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Biochemistry

Capture interactine d'ARNm à partir de protoplastes végétaux

Published: July 28, 2017
doi:
10.3791/56011
, , ,
1Department of Biology,KU Leuven

Summary

Ici, nous présentons un protocole de capture interactif appliqué aux protoplastes de mésophylle de la feuille d' Arabidopsis thaliana . Cette méthode repose de manière critique sur la réticulation UV in vivo et permet l'isolement et l'identification des protéines de liaison de l'ARNm de la plante à partir d'un environnement physiologique.

Abstract

Les protéines de liaison à l'ARN (RBP) déterminent le sort des ARN. Ils participent à toutes les voies de la biogenèse de l'ARN et contribuent en particulier à la régulation post-transcriptionnelle des gènes (PTGR) des ARN messagers (mRNA). Au cours des dernières années, un certain nombre de protéomes liés à l'ARNm provenant de lignées de levure et de cellules de mammifères ont été isolés avec succès en utilisant une nouvelle méthode appelée "capture d'interconnexion d'ARNm", qui permet l'identification de protéines de liaison d'ARNm (mRBP) Directement à partir d'un environnement physiologique. Le procédé se compose de in vivo perles ultraviolet (UV) réticulation, pull-down et une purification des complexes de ribonucléoprotéine messager (les mRNP) par oligo (dT), et l'identification ultérieure des protéines réticulées par spectrométrie de masse (MS). Très récemment, en appliquant la même méthode, plusieurs protéomes liés à l'ARNm de plantes ont été signalés simultanément à partir de différentes sources de tissus d' Arabidopsis : semis étiolés, tissu de feuilles,Les protoplastes de mésophylle des feuilles et les cellules racines cultivées. Ici, nous présentons la méthode optimisée de capture de l'interaction de l'ARNm pour les protoplastes de la mésophylle de la feuille d' Arabidopsis thaliana , un type de cellule qui sert d'outil polyvalent aux expériences qui incluent divers essais cellulaires. Les conditions pour un rendement optimal en protéines comprennent la quantité de tissu de départ et la durée de l'irradiation UV. Dans le protéome lié à l'ARNm obtenu à partir d'une expérience à moyenne échelle (10 7 cellules), les RBP ont constaté que la capacité de liaison à l'ARN était surreprésentée et de nombreuses RBP nouvelles ont été identifiées. L'expérience peut être mise à l'échelle (10 9 cellules), et la méthode optimisée peut être appliquée à d'autres types et espèces de cellules végétales pour isoler, cataloguer et comparer les protéomes liés aux ARNm dans les plantes.

Introduction

Les eucaryotes utilisent plusieurs voies de régulation de la biogenèse de l'ARN pour maintenir les processus biologiques cellulaires. Parmi les types connus d'ARN, l'ARNm est très diversifié et porte la capacité de codage des protéines et leurs isoformes 1. La voie PTGR dirige le sort des pré-ARNm 2 , 3 . Les RBP de différentes familles de gènes contrôlent la régulation de l'ARN, et dans PTGR, les mRBP spécifiques guident les ARNm par des interactions physiques directes, formant des mRNP fonctionnels. Par conséquent, l'identification et la caractérisation des mRBP et de leurs mRNP sont essentiels pour comprendre la régulation du métabolisme de l'ARNm cellulaire 2. Au cours des trois dernières décennies, diverses méthodes in vitro – y compris les tests de changement de mobilité électrophorétique de l'ARN (REMSA), l'évolution systématique des ligands par des essais d'enrichissement exponentiel (SELEX) basé sur des constructions dérivées de bibliothèque, RNA Bind-n-Seq (RBNS), radiomarquées ou quantitativesLes essais de liaison à l'ARN de fluorescence, la cristallographie aux rayons X et la spectroscopie RMN 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 – ont été largement appliqués aux études de RBP, principalement à partir de cellules de mammifères. Les résultats de ces études sur les RBP de mammifères peuvent être recherchés via la base de protéines de liaison à l'ARN (RBPDB), qui collecte les observations publiées 10 .

Bien que ces approches in vitro soient des outils puissants, elles déterminent les motifs d'ARN liés à partir d'un groupe d'ARN donné de séquences et sont donc limitées dans leur capacité à découvrir de nouveaux ARN cible. Il en va de même pour les stratégies informatiques pour prédire les RBP à l'échelle du génome, qui sont basées sur la conservation de la séquence et de la structure des protéines 15 . Pour remédier à cela, une nouvelle méthode expérimentale haA été établi qui permet d'identifier les motifs d'ARN auxquels une RBP d'intérêt interagit, ainsi que pour déterminer l'emplacement précis de la liaison. Cette méthode, appelée «réticulation et immunoprécipitation» (CLIP), est composée d'une réticulation UV in vivo suivie d'une immunoprécipitation 11 . Les premières études ont montré que la photoactivation des nucléotides d'ADN et d'ARN peut se produire à des longueurs d'onde UV d'excitation supérieures à 245 nm. La réaction à travers la thymidine semble être favorisée (classement par ordre de diminution de la photoréactivité: dT ≥ dC> rU> rC, dA, dG) 12 . En utilisant une lumière UV avec une longueur d'onde de 254 nm (UV-C), on a observé que des liaisons covalentes entre des nucléotides d'ARN et des résidus de protéines sont créées dans la gamme de seulement quelques Angstroms (Å). Le phénomène est donc appelé la réticulation "nulle" de l'ARN et du RBP. Ceci peut être suivi d'une procédure de purification rigoureuse Dure peu de fond 13 , 14 .

Une stratégie complémentaire de CLIP consiste à combiner la réticulation UV in vivo avec l'identification des protéines pour décrire le paysage des RBP. Un certain nombre de protéome tels lié ARNm-pangénomiques ont été isolées à partir de cellules de levure, les cellules souches embryonnaires (CSE), et des lignées cellulaires humaines (c. -à- HEK293 et HeLa) en utilisant cette nouvelle approche expérimentale, appelée « ARNm interactome capture » 18, 19 , 20 , 21 . Le procédé est composé d'une réticulation UV in vivo suivie d'une purification de mRNP et d'une protéomique à base de MS. En appliquant cette stratégie, on a découvert de nombreuses RBP romantiques "Moonlighting" contenant des RBD non canoniques, et il est devenu évident que plus de protéines ont des capacités de liaison à l'ARN que précédemment supposées"> 15 , 16 , 17. L'utilisation de cette méthode permet de nouvelles applications et la capacité de répondre à de nouvelles questions biologiques lors de l'étude des RBP. Par exemple, une étude récente a étudié la conservation du protéome lié à l'ARNm (RBP de base Protéome) entre la levure et les cellules humaines 22 .

Les RBP des plantes ont déjà été impliquées dans la croissance et le développement ( p . Ex ., Dans la régulation post-transcriptionnelle du temps de floraison, de l'horloge circadienne et de l'expression des gènes dans les mitochondries et les chloroplastes) 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 . En outre, on pense qu'ils exercent des fonctions dans les processus cellulaires répondant aux contraintes abiotiques ( p. Ex., Froid, sécheresse, saLinity et abscisic acid (ABA)) 31 , 32 , 33 , 34 . Il existe plus de 200 gènes de RBP prédits dans le génome d' Arabidopsis thaliana , basés sur des motifs de séquence de domaine de reconnaissance d'ARN (RRM) et de K (HK) d'homologie (KH); Dans le riz, environ 250 ont été notés 35 , 36 . Il est remarquable que de nombreuses RBP prédites semblent être uniques aux plantes ( p. Ex., Aucun orthologue métazoaire à environ 50% des RBP d' Arabidopsis prédites contenant un domaine RRM) 35 , suggérant que beaucoup peuvent servir de nouvelles fonctions. Les fonctions de la plupart des RBP prédites restent non caractérisées 23 .

L'isolement des protéomes liés à l'ARNm provenant des semis étiolés d' Arabidopsis , des tissus foliaires, des cellules racines cultivées et des protoplastes de mésophylle foliaire par l'utilisation deLa capture de l'interaction de l'ARNm a récemment été rapportée 38 , 39 . Ces études démontrent le fort potentiel de catalogage systématique de RBP fonctionnelles dans les plantes dans un proche avenir. Ici, nous présentons un protocole pour la capture de l'interaction de l'ARNm à partir de protoplastes végétaux ( c.-à-d. Cellules sans parois cellulaires). Les protoplastes de mésophylle de la feuille d' Arabidopsis thaliana sont le principal type de cellule foliaire. Les protoplastes isolés permettent un accès optimal de la lumière UV aux cellules. Ce type de cellule peut être utilisé dans des analyses qui expriment de manière transitoire des protéines pour la caractérisation fonctionnelle 40 , 41 . En outre, le protoplage a été appliqué à plusieurs autres types de cellules végétales et aux espèces 42 , 43 , 44 ( p. Ex., Petersson et al ., 2009; Bargmann et Birnbaum, 2010; et Hong et al ., 2012).

<P class = "jove_content"> La méthode englobe un total de 11 étapes ( Figure 1A ). Les protoplastes de mésophylle de la feuille d' Arabidopsis sont d'abord isolés (étape 1) et sont par la suite irradiés par UV pour former des mRNP réticulés (étape 2). Lorsque les protoplastes sont lysés dans des conditions de dénaturation (étape 3), les mRNP réticulés sont libérés dans un tampon de lyse / liaison et abattus par des billes oligo-d (T) 25 (étape 4). Après plusieurs cycles de lavages rigoureux, les mRNP sont purifiés et analysés plus avant. Les peptides dénaturés des mRBP sont digérés par la protéinase K avant que les ARNm réticulés ne soient purifiés et que la qualité de l'ARN soit vérifiée par qRT-PCR (étapes 5 et 6). Après le traitement par RNase et la concentration de protéines (étape 7), la qualité de la protéine est contrôlée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS (SDS-PAGE) et coloration à l'argent (étape 8). La différence entre les bandes de protéines peut facilement être visualisée entre un échantillon réticulé (CL) et un échantillon non réticulé (non CL;L'échantillon témoin négatif des protoplastes qui n'est pas soumis à une irradiation UV). L'identification des protéines est obtenue grâce à une protéomique à base de MS. Les protéines provenant de l'échantillon CL sont séparées par une électrophorèse en gel de polyacrylamide unidimensionnel (1D-PAGE) pour éliminer la contamination potentielle du fond, sont "digérées dans un gel" en peptides courts en utilisant de la trypsine et sont purifiées (étape 9). La chromatographie liquide à phase inverse nano couplée à la spectrométrie de masse (nano-LC-MS) permet de déterminer la quantité de protéines définitives dans le protéome lié à l'ARNm (étape 10). Enfin, les mRBP identifiés sont caractérisés et catalogués à l'aide d'une analyse bioinformatique (étape 11).

Protocol

1. Isolation du Protoplaste Mésophylle des feuilles d' Arabidopsis NOTE: Les protoplastes de la mésophylle de la feuille d' Arabidopsis sont essentiellement isolés comme décrit par Yoo et al ., 2007, avec plusieurs modifications 40 . Croissance des plantes Faire tremper environ 200 graines Arabydopsis thaliana Col-0 ecotype dans de l'eau stérilisée pendant 2 jours à 4 ° C dans…

Representative Results

Nous avons observé un halo caractéristique, qui entoure la pastille de perles dans l'échantillon CL, dans l'étape de lavage 4.3 avec le tampon de lavage 2 ( Figure 1B ). Bien qu'il n'ait pas été étudié, ce phénomène s'explique probablement par l'interférence des complexes de mRNP réticulés avec l'agrégation des talons pendant la capture magnétique, ce qui provoque l'apparition d'un agrégat plus diffus. Il i…

Discussion

Nous avons réussi à appliquer une capture d'interraction d'ARNm, développée pour la levure et les cellules humaines, pour planter des protoplastes de mésophylle foliaire. Les cellules de la mésophylle des feuilles sont le type principal de tissu moulu dans les feuilles des plantes. L'avantage majeur de cette méthode est qu'il utilise une réticulation in vivo pour découvrir les protéines à partir d'un environnement physiologique.

Dans ce protoc…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous reconnaissons le laboratoire du Prof. Joris Winderickx, qui a fourni l'appareil de réticulation UV équipé de la lampe UV conventionnelle. KG est soutenu par le fonds de recherche KU Leuven et reconnaît le soutien de la subvention FWO G065713N.

Materials

REAGENTS
0.8 M Mannitol Sigma M1902-500G Primary isotonic Enzyme solution &
MMg solution
2M KCl MERCK Art. 4935 Primary isotonic Enzyme solution &
W5 buffer
0.2 M MES (pH 5.7)
(4-morpholineethanesulfonic acid)		 Sigma-aldrich M2933 Primary isotonic Enzyme solution,
W5 buffer &
MMg solution,
Filtration sterilization
Cellulase R10 Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. CELLULASE
“ONOZUKA”
R-10, 10 g		 Final isotonic enzyme solution
Macerozyme R10 Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. MACEROZYME R-10, 10g Final isotonic enzyme solution
10% (w/v) BSA
(Bovine Serum Albumin)		 Sigma-aldrich A7906-100G Final isotonic enzyme solution &
Filtration sterilization
1M CaCl2 Chem-Lab NV CL00.0317.1000 Final isotonic enzyme solution,
W5 buffer &
Digestion buffer
1M NaCl Fisher Chemical S/3160/60 W5 buffer
2M MgCl2 Sigma M8266-100G MMg solution
1M LiCl
(Lithium Chloride)		 Acros 199885000 Lysis/binding buffer,
Wash buffer 1,
Wash buffer 2 &
Low salt buffer
5% (w/v) LiDS
(Lithium Dodecyl Sulphate)		 Sigma-aldrich L4632-25G Lysis/binding buffer,
Wash buffer 1 &
Filtration sterilization
1M DTT
(Dithiothreitol)		 Thermo Fisher Scientific
Wash buffer 1 &
Wash buffer 2		 307866 Lysis/binding buffer,
1M Tris-HCl (pH 7.5) (Tris(hydroxymethyl)aminomethane, Hydrochloric acid S.G. (HCl)) Acros &
Fisher Chemical		 167620010 &
H/1200/PB15		 Lysis/binding buffer,
Wash buffer 1,
Wash buffer 2,
Low salt buffer &
Elution buffer
0.5 M EDTA (pH 8.0) (Ethylenediaminetetraacetic acid) Sigma-aldrich ED-500G Lysis/binding buffer,
Wash buffer 1,
Wash buffer 2,
Low salt buffer &
Elution buffer
Tween 20 MERCK 8.22184.0500 Regeneration of oligo-d(T)25 beads
0.1 M NaOH VWR PROLABO CHEMICALS 28244.295 Regeneration of oligo-d(T)25 beads
1X PBS (pH 7.4)
(Phosphate Buffered Saline)
containing
(NaCl; KCl; Na2HPO4; KH2PO4)		 Fisher Chemical, MERCK,
Sigma-aldrich & SAFC		 S/3160/60,
Art. 4935,
71640-250G &
60230		 Regeneration of oligo-d(T)25 beads
Proteinase K solution (2 μg/μL) Thermo Fisher Scientific 11789020 Protein digestion
Loading dye Invitrogen LC5925 SDS-PAGE
qPCR master mix Promega A6001 qRT-PCR assay
RNase Cocktail Thermo Fisher Scientific AM2286 RNA digestion
Methanol Sigma-aldrich 322415 Gel fixation and gel destaining
Acetic acid Sigma-aldrich 537020 Gel fixation and gel destaining
Coomassie Brilliant Blue R-250 Thermo Fisher Scientific 20278 Gel staining
1M NH4HCO3
(Ammonium bicarbonate)
 		 Sigma-aldrich 09830-500G Gel hydration &
Digestion buffer
CH3CN
(Acetonitrile)		 Sigma-aldrich 34851-100ML Gel dehydration &
Peptide dissolving solution
IAA
(Iodoacetic acid)		 Sigma-aldrich I4386-10G Alkylating agent
TFA
(Trifluoroacetic acid)		 Sigma-aldrich 302031-10X1ML Peptide dissolving solution
FA
(Formic acid)		 Sigma-aldrich 06554-5G Peptide extraction
Trypsin solution (6 ng/μL) Promega V5280 Digestion buffer
Name Company Catalog Number Comments
EQUIPMENT
Soil Peltracom LP2D Plant growth
Vermiculite 3 Sibli AS 05VERMICULIET Plant growth
Petri dish (150 x 20 mm) Sarstedt 82.1184.500 Carrier for protoplast suspension
0.22 μm filter Millipore SE2M229104 Homogenization of final isotonic enzyme solution
Razorblade Agar Scientific T585 Rosette leaf strips
35-75 μm nylon mesh SEFAR NITEX 74010 Protoplast suspension filtration
50 mL round bottom tubes Sigma-aldrich T1918-10EA Carrier for protoplast suspension
Hemocytometer
(Bürker hemocytometer)		 MARIENFELD 650030 Protoplast cell counting
UV crosslinking apparatus
(HL-2000 HybriLinker)		 UVP, LLC UVP95003101 in vivo UV crosslinking
UV lamp
(Sankyo-Denki G8T5)		 SANKYO
DENKI		 SD G8T5 in vivo UV crosslinking
50 mL glass syringe FORTUNA Optima Z314560 Homogenization of protoplast lysate
Narrow needle (0.9 x 25 mm) Becton Dickinson microlance 3 2021-04 Homogenization of protoplast lysate
Rotator Model L26 Labinco BV 26110912 Sample incubation by rotating
Oligo-d(T)25 magnetic beads
(5 mg/mL)		 New England BioLabs S1419S mRNPs and mRNAs binding and pull-down
Magnetic rack Invitrogen CS15000 mRNPs and mRNAs binding and pull-down
Centrifugal filter units
(Amicon Ultra-4 centrifugal filter units)		 EMD Millipore UFC800308 mRBP concentration
Pierce Silver Stain Kit Thermo Fisher Scientific 24612 Silver-staining assay
RNA purification kit
(InviTrap Spin Plant RNA Mini Kit)		 STRATEC Molecular 1064100300 RNA purification
Spectrophotometer device (NanoDrop 1000 Spectrophotometer) Thermo Fisher Scientific ND-1000 RNA quality and quantity
Real-Time PCR cycler
(StepOne Real-Time PCR cycler)		 Thermo Fisher Scientific 4376600 cDNA quantification
µ-C18 columns
(Millipore Zip Tip µ-C18 columns)		 Sigma-aldrich 720046-960EA Peptide purification
Mass spectrometer
(Q Exactive Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer)		 Thermo Fisher Scientific IQLAAEGAAPFALGMAZR Mass spectrometry-based proteomics
Liquid chromatography instrument (Ultimate 3000 ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC) instrument) Thermo Fisher Scientific ULTIM3000RSLCNANO Mass spectrometry-based proteomics
C18 column
(Easy Spray Pepmap RSLC C18 column)		 Thermo Fisher Scientific ES800 Mass spectrometry-based proteomics
C18 precolumn
(Acclaim Pepmap 100 C18 precolumn)		 Thermo Fisher Scientific 160321 Mass spectrometry-based proteomics
Name Company Catalog Number Comments
Primers for qRT-PCR assay Sequences
UBQ10 mRNA
(Li et al., 2014)		 Fw: AACTTTGGTGGTTTGTGTTTTGG
Rv: TCGACTTGTCATTAGAAAGAAAGAGATAA
18S rRNA
(Durut et al., 2014)		 Fw: CGTAGTTGAACCTTGGGATG
Rv: CACGACCCGGCCAATTA
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References

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Zhang, Z., Boonen, K., Li, M., Geuten, K. mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts. J. Vis. Exp. (125), e56011, doi:10.3791/56011 (2017).
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