Anvendelse av automatisert bildestyrt patchklemme for studiet av nevroner i hjernesnitt

Summary

Denne protokollen beskriver hvordan du utfører automatiske bildestyrte patch-clamp-eksperimenter ved hjelp av et system som nylig ble utviklet for standard in vitro- elektrofysiologi-utstyr.

Abstract

Hele-celle patch klemme er gull-standard metoden for å måle de elektriske egenskapene til enkeltceller. In vitro patch clamp forblir imidlertid en utfordrende og lav gjennomstrømmingsteknikk på grunn av sin kompleksitet og høye tillit til brukernes bruk og kontroll. Dette manuskriptet demonstrerer et bildestyrt automatisk patch clamp system for in vitro full-celle patch clamp eksperimenter i akutt hjerneskiver. Vårt system implementerer en datasynbasert algoritme for å detektere fluorescensmerkede celler og målrette dem for fullautomatisk patching ved hjelp av en mikromanipulator og intern pipettrykkkontroll. Hele prosessen er svært automatisert, med minimal krav til menneskelig inngrep. Realtids eksperimentell informasjon, inkludert elektrisk motstand og intern pipettrykk, dokumenteres elektronisk for fremtidig analyse og for optimalisering til forskjellige celletyper. Selv om vårt system er beskrevet i sammenheng med akutt braiN skiveopptak, kan den også brukes på den automatiserte bildestyrte patchklemmen av dissocierte nevroner, organotype skivekulturer og andre ikke-neuronale celletyper.

Introduction

Låsklemmeteknikken ble først utviklet av Neher og Sakmann på 1970-tallet for å studere ioniske kanaler med eksepsjonelle membraner ¹ . Siden da har patch clamping blitt anvendt på studiet av mange forskjellige fag på cellulær, synaptisk og kretsnivå - både in vitro og in vivo - i mange forskjellige celletyper, inkludert nevroner, kardiomyocytter, Xenopus oocytter og kunstige liposomer ² . Denne prosessen innebærer riktig identifisering og målretting av en celle av interesse, intrikat mikromanipulator-kontroll for å flytte patchpipetten i nærheten av cellen, påføring av positivt og negativt trykk til pipetten i riktig tid for å etablere en tett gigasepatch, Og en innbrudd for å etablere en full-celle patch-konfigurasjon. Patch klemming utføres typisk manuelt og krever omfattende trening for å mestre. Selv for en forsker som har erfaring med oppdateringenKlemme er suksessraten relativt lav. Mer nylig har det blitt gjort flere forsøk på å automatisere patch-clamp-eksperimenter. To hovedstrategier har utviklet seg til å oppnå automatisering: Forbedre standard patch clamp utstyr for å gi automatisk kontroll over patching prosessen og utforming av nytt utstyr og teknikker fra grunnen opp. Den tidligere strategien kan tilpasses eksisterende maskinvare og kan brukes i en rekke patch clamp applikasjoner, inkludert in vivo blind patch klemme ^{3 , 4 , 5} , in vitro patch clamp av akutte hjerneskiver, organotypiske skive kulturer og dyrket dissocierte neuroner ⁶ . Det gjør det mulig å forhøre komplekse lokale kretser ved å bruke flere mikromanipulatorer samtidig ⁷ . Den platte patchmetoden er et eksempel på den nye utviklingsstrategien, som kan oppnå høy gjennomstrømning samtidig pAtch klemme av celler i suspensjon for medikament screening formål ⁸ . Den platte patch-metoden gjelder imidlertid ikke for alle celletyper, særlig nevroner med lange prosesser eller intakte kretser som inneholder omfattende forbindelser. Dette begrenser søknaden til kartlegging av det intrikate kretsløpet i nervesystemet, noe som er en viktig fordel ved tradisjonell patch clamp-teknologi.

Vi har utviklet et system som automatiserer manuell patch clamp prosessen in vitro ved å øke standard patch clamp maskinvare. Vårt system, Autopatcher IG, gir automatisk pipettkalibrering, identifisering av fluorescerende celle, automatisk styring av pipettbevegelse, automatisk helcellepatching og datalogging. Systemet kan automatisk skaffe flere bilder av hjerneskiver på forskjellige dybder; Analysere dem ved hjelp av datasyn Og ekstrahere informasjon, inkludert koordinatene til fluorescensmerkede celler. Denne informasjonen kan da væreBrukes til å målrette og automatisk lappe celler av interesse. Programvaren er skrevet i Python-et fritt, åpen kildeprogrammeringsspråk - ved hjelp av flere open source-biblioteker. Dette sikrer sin tilgjengelighet til andre forskere og forbedrer reproduserbarheten og rigoriteten til elektrofysiologiske eksperimenter. Systemet har en modulær design, slik at ekstra maskinvare enkelt kan knyttes til det nåværende systemet som er vist her.

Protocol

1. Systemoppsett

1. Konstruer trykkregulatoren.
   1. Monter trykkregulatoren i henhold til kretskartet ( Figur 1 ). Løs de nødvendige delene på det trykte kretskortet (PCB) produsert i henhold til de elektriske kretsschemaene ( figur 1b ). Bruk standardmotstander, lysdioder, metall-oksid halvlederfelt-Eeffect-transistorer (MOSFET), kondensatorer og kontakter (se Materialetabellen ). Loddemålerventiler på PCB. Koble luftpumpen og lufttrykksensoren til PCB med elektrisk ledning.
      MERK: Det bør ta ca 2 timer å konstruere trykkregulatoren med alle nødvendige deler tilgjengelig.
2. Koble det sekundære datafangstkortet (DAQ).
   1. Koble datautgangene fra det trykte kretskortet til DAQ-kortet, etter tabell 1 .
      MERK: DAQ-styret wilJeg kjører i "Single-ended mode". Portkartet finnes i brukerhåndboken (se Materialetabellen ).
   2. Koble "AIn Pr S" til en av analoge inngangs (AI) kanaler og "R-Gr" til en av de analoge grunnene på det sekundære DAQ-kortet.
   3. Koble den primære utgangen fra forsterkeren til en av AI-kanalene og bakken til den analoge bakken på det sekundære DAQ-kortet.
      MERK: En standard BNC-kabel kan brukes til å koble til primærutgangen fra forsterkeren.
   4. Strip den andre enden og koble det positive signalet ( dvs. kobberkjernen) til AI-kanalen og bakken ( dvs. den tynne ledningen rundt kjernen) til den analoge bakken. Gjenta dette trinnet for en andre kanal hvis flere enn en oppdateringskanal brukes.
      MERK: Den analoge inngangen til DAQ-kortet vil bli konfigurert i senere trinn.
   5. Koble strøm til strømutgangen på det sekundære DAQ-kortet. Bruk en separat 12 V strøm såUrce for pumpen.
3. Koble slangen.
   1. Koble luftpumpen og de to ventilene i henhold til tabell 2 . Bruk en 3-veis kontakt for å koble det myke slangen fra ventil 2-toppporten, trykksensoren og pipettholderen i det siste trinnet.
   2. Legg til en annen 3-veis kontakt til slangen som er koblet til pipettholderen hvis to pipetter brukes. Bytt manuelt mellom ventiler og pipetter som brukes når de lappes.
4. Installer Autopatcher IG.
   MERK: Systemkrav: Autopatcher IG ble bare testet på en PC som kjører Windows 7. Det er ikke validert for andre operativsystemer. Den beskrevne prosedyren gjelder spesielt for maskinvaren som er oppført i Materialetabellen.
   1. Last ned Autopatcher-IG fra GitHub (https://github.com/chubykin/AutoPatcher_IG).
   2. Installer Python (se Materialebeskrivelsen for versjonen og nedlastingsadressen).
   3. Avinstaller PyQt4Bibliotek ved å skrive "pip avinstallere PyQt4" i en kommandolinjeterminal.
      MERK: Systemet bruker en eldre versjon av PyQt4-biblioteket for å oppnå kompatibilitet med Qwt og Opencv-bibliotekene.
   4. Installer Python-biblioteker fra historiske hjulfiler (http://www.lfd.uci.edu/~gohlke/pythonlibs/). Finn følgende filer: Numpy (pymc-2.3.6-cp27-cp27m-win32.whl), Opencv (opencv_python-2.4.13.2-cp27-cp27m-win32.whl), Pyqt (PyQt4-4.11.4-cp27-none -win32.whl) og Qwt (PyQwt-5.2.1-cp27-none-win32.whl).
      1. For å installere hjulfilene, gå til katalogen hvor filene er lagret og skriv "pip install *** wheelfilename ***. Whl." Erstatter "*** wheelfilename ***" med det faktiske navnet på filen.
         MERK: "cp27" i hjulfilnavnet indikerer Python 2.7 og "win32" angitt Windows 32-bit. Hvis "win32" ikke fungerer, kan du prøve "win64".
   5. For å kontrollere CCD-kameraet, last ned og installer installasjonsprogrammetFor 64-biters (https://www.qimaging.com/support/software/). Last ned MicroManager for 64-bit (https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release) for å kontrollere kameraet i Python.
   6. For å kontrollere manipulatorene og mikroskopetrinnet, installer kontrollprogramvare levert av produsenten.
      MERK: Ved å gjøre dette er driveren som er nødvendig for å kontrollere manipulatorene, også installert. Installasjonspakken leveres vanligvis på en CD-ROM.
   7. For å kontrollere det sekundære DAQ-kortet, installer Universellbiblioteket fra CD-ROM, som følger med kjøp av DAQ-kortet.
5. Konfigurer maskinvaren til Autopatcher IG.
   1. Koble mikroskopetrinnet og manipulatorstyrerne til datamaskinen via USB-porter.
   2. Tilordne COM-portnumre til enhet 0: mikroskopfase, enhet 1: venstre manipulator og enhet 2: høyre manipulator, i denne rekkefølgen, i "ports.csv" -konfigurasjonsfilen i "konfigurasjonsmappen". LEave de andre parameterne i ports.csv filen ( dvs. "SCI" ​​og "1") uendret.
      MERK: COM-portnummerinformasjonen kan bli funnet ved å kjøre programvarekonfigurasjonsprogramvaren fra produsenten. Gå til fanen "Innstillinger", velg "Innstillinger" og "Bevegelses" -siden, og les etikettene for hver kategori øverst. Alternativt kan denne informasjonen finnes i PC Enhetsbehandling.
   3. Tilordne analoge inngangskanalnumre på DAQ-kortet for en trykksensor og patchkanal 1 og 2 (tilsvarende enhet 1 og 2). Skriv inn kanalnummeret i "DAQchannels.csv" -filen i "konfigurasjonsmappen".
      MERK: Det anbefales å åpne .csv-filene med Notisblokk-applikasjonen i stedet for et regneark, da det kan endre informasjonen når du lagrer endringer.
6. Kjør Autopatcher IG.
   1. Slå på forsterkeren, mikroskopkontrolleren og manipulatorkontrolleren. ensuAt forsterkerprogramvaren kjører.
   2. Kjør Autopatcher IG med Python fra en kommandolinjeterminal som følger: Først, endre katalogen (kommandoen "cd" for de fleste vanlige terminaler) der Autopatcher IG er installert, skriv "python Autopatcher_IG.pyw" i kommandolinjeterminalen, og trykk på "Enter" -tasten.
      MERK: Ikke kjør manipulatorstyringsprogramvaren før du kjører Autopatcher IG fordi den vil besette mikroskopfasen og manipulatoren, slik at Autopatcher IG ikke kan finne maskinvaren. Manipulatorstyringsprogramvare kan kjøres etter at Autopatcher IG er fullt igangsatt dersom det er flere moduler som skal styres ( f.eks. Inlinevarmeren).
7. Kalibrere den primære pipetten.
   1. Trekk patchpipetter som beskrevet tidligere ⁹ . Fyll en dyp glasspipette med intern oppløsning og legg den på hodetrinnet.
      MERK: Tomme glasspipetter har forskjellige kontraster underMikroskopet og kan føre til unøyaktig kalibrering.
   2. Flytt pipettespissen til mikroskopets visningsfelt og bring det i fokus. Hvis talltastaturet brukes til å flytte manipulatorene og / eller mikroskopstrinnet, oppdatere koordinatene ved å trykke "z" på tastaturet.
      MERK: Denne handlingen er ikke nødvendig hvis tastaturet (mikroskopfase: A / D - x-akse, W / S-y-akse, R / F-z-akse, manipulatorer: H / K-x-akse, J-y-aksen, O / L-z-akse, 1/2-enhedsnummer) brukes til å styre bevegelsen fordi koordinatene vil bli oppdatert i sanntid.
   3. Klikk på knappen "Start kalibrering" på hovedgrafikkgrensesnittet (GUI) for den tilsvarende enheten pipetten er lastet på ( Figur 2 ).
      MERK: Et popup-vindu vises når kalibreringen er ferdig.
      MERK: Kalibrering utføres automatisk, noe som tar ca. 3,5 min. Klikk på den samme knappen (byttet nå til "avbryt kalibrering" avFor å starte kalibrering) vil avbryte kalibreringsforsøket.
   4. Lagre kalibreringen ved å klikke på "Lagre kalibrering" nederst i hovedgruen (det sparer nåværende kalibrering for begge manipulatorer og kan lastes inn i fremtiden).
      MERK: Visningsfeltet under lav (4 eller 10X) og høy (40x) forstørrelse må justeres for sekundærkalibrering for å fungere riktig. Vennligst se bruksanvisningen til det optiske systemet som er i bruk for justeringsprosedyrene.

2. Automatisk patchklemme Prosedyre

1. Klargjør akutte hjernesnitt, som beskrevet tidligere ¹⁰ .
2. Klargjør glasspipetter for patch clamp.
3. Plasser en hjernesnitt i midten av opptakskammeret. Stabiliser skiven med en skivehold, eller "harpe".
4. Oppdag fluorescerende celle.
   1. Finn området av interesse under 4X-objektivet. Flytt mikroskopetrinnet ved å slå på cliCk-to-move ("CTM") -modus og klikk på midten av interessepunktet. Alternativt kan du bruke tastaturet til å flytte mikroskopetrinnet (A / D - x-akse, W / S-y-aksen, R / F-z-akse).
   2. Bytt til forstørrelseslinsen og juster fokuset ved å flytte mikroskopet i z-aksen, ved å bruke R / F på tastaturet.
      MERK: Det anbefales å justere vannbadnivået slik at brennpunktet under lav- og høy forstørrelseslinser er det samme eller lignende i z-aksen.
   3. Klikk på "Oppdag cellen" -knappen i hovedgrensesnitt-kolonnen, "Enhet 0." Hvis LED- eller laserlyskilden til oppsettet ikke kan styres av TTL-signalet, slår du på LED / laser manuelt. Et popup-vindu vil vises når celledeteksjonen er ferdig.
      1. Slå av lysdioden / laseren om nødvendig; En liste over cellekoordinater vises i GUI for "Minneposisjoner". Fjern uønskede celler fra listen ved å klikke på "X" -knappen ved siden av koordinatene.
      2. Alternativt, hvis målceller ikke er merket med fluorescens, klikker du på "Musemodus" i hovedgiren. Klikk på cellen av interesse; En gul prikk med et tall vil dukke opp på cellen, og koordinatene til cellen vil vises i GUI'en "Minneposisjoner".
5. Kalibrere sekundærpipetten.
   1. Fyll 1/3 av en glasspipett med intern oppløsning. Legg pipetten på pipettholderen festet til hodetrinnet.
   2. Bruk lav forstørrelse linse. Ta pipetten inn i synsfeltet og juster fokuset med tastaturet (H / K - x-akse, U / J-y-akse, O / L-z-akse). Bruk "1" og "2" for å bytte mellom enhet 1 og enhet 2.
   3. Last inn den primære kalibreringen ved å klikke på "Last inn kalibrering". Klikk på knappen "Sekundær kalibrering" på hovedgiren under enheten som er i bruk. For eksempel, hvis enhet 2 er i bruk, klikk på "Sekundær kalibrering" -knappen i "Unit 2" column. Følg instruksjonene i popup-vinduet for å bytte til forstørrelseslinsen.
6. Patch en målcelle.
   1. Pass på at programvaren "MultiClamp" ( dvs. forsterker) kjører. Klikk på "Patch control" -knappen for å åpne "Patch control" GUI; Det kan ta opptil noen få minutter å åpne denne GUI.
   2. Bruk 40X forstørrelseslinsen ved å sjekke "40X" på hovedgrensesnittet "Unit 0". Klikk på "gå til" -knappen ved siden av cellen av interesse på koordinatlisten i GUI; Mikroskopet vil flytte til cellen.
   3. Klikk på CTM-knappen på enheten som brukes i hovedgiren for å aktivere bevegelse etter et museklikk. Klikk på cellen av interesse; Pipettespissen vil flytte til cellen.
   4. Klikk på "Patch" -knappen på "Patch Control" GUI.
      MERK: Automatisk patching begynner, og trykket og motstanden kan overvåkes"Patch control" GUI.
      1. Bruk "Unit 1 selected" -knappen til å bytte inngangssignal mellom de to enhetene.
         MERK: Systemet vil nærme målcellen, anvende negativt trykk, matche cellemembranpotensialet og oppdage gigaseformasjon basert på en rekke trykk- og motstandstærskler og logikk.
      2. Manipuler den automatiske prosessen til enhver tid ved å klikke på de respektive knappene på "Patch control" GUI. For eksempel, klikk på "Patch" -knappen igjen for å avbryte patchforsøk og klikk på "Neste trinn" for å fremme patchingprosessen til neste trinn, uavhengig av grensen.
         MERK: Et popup-vindu vil varsle brukeren når en gigaseal har dannet seg, og muligheten til å bruke zap sammen med stort negativt trykk vil bli presentert.
   5. Velg "Ja" for å bryte inn med kombinert zap og sug. Alternativt, velg "Nei" for å bryte inn med sugekraft.
      
   6. Lagre eksperimentoppdateringsloggen.
      MERK: Hvis et patchingforsøk ikke lykkes, vil et popup-vindu varsle brukeren, og oppdateringsprosessen vil nullstille.
   7. Gå tilbake til trinn 2.4 og gjenta trinnene med en annen celle.
7. Avgrens patching terskler (valgfritt).
   MERK: Terskelverdier for det opprinnelige pipettmotstandsintervallet, positivt og negativt trykk, gigaseal motstand, etc. Kan endres fra en konfigurasjonsfil.
   1. Åpne filen "PatchControlConfiguration.csv" i "Konfigurasjon" -mappen på destinasjonen der systemet er installert. Endre tallene som tilsvarer hver terskelverdi. Ikke endre navnene på verdiene; Dette vil resultere i uigenkjenne oppføringer i systemet.
   2. Implementer de nye terskelverdiene umiddelbart ved å trykke på "CtRl + l "uten å starte programmet på nytt; omstart av programmet vil implementere den nyeste terskelverdien fra filen.

3. Utføre opptak

MERK: Modusen i den datamaskinstyrte mikroelektrodeforsterkeren settes automatisk til Current Clamp ("IC") av autopatcher-programvaren når en vellykket oppdatering er oppnådd. Hele-celle patch clamp opptak kan gjøres ved hjelp av valgfri opptaksprogramvare (dette systemet inkluderer ikke en opptaksfunksjon). Hvis flere målceller ble identifisert, etter å ha fullført et opptak, gå tilbake til trinn 2.4 og prøv en annen celle.

1. Utfør automatiske lokale legemiddelapplikasjonseksperimenter ved hjelp av en picospritzer (valgfritt).
   MERK: Her brukes et lokalt legemiddelapplikasjonseksperiment som et eksempel for å beskrive hvordan du bruker den ekstra "Command Sequence" -funksjonen til å kontrollere ekstern maskinvare gjennom TTL-signaler.
   1. Koble port A chaNnel 0 og bakken på det sekundære DAQ-kortet til startutløseren på digitaliseringsenheten ved hjelp av en fjernet BNC-kabel (som beskrevet i trinn 1.2.3). Koble en digital utgangskanal på digitizer til den eksterne utløseren på picospritzeren.
   2. Forbered picospritzeren i henhold til brukerhåndboken. Koble picospritzer-luftutgangen til pipetteholderen med narkotika-puffen festet til en mikromanipulator.
   3. Legg en pipette fylt med et stoff av valg. Fest den til pipettholderen. Kalibrere pipetten, som beskrevet i trinn 1.7.
   4. Etter å ha latt opp en celle som beskrevet i trinn 2.6, velg ønsket sted for narkotikafremstilling ved å klikke med musen i kameravisningen GUI under "musemodus" (byttet fra hoved-GUI). Alternativt kan du bruke "Grid" GUI til å designe et rutenett, med hver piksel i rutenett som en av målplasseringene.
      MERK: Gitteret kan manipuleres i GUI for kameravisningen ved å dra med musen.
   5. I "Command SequEnce "GUI, velg manipulatorenheten som narkotikapipetten er montert på. Klikk på" Last inn musepunkter "eller" Last rutenett "for å importere alle koordinater for levering av narkotika.
      1. Klikk på hver koordinatoppføring for å redigere det spesifikke TTL-signalet i den høyre kolonnen. I den første kommandostatusen klikker du på høyre siffer for å slå den fra "0" til "1", og sender et + 5-V TTL-signal. Still inn tiden (T) til ønsket TTL-signalvarighet, i ms.
      2. I den andre kommandostatusen, sett alle siffer til "0" og sett T til varigheten av opptakslengden på prøveperioden. Rediger kommandoer for alle koordinatoppføringer. Legg til kommandooppføringer ved å klikke på "+" hvis flere TTL-signaler er nødvendige.
         MERK: De 8-sifrede bitene representerer port A-kanaler 0-7 på sekundær DAQ (portene 1 - 3 er opptatt av pumpen og to ventiler) kan slås om nødvendig.
   6. Lag en opptaksprotokoll i datainnsamlingsmodulen slikAt starten på et feie utløses av den eksterne startutløseren. Rediger protokollen for å levere stoffet til ønsket tidspunkt.
   7. I "Command Sequence" GUI, klikk "Kjør" til venstre for å kjøre alle koordinater. Alternativt klikker du "Kjør" til høyre for å kjøre bare den valgte sekvensen.
      MERK: pipetten flytter til hver koordinat og utfører TTL-signalet som definert for å starte opptakssvep.

Representative Results

Vårt system har blitt testet på sin evne til å lappe celler i akutte hjerneskiver, mus-induserte pluripotente stamceller (iPSCs) differensiert til nevroner, og HEK 293-celler kunstig uttrykker kanaler av interesse. Figur 3 viser et eksperiment ved bruk av Thy1-ChR2-YFP-transgene mus (B6.Cg-Tg (Thy1-COP4 / EYFP) 18Gfng / J) rettet mot fluorescensmerket lag 5 pyramidale nevroner i den visuelle cortex. Målcellen var en av de automatisk identifiserte grønne fluorescerende positive cellene ( figur 3b ). Figur 3a er differensial interferens kontrast (DIC) bildet av patched neuron. Hele cellekonfigurasjonen ble oppnådd ved hjelp av den automatiske patchprotokollen i trinnene 2.5 - 2.6 og ble validert ved trinnstrøm injeksjonsinducerte virkningspotensialer ( figur 3c )

1 "> For å demonstrere den ekstra" Command Sequence "-funksjonen, leverte vi 500 mM KCl i 200 ms til tre steder på en hjerneskive mens du la en celle ( figur 4 ). Først valgte vi 3 steder på hjerneskiven: en nær Til den patched cellekroppen og to langt borte fra den patched cellen. Koordinatene ble lagret i GUI for "Memory Positions". Koordinatene ble lastet til "Command Sequence" GUI under "Unit1", som var manipulatoren at KCl- Vi satt kommandoene i den venstre kolonnen for å sende et + 5-V TTL-signal for 500 ms, etterfulgt av 0 V i 10 s ( figur 4a ) fra port A-kanal 0 på sekundær DAQ-kort, Som var koblet til digitizer "start trigger" -inngangen. Figur 4c viser at den patched cellen var en vanlig spiking-neuron. Doseringsapplikasjonspipetten (Unit 1) traverserte de tre valgte stedene aUtomatisk ( figur 4b ), og vi registrerte 10 s for hver applikasjon under spenningsklemme ( figur 4d ). Fargen på sporene i figur 4d tilsvarer grensen farge i figur 4b . Når KCl ble puffet i cellen, ble det observert en stor innadgående strøm, som sakte redusert som KCl diffust. Rødt fluorescerende fargestoff ble tilsatt til KCl-oppløsningen for å indikere den romlige fordeling av medikamentlevering og ble avbildet ved bruk av kombinert DIC- og epifluorescerende bildebehandling. Dette eksperimentet illustrerte enkelheten og fleksibiliteten til systemet vårt for å kontrollere manipulator / mikroskopbevegelse og ekstern maskinvare gjennom TTL-signaler.

Figur 1. Trykkkontrollenhet. A: Kretskort (PCB) for tilkobling av ventiler, trykkSensor og luftpumpe. Til venstre vises detaljer på PCB, merking av utganger som er nevnt i protokollen. Retten viser forbindelsen mellom PCB og luftpumpe, USB-port og rør. B: Kretskort for PCB. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2. Autopatcher GUI. Knappene nevnt i protokollen vises i røde firkanter og er nummerert. 1: Start kalibrering, 2: Lagre kalibrering, 3: Lastkalibrering, 4: Sekundær kalibrering, 5: Oppdag celle, 6: Patchkontroll, 7: Gå til (målcellekoordinat) og 8: Patch. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3. Et eksempel på den plakkede ChR2-YFP-positive cellen. A: 40X forstørrelse under DIC optikk. B: Epifluorescens-bilde av samme celle i panel A (LED-belysning ved 488 nm). C: Klemmeopptak fra den patched cellen under en serie av hyperpolariserende og depolariserende trinnstrøms injeksjoner. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4. Gjennomføring av et automatisert leveringseksperiment. A: Utvalgte steder lastet til "Kommandosekvens" GUI. Den venstre kolonnen viserListen over koordinater og den høyre kolonnen viser listen over kommandoer i form av TTL-signaler for hvert sted. B: Skjermbilder under legemiddelapplikasjonseksperimentet som svarer til de tre valgte stedene. Enhet 1 var den KCl-holdige pipetten og enhet 2 var patchingpipetten. KCl-oppløsningen ble blandet med rødt fluorescerende fargestoff med det formål å visualisere. Bilder ble oppnådd ved å kombinere DIC og fluorescensbilder. C: Trinnstrøm injeksjoner som viser en vanlig spiking nevron. D: Spenningsklemmeopptakspor fra lokal applikasjon av 500 mM KCl-oppløsning på tre steder. Det røde sporet med innadgående strøm ble registrert fra forsøket da KCl-applikasjonen var nær den patched cellen. Den røde pilen indikerer tidspunktet for KCl-søknaden. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Outlet på PCB	Portnavn på DAQ-styret	Port # på DAQ board	Bemerke
DOUT V1	Port A kanal 1	22	Kontrollventil 1
DOUT V2	Port A kanal 2	23	Kontrollventil 2
DOUT P	Port A kanal 3	24	Kontroller luftpumpe
Gr	Bakke	29	Bakke

Tabell 1. Kretskort (PCB) til konfigurasjon av sekundær datainnsamling (DAQ). Bruk denne tabellen for å koble til PCB-utganger (første kolonne fra venstre) til porter på DAQ-kortet (andre kolonne fra venstre). Portnavnet og nummeret på den sekundære DAQ refererer til enkeltstående modus.

Tabell 2. Slangeforbindelser fra trykkreguleringsenheten til pipettholderen (e). For hver tilkobling, koble til tilsvarende porter, uthevet med en grå boks, ved hjelp av myke slanger (se Materialebordet ).

Discussion

Her beskriver vi en metode for automatiske bildestyrte patch clamp-opptak in vitro . Nøkkeltrinnene i denne prosessen er oppsummert som følger. For det første blir datasynet brukt til å gjenkjenne pipettespissen automatisk ved hjelp av en serie bilder som er kjøpt via et mikroskop. Denne informasjonen brukes da til å beregne koordinattransformasjonsfunksjonen mellom mikroskop og manipulator koordinatsystemer. Datasyn er brukt til å automatisk detektere fluorescensmerkede celler og å identifisere koordinatene sine. Disse trinnene er integrert med pipettmålretting og den automatiske patchingalgoritmen ved hjelp av åpen kildekode Python programmeringsspråk, PyQT og OpenCV-biblioteker.

Sammenlignet med eksisterende in vitro patch clamp metoder, dette systemet gir betydelige forbedringer på de ulike områdene. Det minimerer menneskelig intervensjon. Dette systemet automatiserer de fleste trinnene i patch clamp-eksperimentet, minimerer reqUirement for menneskelig inngrep. Noen av de gjenværende manuelle trinnene, inkludert bytte mellom lav- / høy forstørrelsesmikroskoplinser, kan automatiseres ved hjelp av ekstra motorisert maskinvare.

Patch-klemmetoden forbedrer gjennomstrømningen. Patch-clamp-eksperimenter som bruker dette systemet oppnådde høyere suksessfrekvenser og kortere tider for hvert forsøk, noe som bidro til en betydelig økning i total gjennomstrømning. Datasynsalgoritmen for deteksjon av fluorescerende celler og pipettespiss er meget robust, og feilfrekvensen var svært lav. Gjennomsnittlig feil for pipettespiss deteksjon var 1,6 μm, og den falske positive frekvensen for fluorescerende celledeteksjon var 4,9% ± 2,25%. En detaljert sammenligning mellom tradisjonell manuell patching og automatisk patching har blitt gjort ⁶ .

Detaljert dokumentasjon av eksperimenter er mulig. Patchlogger for hvert forsøk kan lagres og analyseres etter hvert . Slike detaljertDokumentasjon var ikke tidligere tilgjengelig for manuell patching. Dette muliggjør systematisk analyse av patchingforsøk i unike eksperimentelle forhold, celletyper, arter og skivepreparater.

Denne metoden viser kompatibilitet med standard in vitro patch clamp utstyr. Vårt system, som demonstrert i dette manuskriptet, er utviklet for å øke eksisterende in vitro patch clamp rigger, noe som gir dem kapasitet til å utføre automatisk patching. I motsetning til den planlagte patch-tilnærmingen, er dette systemet egnet for laboratorier som allerede utfører manuell patch-klemme for å konvertere utstyret til minimal kostnad. Samtidig er det fortsatt mulighet til å lappe manuelt eller semi-automatisk ved hjelp av det samme systemet.

På grunn av tilpasningsevnen til systemet nevnt ovenfor, kreves tilkobling av maskinvaren og konfigurering av programvaren av eksperimentet når systemet settes opp for første gang. Det kan oppstå problemerFra feil portoppgave og utilstrekkelige driverbiblioteker for kontroll av bestemt maskinvare. Vennligst se trinn 1.2 - 1.4 ved feilsøking.

Sammenlignet med delvis automatisering av eksisterende systemer, oppnår dette systemet det maksimale automatiseringsnivået i den konvensjonelle in vitro patch-klemmen av akutte hjerneskiver (og andre in vitro preparater). Dette gjelder for alle trinn, fra celleoppdagelse til pipettkalibrering til patching ^{7 , 11} . Den eneste flaskehalsen er den manuelle prosessen med å fylle og bytte patchpipettene mellom stier. Nylige utviklinger i gjenbruk av patchpipetter kan potensielt løse dette problemet ¹² . I tillegg til kvaliteten på skiveforberedelsen kommer den vanligste årsaken til mislykkede forsøk ut fra manipulatoriske mekaniske feil og bevegelsen av skiven i kammeret. Disse begrensningene er utenfor vår kontroll iNåværende system. Det gjøres innsats for å implementere nærliggende, sanntidsdetektering og kontroll av pipettbevegelse for å ta hensyn til dette problemet.

For fremtidig utvikling er vi interessert i å utvide dagens fluorescerende deteksjonsfunksjoner til generell celle deteksjon under DIC optikk.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CCD Camera	QImaging	Rolera Bolt
Electrophysiology rig	Scientifica	SliceScope Pro 2000	Include microscope and manipulators. The manufacturer provided manipulator control software demonstrated in this manuscript is “Linlab2”.
Amplifier	Molecular Devices	MultiClamp 700B	computer-controlled microelectrode amplifier
Digitizer	Molecular Devices	Axon Digidata 1550
LED light source	Cool LED	pE-100	488 nm wavelength
Data acquisition board	Measurement Computing	USB1208-FS	Secondary DAQ. See manual at : http://www.mccdaq.com/pdfs/manuals/USB-1208FS.pdf
Solenoid valves	The Lee Co.	LHDA0531115H
Air pump	Virtual industry	VMP1625MX-12-90-CH
Air pressure sensor	Freescale semiconductor	MPXV7025G
Slice hold-down	Warner instruments	64-1415 (SHD-40/2)	Slice Anchor Kit, Flat for RC-40 Chamber, 2.0 mm, 19.7 mm
Python	Anaconda	version 2.7 (32-bit for windows)	https://www.continuum.io/downloads
Screw Terminals	Sparkfun	PRT - 08084	Screw Terminals 3.5 mm Pitch (2-Pin)
(2-Pin)
N-Channel MOSFET 60 V 30 A	Sparkfun	COM - 10213
DIP Sockets Solder Tail - 8-Pin	Sparkfun	PRT-07937
LED - Basic Red 5 mm	Sparkfun	COM-09590
LED - Basic Green 5mm	Sparkfun	COM-09592
DC Barrel Power Jack/Connector (SMD)	Sparkfun	PRT-12748
Wall Adapter Power Supply - 12 V DC 600 mA	Sparkfun	TOL-09442
Hook-Up Wire - Assortment (Solid Core, 22 AWG)	Sparkfun	PRT-11367
Locking Male x Female x Female Stopcock	ARK-PLAS	RCX10-GP0
Fisherbrand Tygon S3 E-3603 Flexible Tubings	Fisher scientific	14-171-129	Outer Diameter: 1/8 in. Inner Diameter: 1/16 in.
BNC male to BNC male coaxial cable	Belkin Components	F3K101-06-E
560 Ohm Resistor (5% tolerance)	Radioshack	2711116
Picospritzer	General Valve	Picospritzer II