान (तीव्रता मान) को कॉपी और पेस्ट करेंपहले कॉलम (वाई) में नमूना लेन से पहले कॉलम (एक्स) और वॉल्यूम मूल्यों (तीव्रता मान) में, अगर एकाधिक नमूना लेन हैं, तो स्प्रैडशीट फ़ाइल से वॉल्यूम मूल्यों के प्रत्येक सेट को ग्राफ़िंग प्रोग्राम में अतिरिक्त Y कॉलम में कॉपी करें फ़ाइल।
- पृष्ठभूमि कॉलम (एक्स) से मान हटाएं और प्रत्येक नमूना लेन (वाई) जो चरण 8.8 में निर्धारित विश्लेषण के क्षेत्रों के बाहर हैं।
नोट: डेटा तालिका में विश्लेषण के क्षेत्रों के अनुरूप उन ग्रिड स्थानों में केवल मान शामिल होना चाहिए। - विश्लेषण का चयन करें, फिर 'विश्लेषण' और 'परिवर्तन' ओके पर क्लिक करें'। 'Y = YX का उपयोग करके वाई बदलाएं' चुनें यह डेटा 2 में डेटा को बदल देगा (परिवर्तनित तीव्रता मूल्य (वाई) = नमूना तीव्रता (वाई) - पृष्ठभूमि तीव्रता (एक्स))।
- विश्लेषण तब चुनें 'विश्लेषण', 'कॉलम विश्लेषण' और 'कॉलम आँकड़े'। ठीक चुनें परिणाम टैब 'कर्नल आंकड़ों के रूपांतरण की आँकड़े 2 'शो'योग' पंक्ति के तहत, Σ (Int i )
- 'फ़ाइल', 'नया', 'नई तालिका और ग्राफ़ बनाएं' चुनें चुनें 'वाई: प्रत्येक बिंदु के लिए एक एकल वाई मान दर्ज करें और फिर प्लॉट करें' फिर 'बनाएँ' चुनें। नए पेज के डेटा 1, कर्व के नॉनलाइन फिट के नए पेज में से वाई कॉलम डेटा को कॉपी और पेस्ट करें। नए वाई कॉलम में परिणाम पेज 'ट्रांसफॉर्म ऑफ डेटा 2' से Y कॉलम डेटा को कॉपी और पेस्ट करें। विश्लेषण तब चुनें 'विश्लेषण' और 'रूपांतरण'। ओके पर क्लिक करें'। 'Y = Y / X' का उपयोग करके 'रूपांतरण वाई मान चुनें'
- विश्लेषण तब चुनें 'विश्लेषण', 'कॉलम विश्लेषण' और 'कॉलम आँकड़े'। ठीक चुनें परिणाम टैब 'कर्नल 'आंकड़े के आंकड़े 3 के आंकड़े' 'राशि' पंक्ति के नीचे दिखाए गए हैं, Σ (आईटी / आईपी) मेगावाट = आणविक वजन
- प्रत्येक नमूना के लिए औसत टेलोरोमीटर लंबाई (टीएल) की गणना करने के लिए, इसका उपयोग करेंसूत्र टीएल = Σ (Int i ) / Σ (Int i / MW i )
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Representative Results
डीओएन (1, 2 और 3 माइक्रोग्राम) की तीन कोशिकाओं को सेल लाइन बीजे-एचटीआरटी (टेलोमोरेज़ अमर मानव फीरोजफिब्लास्ट्स) से अलग किया गया था और मानव परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) को टेलोमोरे लंबाई के लिए विश्लेषण किया गया था। तालिका 1 प्रत्येक डीएनए नमूने के लिए लेन कार्य दिखाता है। चित्रा 1 जेल के एक न्यूक्लिक एसिड फ्लोरोसेंट दाग को दिखाता है। आणविक वजन मानकों स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं। जेल के शीर्ष से प्रत्येक आणविक भार मानक तक की दूरी निर्धारित की गई थी ( चित्रा 2 )। चित्रा 3 से पता चलता है कि गैल के फॉस्फोरिमाग को टेबोरियम जांच के साथ संकरण के बाद। टेलोमेरे बैंड प्रत्येक लेन में स्मीयर के रूप में दिखाए जाते हैं। प्रत्येक लेन और एक पृष्ठभूमि लेन ( चित्रा 4 ) के लिए 150 बक्से की ग्रिड गणना की गई थी। विश्लेषण के क्षेत्रों के क्षेत्रों के लिए इसीनमूने के प्रत्येक सेट के लिए टेलोमोरे बैंड युक्त जेल, चित्रा 5 में दिखाया गया है। यह सुनिश्चित करने के लिए कि पृष्ठभूमि की तीव्रता प्रत्येक नमूना सेट ( चित्रा 5 में बी चिह्नित करती है) के समान होती है, प्रत्येक नमूने के लिए पृथक पृष्ठभूमि गलियों का चयन किया गया था। तालिका 2 प्रत्येक नमूने के लिए टेलीमोरे प्रतिबंध टुकड़ा लंबाई को दर्शाता है। एचटीटीआर अमर सेल लाइन (बीजे-एचटीआरटी) में औसत टेलोमोरे की लंबाई मानव पीबीएमसी के मुकाबले अधिक है ( चित्रा 3 में गलियों 10, 12 और 14 के साथ गलियों 2, 4 और 6 की तुलना करें)। ये परिणाम यह भी प्रदर्शित करते हैं कि प्रत्येक लेन में विश्लेषण किए जाने वाले जीनोमिक डीएनए की मात्रा हाइब्रिडिजेशन के बाद एक डिटेक्टिव संकेत प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। टेलीमोरे के साथ नमूनों के लिए जो काफी समान हैं ( यानी , बीजे-एचटीआरटी सेल लाइन) के रूप में 1 माइक्रोग्राम के रूप में छोटा यह प्रक्रिया (हालांकि संकेत बहुत बेहोश था) का उपयोग कर detectable था। हालांकि, टेलोमोरे वाले नमूनों के लिए एक हैबड़ा विचरण ( यानी , मानव पीबीएमसी), एक विश्वसनीय संकेत प्रदान करने वाले डीएनए की न्यूनतम राशि 2 माइक्रोग्राम है।
चित्रा 1 : ग्रीन फ्लोरोसेंट न्यूक्लिक एसिड सना हुआ जेल। सूखे agarose जेल का फास्फोरम, हरे रंग के फ्लोरोसेंट न्यूक्लिक एसिड दाग के साथ दाग, डीएनए सीढ़ी बैंड (लेन 1 और 8) के स्थान को दर्शाता है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 2 : मार्कर बैंड माइग्रेशन दूरी का निर्धारण । नीले तीर जेल के ऊपर से मापा जाने वाली दूरी को ईए से दर्शाते हैंसी डीएनए सीढ़ी बैंड इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 3 : डीएनए नमूनों का फास्फोरियम, तेलमोरे जांच के साथ जांच की गई। लैन 2, 4 और 6 में बीजे-एचटीटी डीएनए (क्रमशः 1, 2, और 3 माइक्रोग्राम) होते हैं। लैन 10, 12 और 14 में मानव पीबीएमसी डीएनए (क्रमशः 1, 2 और 3 माइक्रोग्राम) शामिल हैं। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 4 : ग्रिड स्थान स्क्रीनशॉट का स्थान दिखा रहा हैप्रत्येक विश्लेषण लेन के लिए 150 ग्रिड ग्रिड। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 5 : विश्लेषण के क्षेत्र। टेम्मोरे बैंड के फास्फोरियम, नमूने के प्रत्येक सेट के विश्लेषण के चयनित क्षेत्रों को दर्शाता है। लैन 2, 4 और 6 में बीजे-एचटीटी डीएनए होते हैं; लेन 10, 12 और 14 में मानव पीबीएमसी डीएनए शामिल हैं। बी = पृष्ठभूमि गलियों इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
| गली | नमूना |
| 1 | डीएनए सीढ़ी |
| 2 | BJ-HTERT 1 &# 181; जी |
| 3 | रिक्त |
| 4 | बीजे-एचटीटीआर 2 माइक्रोग्राम |
| 5 | रिक्त |
| 6 | BJ-HORTT 3μg |
| 7 | रिक्त |
| 8 | डीएनए सीढ़ी |
| 9 | रिक्त |
| 10 | पीबीएमसी 1μg |
| 1 1 | रिक्त |
| 12 | पीबीएमसी 2μg |
| 13 | रिक्त |
| 14 | पीबीएमसी 3μg |
| डीएनए नमूने 0.6% agarose जेल पर विभाजित |
तालिका 1: डीएनए एगारोस नमूना असाइनमेंट।
| नमूना (लेन) | & #8721; (इंट आई ) | Σ (Int i / MW i ) | औसत टेलोमरे की लंबाई = Σ (Int i ) / Σ (Int i / MW i ) |
| BJTert 1ug (1) | 268,691 | 20,596 | 13.04578559 |
| BJTert 2ug (2) | 1357000 | 103,204 | 13.14871517 |
| BJTert 3ug (3) | 1962000 | 148,411 | 13.22004434 |
| पीबीएमसी 1ug (4) | -416,337 | -142,585 | 2.91992145 |
| पीबीएमसी 2ug (5) | 286,653 | 62,845 | ४.५६,१२,६९,७९१ |
| पीबीएमसी 3ug (6) | 1880000 | 524,123 | ३.५८,६९,४४,२८६ |
तालिका 2: औसत टेलोमरे की लंबाई की गणना।
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Discussion
निम्नलिखित वैद्युतकणसंचलन, जीनोमिक डीएनए धब्बा 800 बीपी से अधिक है यह तब हो सकता है यदि प्रतिबंध एंजाइमों में दोषपूर्ण होते हैं या यदि अतिरिक्त एंजाइम (जैसा ऊपर वर्णित है) की आवश्यकता होती है। दूसरा संभावित स्पष्टीकरण यह है कि प्रोटीन अभी भी डीएनए से जुड़ा हुआ है। स्पेक्ट्रोफोटोमीटर द्वारा डीएनए एकाग्रता का निर्धारण करते समय, 260/280 अनुपात 1.8 के आसपास होना चाहिए। यदि यह अनुपात <1.5 है, तो प्रोटीन दूषित है जो प्रतिबंध एंजाइम पाचन के साथ हस्तक्षेप कर सकता है। या तो डीएनए नमूना को फिर से अलग करने की आवश्यकता होती है, या प्रोटीन के कश्मीर पाचन और फिनोल से प्रोटीन को हटाया जाना जरूरी होता है: क्लोरोफॉर्म निकासी एथेनॉल वर्षा के बाद। एक वाणिज्यिक डीएनए अलगाव किट का उपयोग नियमित रूप से डीएनए में एक 260/280 अनुपात 1.8-1.85 के साथ होता है।
फॉस्फोर स्क्रीन पर जेल के एक्सपोज़र के बाद, कोई टेलोमोएर टुकड़े नहीं पाया गया है। यह एक खराब रेडियो-लेबल वाले टेलोमरे जांच, अनुचित संकरण से हो सकता हैशर्तों या जीनोमिक डीएनए शुरू करने की अपर्याप्त मात्रा। जी -25 कॉलम के मध्यवर्तीकरण के अंत में, टेलोमरे जांच की तैयारी करते समय, प्रवाह-माध्यम (रेडियो-लेबल वाले टेल्मोरे जांच का प्रतिनिधित्व) में आसानी से रेडियोधर्मिता होनी चाहिए। यदि रेडियोधर्मिता का पता नहीं लगाया गया है, तो जांच की तैयारी के साथ एक समस्या थी यह सुनिश्चित करना भी महत्वपूर्ण है कि संकरण तापमान 42 डिग्री सेल्सियस से अधिक नहीं है (जांच को पिघलने से रोकने के लिए: टेम्पलेट कॉम्प्लेक्स) और संकरण बफर पूरी तरह से संकरण कक्ष में जेल को विसर्जित करता है। Detectable telomeres प्रदान करता है जो जीनोमिक डीएनए की न्यूनतम राशि 2.0-3.0 माइक्रोग्राम है। प्रारंभिक सामग्री की थोड़ी मात्रा संकरण के बाद कोई संकेत नहीं करने के लिए बहुत कमजोर हो सकती है।
इस प्रोटोकॉल को प्रत्येक टेलोमेरे लंबाई निर्धारण के लिए 2-3 μg की आवश्यकता है। यदि नमूने डुप्लिकेट या तीन गुणा में चलाना है, तो डीएनए की 6-12 माइक्रोग्राम की आवश्यकता है। यह वें रोकता है सीमित डीएनए मात्रा वाले नमूनों पर इस्तेमाल होने की प्रक्रिया है प्रक्रिया को पूरा करने के लिए 3-4 दिन की आवश्यकता होती है। एक समय में विश्लेषण किए गए नमूने की संख्या जेल वैद्युतकणसंचलन रिग की संख्या और agarose जेल कंघी के आकार तक सीमित है। नतीजतन, बड़ी संख्या में नमूनों (जैसे महामारी विज्ञान के अध्ययन) को नियोजित करने वाले अध्ययनों के लिए यह आदर्श से कम है।
गैल वैद्युतकणसंच से अलग होने वाले टेलोमेरेस के डीएनए संकरण तकनीक टेलोमरे की लंबाई निर्धारित करने के लिए स्वर्ण मानक बनी हुई है। कोई भी अन्य प्रक्रिया सीधे टेलोमरे की लंबाई को मापते हैं, जिसके परिणामस्वरूप वास्तविक टेलोमरे आकार होते हैं।
इस प्रक्रिया में कई महत्वपूर्ण कदम हैं। सबसे पहले, डीएनए नमूना में अच्छी निष्ठा होनी चाहिए, अर्थात् , वहन नहीं। डीएनए जो झिलमिलाहट होती है, परिणामस्वरूप झूठी टेलोमेरे लंबाई परिणाम हो सकते हैं। यह भी महत्वपूर्ण है कि डीएनए पाचन पूरी हो। जीनोमिक डीएनए का पाचन 800 बीपी या उससे कम के डीएनए धब्बा में होना चाहिए"Xref"> 2 उचित पाचन सुनिश्चित करने के लिए, कुछ प्रक्रियाओं ने कुल 6 प्रतिबंध एंजाइमों का वर्णन किया है (इस प्रक्रिया में बताए अनुसार सिर्फ आईएआई और एचआईएनएफ 1 के बजाय) अतिरिक्त प्रतिबंध एंजाइमों में हही, एमएसपीआई, हैईआईआई और अलूइ 2 शामिल हैं । एक दूसरा महत्वपूर्ण कदम agarose जेल को पचाने वाली डीएनए के उचित पृथक्करण के लिए पर्याप्त रूप से चलाने के लिए अनुमति देता है। यदि बेहतर जुदाई है, तो विश्लेषण में बेहतर परिशुद्धता है। जेल चलाने का समय काफी लंबा होना चाहिए ताकि 1 केपीपी का प्रतिनिधित्व करने वाले डीएनए टुकड़े जेल ( चित्रा 1 ) के नीचे स्थित हों। जेल आकार और वैद्युतकणसंचलन के वोल्टेज के आधार पर, यह 12 से 24 घंटे की आवश्यकता हो सकती है। एक तीसरा महत्वपूर्ण कदम संकरण है। जब ट्यूब क्षैतिज है, तो पूरे जेल में विसर्जित करने के लिए चैम्बर ट्यूब में पर्याप्त संकरण बफर होना चाहिए। संकरित बफर के अपर्याप्त स्तर के परिणामस्वरूप टेल्मोरे जांच के असमान संकरण हो सकते हैं।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
लेखकों ने पिट्सबर्ग कैंसर इंस्टीट्यूट की बायोबाहैवैयेशनल ऑन्कोलॉजी विश्वविद्यालय की सुविधा का समर्थन स्वीकार किया है जो कि पुरस्कार पी 30 सीए047 9 04 द्वारा भाग में समर्थित है
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biologics | |||
| Rsa1, restriction enzyme | New England Biolabs, Inc | R0167S | 10,000 U/mL, DNA digestion. Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer) |
| Hinf1, restriction enzyme | New England Biolabs, Inc | R0155S | 10,000 U/mL, DNA digestion. Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer) |
| Seakem GTG Agarose | Lonza | 50071 | electrophoresis grade agarose |
| Optikinase | affymetrix | 78334X 500 UN | T4 Polynucleotide Kinase |
| SYBR Green Nucleic Acid Stain I | ThermoFisher Scientific | S7567 | Syber Green |
| exactGene DNA Ladder 24- kB | Fisher Scientific | BP2580100 | |
| C-Strand Probe (3'-(G3AT2)4-'5) | Integrated DNA Technologies | Custom ordered DNA oligonucleotide | |
| Gamma-ATP-P32 | Perkin Elmer | BLU502Z | Radioisotope |
| Qiagen Blood and Cell Culture DNA Mini Kit | Qiagen | 13323 | DNA extraction kit |
| GE Illustra Microspin G-25 column | GE Healthcare Life Sciences | 27-5325-01 | For purification of readioactive oligo probe |
| Ficoll 400 | non-ionic synthetic polymer | ||
| Equipment/Software | |||
| Owl A5 Gel electrophoresis system (20 cm x 25 cm) | ThermoFisher Scientific | A5 | Gel electrophoresis |
| Horizon 11.4 Gel electrophoresis system (11 cm x 14 cm) | Corel Life Sciences | 11068020 | Gel electrophoresis |
| Nylon mesh, 50, 12" x 12" | Ted Pellam, Inc | 41-12105 | |
| GE Storage Phosphor Screens | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-75 | |
| Phosphor Screen Exposure Cassette | GE Healthcare Life Sciences | 63-0035-44 | |
| Isotemp Hybridzation Incubator | Fisher Scientific | 13-247-20Q | |
| Cylindrical hybridization tubes | Fisher Scientific | 13-247-300 | |
| The Belly Dancer orbital shaker | Sigma-aldrich | Z768499-1EA | Orbital shaker |
| Typhoon 9400 | ABI | For imaging of gels and phosphor screens | |
| GraphPad Prism 6 | GraphPad | Version 6.05 | Graphing Program |
| Microsoft Excel | Microsoft | Office 365 | Spreadsheet program |
| Nanodrop | Thermo Scientific | Nanodrp 2000 | Spectrophotometer |
References
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