JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Biochemistry

MRNA Interactome Capture fra Plant Protoplasts

Published: July 28, 2017
doi:
10.3791/56011
, , ,
1Department of Biology,KU Leuven

Summary

Her præsenterer vi en interaktiv fangstprotokol anvendt på Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplaster. Denne metode afhænger kritisk af in vivo UV-tværbinding og muliggør isolering og identifikation af plante-mRNA-bindende proteiner fra et fysiologisk miljø.

Abstract

RNA-bindende proteiner (RBP'er) bestemmer skæbne for RNA'er. De deltager i alle RNA biogeneseveje og bidrager især til post-transkriptionel genregulering (PTGR) af messenger-RNA'er (mRNA'er). I de sidste par år er en række mRNA-bundne proteomer fra gær- og pattedyrcellelinier isoleret isoleret ved anvendelse af en ny metode kaldet "mRNA interactome capture", hvilket muliggør identifikation af mRNA-bindende proteiner (mRBP'er) Direkte fra et fysiologisk miljø. Fremgangsmåden består af in vivo ultraviolet (UV) tværbinding, nedtrængning og oprensning af messenger ribonucleoproteinkomplekser (mRNP'er) ved oligo (dT) perler og den efterfølgende identifikation af de tværbundne proteiner ved massespektrometri (MS). For nylig er der ved hjælp af samme metode blevet rapporteret flere plante mRNA-bundne proteomer samtidigt fra forskellige Arabidopsis vævskilder: ætiolerede frøplanter, bladvæv,Blad mesophyll protoplaster og dyrkede rodceller. Her præsenterer vi den optimerede mRNA interaktionsoptagelsesmetode til Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplaster, en celletype, der tjener som et alsidigt værktøj til forsøg, der omfatter forskellige cellulære analyser. Betingelserne for optimalt proteinudbytte indbefatter mængden af ​​startvæv og varigheden af ​​UV-bestråling. I det mRNA-bundne proteom opnået ud fra et middelforsøgsforsøg (10 7 celler) viste RBP'er at have RNA-bindingsevne sig at være overrepræsenteret, og mange nye RBP'er blev identificeret. Forsøget kan opskaleres (10 9 celler), og den optimerede metode kan anvendes til andre plantecelletyper og arter til at isolere, katalogisere og sammenligne mRNA-bundne proteomer i planter.

Introduction

Eukaryoter bruger flere RNA biogenese regulatoriske veje til at opretholde cellulære biologiske processer. Blandt de kendte typer af RNA er mRNA meget forskelligartet og bærer kodningskapaciteten af ​​proteiner og deres isoformer 1. PTGR-vejen styrer skæbnen for præ-mRNA'er 2 , 3 . RBP'er fra forskellige genfamilier styrer reguleringen af ​​RNA, og i PTGR styrer bestemte mRBP'er mRNA'er gennem direkte fysiske interaktioner, der danner funktionelle mRNP'er. Derfor er identifikation og karakterisering af mRBP'er og deres mRNP'er afgørende for forståelsen af ​​reguleringen af ​​cellulær mRNA-metabolisme 2. I de sidste tre årtier har forskellige in vitro- metoder – herunder RNA-elektroforetisk mobilitetsforskydning (REMSA) assays, systematisk udvikling af ligander ved eksponentielle berigelsesanalyser (SELEX) baseret på biblioteksafledte konstruktioner, RNA Bind-n-Seq (RBNS), radioaktivt mærket eller kvantitativtFluorescens-RNA-bindingsassays, røntgenkrystallografi og NMR-spektroskopi 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 – er blevet anvendt bredt til studier af RBP'er, hovedsageligt fra pattedyrceller. Resultaterne af disse undersøgelser af pattedyrs-RBP'er kan søges via den RNA-bindende Protein DataBase (RBPDB), som samler de offentliggjorte observationer 10 .

Selv om disse in vitro- metoder er kraftige værktøjer, bestemmer de de bundne RNA-motiver fra en given RNA-pool af sekvenser og er derfor begrænsede i deres evne til at opdage nye mål-RNA'er. Det samme gælder for beregningsstrategier for at forudse genomsamlede RBP'er, som er baseret på bevaring af proteinsekvens og struktur 15 . For at overvinde dette har en ny forsøgsmetode haS er etableret, der muliggør identifikation af RNA-motiverne, som en RBP af interesse interagerer med, såvel som til bestemmelse af den præcise placering af bindingen. Denne metode, der kaldes "tværbinding og immunpræcipitation" (CLIP), består af in vivo UV-tværbinding efterfulgt af immunpræcipitation 11 . Tidlige undersøgelser har vist, at fotoaktivering af DNA- og RNA-nukleotider kan forekomme ved excitation UV-bølgelængder større end 245 nm. Reaktionen gennem thymidin synes at være begunstiget (rang i rækkefølge af nedsat fotoreaktivitet: dT> dC> rU> rC, dA, dG) 12 . Ved anvendelse af UV-lys med en bølgelængde på 254 nm (UV-C) blev det observeret, at kovalente bindinger mellem RNA-nukleotider og proteinrester er skabt, når der kun er nogle få Ångstrømninger (Å). Fænomenet kaldes derfor "nullængde" tværbinding af RNA og RBP. Dette kan efterfølges af en streng rensningsprocedure Dyr med lille baggrund 13 , 14 .

En strategi komplementær til CLIP er at kombinere in vivo UV-tværbinding med proteinidentifikation for at beskrive RBPs landskab. Et antal sådanne genomfattede mRNA-bundne proteomer er blevet isoleret fra gærceller, embryonale stamceller (ESC'er) og humane cellelinier ( dvs. HEK293 og HeLa) under anvendelse af denne nye eksperimentelle tilgang, kaldet "mRNA interactome capture" 18 , 19 , 20 , 21 . Fremgangsmåden består af in vivo UV-tværbinding efterfulgt af mRNP-oprensning og MS-baseret proteomik. Ved at anvende denne strategi er mange nye "måneskinnende" RBP'er indeholdende ikke-canoniske RBD'er blevet opdaget, og det er blevet klart, at flere proteiner har RNA-bindende kapacitet end tidligere antaget"> 15 , 16 , 17. Anvendelsen af ​​denne metode giver mulighed for nye applikationer og evnen til at besvare nye biologiske spørgsmål ved undersøgelse af RBP'er. For eksempel har en nylig undersøgelse undersøgt bevarelsen af ​​det mRNA-bundne proteom (kernen RBP Proteom) mellem gær og humane celler 22 .

Plant RBP'er har allerede vist sig at være involveret i vækst og udvikling ( f.eks . I posttranskriptionel regulering af blomstringstid, cirkadianuret og genekspression i mitokondrier og chloroplaster) 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 . Desuden antages de at udføre funktioner i de cellulære processer, der reagerer på abiotiske påvirkninger ( f.eks. Kold, tørke, saLinitet og abscisinsyre (ABA)) 31 , 32 , 33 , 34 . Der er mere end 200 forudsagte RBP-gener i Arabidopsis thaliana- genomet, baseret på RNA-genkendelsesmotiv (RRM) og K-homologi (KH) domænesekvensmotiv; I ris er cirka 250 blevet noteret 35 , 36 . Det er bemærkelsesværdigt, at mange forudsagte RBP'er synes at være unikke for planter ( fx ingen metazoan orthologs til ca. 50% af forudsagte Arabidopsis RBP'er indeholdende et RRM-domæne) 35 , hvilket tyder på, at mange kan tjene nye funktioner. Funktionerne af de fleste forudsagte RBP'er forbliver ukarakteriserede 23 .

Isoleringen af ​​mRNA-bundne proteomer fra Arabidopsis- ætiolerede frøplanter, bladvæv, dyrkede rodceller og bladmemofylprotoplaster ved anvendelse afMRNA interaktionsoptagelse er for nylig blevet rapporteret 38 , 39 . Disse undersøgelser viser det stærke potentiale for systematisk katalogisering af funktionelle RBP'er i planter i nær fremtid. Her præsenterer vi en protokol for mRNA interactome capture fra planteprotoplaster ( dvs. celler uden cellevægge). Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplaster er den vigtigste type af bladcelle. De isolerede protoplaster tillader optimal adgang til UV-lys til cellerne. Denne celletype kan anvendes i assays, som transientt udtrykker proteiner til funktionel karakterisering 40 , 41 . Desuden er protoplaster blevet anvendt til adskillige andre plantecelletyper og arter 42 , 43 , 44 ( fx Petersson et al ., 2009; Bargmann og Birnbaum, 2010; og Hong et al ., 2012).

<P class = "jove_content"> Metoden omfatter i alt 11 trin ( Figur 1A ). Arabidopsis leaf mesophyll protoplaster isoleres først (trin 1) og efterfølgende UV-bestråles til dannelse af tværbundne mRNP'er (trin 2). Når protoplaster lyseres under denatureringsbetingelser (trin 3), frigives de tværbundne mRNP'er i lysis / bindingsbuffer og trækkes ned ved oligo-d (T) 25 perler (trin 4). Efter flere runder af strenge vasker renses mRNP'erne og analyseres yderligere. De denaturerede peptider af mRBP'er fordøjes af proteinase K, før de tværbundne mRNA'er renses, og RNA-kvaliteten verificeres ved hjælp af qRT-PCR (trin 5 og 6). Efter RNase-behandling og proteinkoncentration (trin 7) styres proteinkvaliteten ved SDS-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og sølvfarvning (trin 8). Forskellen i proteinbåndsmønstre kan let visualiseres mellem en tværbundet prøve (CL) og en ikke-tværbundet prøve (ikke-CL;Den negative kontrolprøve fra protoplaster, der ikke udsættes for UV-bestråling). Identifikationen af ​​proteiner opnås gennem MS-baseret proteomik. Proteinerne fra CL-prøven adskilles ved endimensionel polyacrylamidgelelektroforese (1D-PAGE) for at fjerne mulig baggrundsforurening, "in-gel fordøjes" til korte peptider under anvendelse af trypsin og renses (trin 9). Nano omvendt fase væskekromatografi koblet til massespektrometri (nano-LC-MS) tillader bestemmelse af mængden af ​​endelige proteiner i det mRNA-bundne proteom (trin 10). Endelig karakteriseres og identificeres de identificerede mRBP'er ved anvendelse af bioinformatisk analyse (trin 11).

Protocol

1. Arabidopsis Leaf Mesophyll Protoplast Isolation BEMÆRK: Arabidopsis leaf mesophyll protoplaster er i det væsentlige isoleret som beskrevet af Yoo et al ., 2007, med flere modifikationer 40 . Vækst af planter Sug ca. 200 Arabidopsis thaliana Col-0 økotype frø i steriliseret vand i 2 dage ved 4 ° C i mørke til stratificering. BEMÆRK: Dette antal frø er nok til en ikke-CL-prøve o…

Representative Results

Vi observerede en karakteristisk halo, der omgiver perlepellet i CL-prøven, i vaske trin 4.3 med vaskebuffer 2 ( Figur 1B ). Selvom det ikke er blevet undersøgt, kan dette fænomen sandsynligvis forklares ved interferensen af ​​tværbundne mRNP-komplekser med perleaggregering under magnetfangst, hvilket forårsager et mere diffust aggregat at danne. Det indikerer, at oligo-d (T) 25- perlefangsten var effektiv 14 . </p…

Discussion

Vi har med succes anvendt mRNA interactome capture, udviklet til gær og humane celler, til at plante blad mesophyll protoplaster. Blad mesofylceller er den vigtigste type af jordvæv i plantebladene. Den største fordel ved denne metode er, at den bruger in vivo tværbinding for at opdage proteinerne fra et fysiologisk miljø.

I denne protokol præsenterer vi primært en række optimerede forsøgsbetingelser ( fx antallet af protoplaster, der skal anvendes som udgangsmater…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi anerkender lab af prof. Joris winderickx, som gav UV-tværbindingsapparatet udstyret med den konventionelle UV-lampe. KG støttes af KU Leuvens forskningsfond og anerkender støtte fra FWO-tilskud G065713N.

Materials

REAGENTS
0.8 M Mannitol Sigma M1902-500G Primary isotonic Enzyme solution &
MMg solution
2M KCl MERCK Art. 4935 Primary isotonic Enzyme solution &
W5 buffer
0.2 M MES (pH 5.7)
(4-morpholineethanesulfonic acid)		 Sigma-aldrich M2933 Primary isotonic Enzyme solution,
W5 buffer &
MMg solution,
Filtration sterilization
Cellulase R10 Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. CELLULASE
“ONOZUKA”
R-10, 10 g		 Final isotonic enzyme solution
Macerozyme R10 Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. MACEROZYME R-10, 10g Final isotonic enzyme solution
10% (w/v) BSA
(Bovine Serum Albumin)		 Sigma-aldrich A7906-100G Final isotonic enzyme solution &
Filtration sterilization
1M CaCl2 Chem-Lab NV CL00.0317.1000 Final isotonic enzyme solution,
W5 buffer &
Digestion buffer
1M NaCl Fisher Chemical S/3160/60 W5 buffer
2M MgCl2 Sigma M8266-100G MMg solution
1M LiCl
(Lithium Chloride)		 Acros 199885000 Lysis/binding buffer,
Wash buffer 1,
Wash buffer 2 &
Low salt buffer
5% (w/v) LiDS
(Lithium Dodecyl Sulphate)		 Sigma-aldrich L4632-25G Lysis/binding buffer,
Wash buffer 1 &
Filtration sterilization
1M DTT
(Dithiothreitol)		 Thermo Fisher Scientific
Wash buffer 1 &
Wash buffer 2		 307866 Lysis/binding buffer,
1M Tris-HCl (pH 7.5) (Tris(hydroxymethyl)aminomethane, Hydrochloric acid S.G. (HCl)) Acros &
Fisher Chemical		 167620010 &
H/1200/PB15		 Lysis/binding buffer,
Wash buffer 1,
Wash buffer 2,
Low salt buffer &
Elution buffer
0.5 M EDTA (pH 8.0) (Ethylenediaminetetraacetic acid) Sigma-aldrich ED-500G Lysis/binding buffer,
Wash buffer 1,
Wash buffer 2,
Low salt buffer &
Elution buffer
Tween 20 MERCK 8.22184.0500 Regeneration of oligo-d(T)25 beads
0.1 M NaOH VWR PROLABO CHEMICALS 28244.295 Regeneration of oligo-d(T)25 beads
1X PBS (pH 7.4)
(Phosphate Buffered Saline)
containing
(NaCl; KCl; Na2HPO4; KH2PO4)		 Fisher Chemical, MERCK,
Sigma-aldrich & SAFC		 S/3160/60,
Art. 4935,
71640-250G &
60230		 Regeneration of oligo-d(T)25 beads
Proteinase K solution (2 μg/μL) Thermo Fisher Scientific 11789020 Protein digestion
Loading dye Invitrogen LC5925 SDS-PAGE
qPCR master mix Promega A6001 qRT-PCR assay
RNase Cocktail Thermo Fisher Scientific AM2286 RNA digestion
Methanol Sigma-aldrich 322415 Gel fixation and gel destaining
Acetic acid Sigma-aldrich 537020 Gel fixation and gel destaining
Coomassie Brilliant Blue R-250 Thermo Fisher Scientific 20278 Gel staining
1M NH4HCO3
(Ammonium bicarbonate)
 		 Sigma-aldrich 09830-500G Gel hydration &
Digestion buffer
CH3CN
(Acetonitrile)		 Sigma-aldrich 34851-100ML Gel dehydration &
Peptide dissolving solution
IAA
(Iodoacetic acid)		 Sigma-aldrich I4386-10G Alkylating agent
TFA
(Trifluoroacetic acid)		 Sigma-aldrich 302031-10X1ML Peptide dissolving solution
FA
(Formic acid)		 Sigma-aldrich 06554-5G Peptide extraction
Trypsin solution (6 ng/μL) Promega V5280 Digestion buffer
Name Company Catalog Number Comments
EQUIPMENT
Soil Peltracom LP2D Plant growth
Vermiculite 3 Sibli AS 05VERMICULIET Plant growth
Petri dish (150 x 20 mm) Sarstedt 82.1184.500 Carrier for protoplast suspension
0.22 μm filter Millipore SE2M229104 Homogenization of final isotonic enzyme solution
Razorblade Agar Scientific T585 Rosette leaf strips
35-75 μm nylon mesh SEFAR NITEX 74010 Protoplast suspension filtration
50 mL round bottom tubes Sigma-aldrich T1918-10EA Carrier for protoplast suspension
Hemocytometer
(Bürker hemocytometer)		 MARIENFELD 650030 Protoplast cell counting
UV crosslinking apparatus
(HL-2000 HybriLinker)		 UVP, LLC UVP95003101 in vivo UV crosslinking
UV lamp
(Sankyo-Denki G8T5)		 SANKYO
DENKI		 SD G8T5 in vivo UV crosslinking
50 mL glass syringe FORTUNA Optima Z314560 Homogenization of protoplast lysate
Narrow needle (0.9 x 25 mm) Becton Dickinson microlance 3 2021-04 Homogenization of protoplast lysate
Rotator Model L26 Labinco BV 26110912 Sample incubation by rotating
Oligo-d(T)25 magnetic beads
(5 mg/mL)		 New England BioLabs S1419S mRNPs and mRNAs binding and pull-down
Magnetic rack Invitrogen CS15000 mRNPs and mRNAs binding and pull-down
Centrifugal filter units
(Amicon Ultra-4 centrifugal filter units)		 EMD Millipore UFC800308 mRBP concentration
Pierce Silver Stain Kit Thermo Fisher Scientific 24612 Silver-staining assay
RNA purification kit
(InviTrap Spin Plant RNA Mini Kit)		 STRATEC Molecular 1064100300 RNA purification
Spectrophotometer device (NanoDrop 1000 Spectrophotometer) Thermo Fisher Scientific ND-1000 RNA quality and quantity
Real-Time PCR cycler
(StepOne Real-Time PCR cycler)		 Thermo Fisher Scientific 4376600 cDNA quantification
µ-C18 columns
(Millipore Zip Tip µ-C18 columns)		 Sigma-aldrich 720046-960EA Peptide purification
Mass spectrometer
(Q Exactive Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer)		 Thermo Fisher Scientific IQLAAEGAAPFALGMAZR Mass spectrometry-based proteomics
Liquid chromatography instrument (Ultimate 3000 ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC) instrument) Thermo Fisher Scientific ULTIM3000RSLCNANO Mass spectrometry-based proteomics
C18 column
(Easy Spray Pepmap RSLC C18 column)		 Thermo Fisher Scientific ES800 Mass spectrometry-based proteomics
C18 precolumn
(Acclaim Pepmap 100 C18 precolumn)		 Thermo Fisher Scientific 160321 Mass spectrometry-based proteomics
Name Company Catalog Number Comments
Primers for qRT-PCR assay Sequences
UBQ10 mRNA
(Li et al., 2014)		 Fw: AACTTTGGTGGTTTGTGTTTTGG
Rv: TCGACTTGTCATTAGAAAGAAAGAGATAA
18S rRNA
(Durut et al., 2014)		 Fw: CGTAGTTGAACCTTGGGATG
Rv: CACGACCCGGCCAATTA
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jankowsky, E., Harris, M. E. Specificity and nonspecificity in RNA-protein interactions. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (9), 533-544 (2015).
  2. Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation. FEBS Lett. 582 (14), 1977-1986 (2008).
  3. Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. A census of human RNA-binding proteins. Nat Rev Genet. 15 (12), 829-845 (2014).
  4. Lin, Q., Taylor, S. J., Shalloway, D. Specificity and determinants of Sam68 RNA binding. Implications for the biological function of K homology domains. J Biol Chem. 272 (43), 27274-27280 (1997).
  5. Deo, R. C., Bonanno, J. B., Sonenberg, N., Burley, S. K. Recognition of polyadenylate RNA by the poly(A)-binding protein. Cell. 98 (6), 835-845 (1999).
  6. Kattapuram, T., Yang, S., Maki, J. L., Stone, J. R. Protein kinase CK1 alpha regulates mRNA binding by heterogeneous nuclear ribonucleoprotein c in response to physiologic levels of hydrogen peroxide. J Biol Chem. 280 (15), 15340-15347 (2005).
  7. Patel, G. P., Ma, S., Bag, J. The autoregulatory translational control element of poly(A)-binding protein mRNA forms a heteromeric ribonucleoprotein complex. Nucleic Acids Res. 33 (22), 7074-7089 (2005).
  8. Song, J. K., McGivern, J. V., Nichols, K. W., Markley, J. L., Sheets, M. D. Structural basis for RNA recognition by a type II poly(A)-binding protein. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (40), 15317-15322 (2008).
  9. Lambert, N., Robertson, A., Jangi, M., McGeary, S., Sharp, P. A., Burge, C. B. RNA Bind-n-Seq: quantitative assessment of the sequence and structural binding specificity of RNA binding proteins. Mol Cell. 54 (5), 887-900 (2014).
  10. Cook, K. B., Kazan, H., Zuberi, K., Morris, Q., Hughes, T. R. RBPDB: a database of RNA-binding specificities. Nucleic Acids Res. 39, D301-D308 (2011).
  11. Konig, J., Zarnack, K., Luscombe, N. M., Ule, J. Protein-RNA interactions: new genomic technologies and perspectives. Nat Rev Genet. 13 (2), 77-83 (2012).
  12. Hockensmith, J. W., Kubasek, W. L., Vorachek, W. R., von Hippel, P. H. Laser cross-linking of nucleic acids to proteins. Methodology and first applications to the phage T4 DNA replication system. J Biol Chem. 261 (8), 3512-3518 (1986).
  13. Pashev, I. G., Dimitrov, S. I., Angelov, D. Crosslinking proteins to nucleic acids by ultraviolet laser irradiation. Trends Biochem Sci. 16 (9), 323-326 (1991).
  14. Castello, A., et al. System-wide identification of RNA-binding proteins by interactome capture. Nat Protoc. 8 (3), 491-500 (2013).
  15. Nagy, E., Rigby, W. F. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase selectively binds AU-rich RNA in the NAD(+)-binding region (Rossmann fold). J Biol Chem. 270 (6), 2755-2763 (1995).
  16. Hentze, M. W., Preiss, T. The REM phase of gene regulation. Trends Biochem Sci. 35 (8), 423-426 (2010).
  17. Nicholls, C., Li, H., Liu, J. P. GAPDH: a common enzyme with uncommon functions. Clin Exp Pharmacol Physiol. 39 (8), 674-679 (2012).
  18. Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell. 46 (5), 674-690 (2012).
  19. Castello, A., et al. Insights into RNA Biology from an Atlas of Mammalian mRNA-Binding Proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
  20. Kwon, S. C., et al. The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells. Nat Struct Mol Biol. 20 (9), 1122-1130 (2013).
  21. Mitchell, S. F., Jain, S., She, M., Parker, R. Global analysis of yeast mRNPs. Nat Struct Mol Biol. 20 (1), 127-133 (2013).
  22. Beckmann, B. M., et al. The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs. Nat Commun. 6 (10127), 1-9 (2015).
  23. Bailey-Serres, J., Sorenson, R., Juntawong, P. Getting the message across: cytoplasmic ribonucleoprotein complexes. Trends Plant Sci. 14 (8), 443-453 (2009).
  24. Quesada, V., Macknight, R., Dean, C., Simpson, G. G. Autoregulation of FCA pre-mRNA processing controls Arabidopsis flowering time. EMBO J. 22 (12), 3142-3152 (2003).
  25. Lim, M. H., et al. A new Arabidopsis gene, FLK, encodes an RNA binding protein with K homology motifs and regulates flowering time via FLOWERING LOCUS C. Plant Cell. 16 (3), 731-740 (2004).
  26. Hornyik, C., Terzi, L. C., Simpson, G. G. The spen family protein FPA controls alternative cleavage and polyadenylation of RNA. Dev Cell. 18 (2), 203-213 (2010).
  27. Stern, D. B., Goldschmidt-Clermont, M., Hanson, M. R. Chloroplast RNA metabolism. Annu Rev Plant Biol. 61, 125-155 (2010).
  28. Schmal, C., Reimann, P., Staiger, D. A circadian clock-regulated toggle switch explains AtGRP7 and AtGRP8 oscillations in Arabidopsis thaliana. PLoS Comput Biol. 9 (3), e1002986 (2013).
  29. Staiger, D. RNA-binding proteins and circadian rhythms in Arabidopsis thaliana. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 356 (1415), 1755-1759 (2001).
  30. Fischer, B., et al. NovoHMM: a hidden Markov model for de novo peptide sequencing. Anal Chem. 77 (22), 7265-7273 (2005).
  31. Kwak, K. J., Kim, Y. O., Kang, H. Characterization of transgenic Arabidopsis plants overexpressing GR-RBP4 under high salinity, dehydration, or cold stress. J Exp Bot. 56 (421), 3007-3016 (2005).
  32. Raab, S., Toth, Z., de Groot, C., Stamminger, T., Hoth, S. ABA-responsive RNA-binding proteins are involved in chloroplast and stromule function in Arabidopsis seedlings. Planta. 224 (4), 900-914 (2006).
  33. Liu, H. H., et al. Molecular cloning and characterization of a salinity stress-induced gene encoding DEAD-box helicase from the halophyte Apocynum venetum. J Exp Bot. 59 (3), 633-644 (2008).
  34. Wang, S. C., Liang, D., Shi, S. G., Ma, F. W., Shu, H. R., Wang, R. C. Isolation and Characterization of a Novel Drought Responsive Gene Encoding a Glycine-rich RNA-binding Protein in Malus prunifolia (Willd.) Borkh. Plant Mol Biol Report. 29 (1), 125-134 (2011).
  35. Lorkovic, Z. J., Barta, A. Genome analysis: RNA recognition motif (RRM) and K homology (KH) domain RNA-binding proteins from the flowering plant Arabidopsis thaliana. Nucleic Acids Res. 30 (3), 623-635 (2002).
  36. Ambrosone, A., Costa, A., Leone, A., Grillo, S. Beyond transcription: RNA-binding proteins as emerging regulators of plant response to environmental constraints. Plant Science. 182, 12-18 (2012).
  37. Frank, A., Pevzner, P. PepNovo: de novo peptide sequencing via probabilistic network modeling. Anal Chem. 77 (4), 964-973 (2005).
  38. Marondedze, C., Thomas, L., Serrano, N. L., Lilley, K. S., Gehring, C. The RNA-binding protein repertoire of Arabidopsis thaliana. Sci Rep. 6 (29766), 1-13 (2016).
  39. Reichel, M., et al. In Planta Determination of the mRNA-Binding Proteome of Arabidopsis Etiolated Seedlings. Plant Cell. 28 (10), 2435-2452 (2016).
  40. Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
  41. Niu, Y., Sheen, J. Transient expression assays for quantifying signaling output. Methods Mol Biol. 876, 195-206 (2012).
  42. Petersson, S. V., et al. An auxin gradient and maximum in the Arabidopsis root apex shown by high-resolution cell-specific analysis of IAA distribution and synthesis. Plant Cell. 21 (6), 1659-1668 (2009).
  43. Bargmann, B. O., Birnbaum, K. D. Fluorescence activated cell sorting of plant protoplasts. J Vis Exp. (36), (2010).
  44. Hong, S. Y., Seo, P. J., Cho, S. H., Park, C. M. Preparation of Leaf Mesophyll Protoplasts for Transient Gene Expression in Brachypodium distachyon. J Plant Biol. 55 (5), 390-397 (2012).
  45. Li, Y., Van den Ende, W., Rolland, F. Sucrose Induction of Anthocyanin Biosynthesis Is Mediated by DELLA. Mol Plant. 7 (3), 570-572 (2014).
  46. Durut, N., et al. A duplicated NUCLEOLIN gene with antagonistic activity is required for chromatin organization of silent 45S rDNA in Arabidopsis. Plant Cell. 26 (3), 1330-1344 (2014).
  47. Han, Y. H., Ma, B., Zhang, K. Z. SPIDER: Software for protein identification from sequence tags with De Novo sequencing error. J Bioinform Comput Biol. 3 (3), 697-716 (2005).
  48. Han, X., He, L., Xin, L., Shan, B., Ma, B. PeaksPTM: Mass spectrometry-based identification of peptides with unspecified modifications. J Proteome Res. 10 (7), 2930-2936 (2011).
  49. Zhang, J., et al. PEAKS DB: de novo sequencing assisted database search for sensitive and accurate peptide identification. Mol Cell Proteomics. 11 (4), 010587 (2012).
  50. Zhang, Z., et al. UV crosslinked mRNA-binding proteins captured from leaf mesophyll protoplasts. Plant Methods. 12 (42), 1-12 (2016).
  51. Zhang, Y., et al. Integrative genome-wide analysis reveals HLP1, a novel RNA-binding protein, regulates plant flowering by targeting alternative polyadenylation. CellRes. 25 (7), 864-876 (2015).
  52. Steen, H., Jensen, O. N. Analysis of protein-nucleic acid interactions by photochemical cross-linking and mass spectrometry. Mass Spec Rev. 21 (3), 163-182 (2002).
  53. Miller, C., et al. Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast. Mol Syst Biol. 7 (458), 1-13 (2011).
  54. Eng, J., McCormack, A. L., Yates, J. R. An approach to correlate tandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in a protein database. J Am Soc Mass Spectrom. 5 (11), 976-989 (1994).
  55. Perkins, D. N., Pappin, D. J. C., Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis. 20 (18), 3551-3567 (1999).

Tags

Keywords: MRNA InteractomeMRNA-bound ProteomePlant ProtoplastsPost-transcriptional Gene RegulationUV CrosslinkingArabidopsis ThalianaLeaf Mesophyll ProtoplastsMMG SolutionCentrifugation
check_url/56011?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Zhang, Z., Boonen, K., Li, M., Geuten, K. mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts. J. Vis. Exp. (125), e56011, doi:10.3791/56011 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image