Summary

ARNm Interactome Captura de Planta Protoplastos

Published: July 28, 2017
doi:

Summary

Aquí, presentamos un protocolo de captura interactome aplicado a Arabidopsis thaliana protoplastos hoja mesófilo. Este método depende crıticamente de la reticulación UV in vivo y permite el aislamiento e identificación de proteınas de unión a mRNA de plantas desde un entorno fisiológico.

Abstract

Las proteínas de unión a ARN (RBPs) determinan el destino de los ARNs. Participan en todas las vías de la biogénesis del ARN y contribuyen especialmente a la regulación génica post-transcripcional (PTGR) de los ARN mensajeros (mRNAs). En los últimos años, se han aislado con éxito varios proteomas unidos a ARNm a partir de líneas de células de levaduras y mamíferos mediante el uso de un nuevo método denominado "captura de interactomas de mRNA", que permite la identificación de proteínas mRNA-binding (mRBPs) Directamente desde un entorno fisiológico. El método se compone de reticulación, pull-down y purificación de complejos de ribonucleoproteína mensajera (mRNPs) por bolas de oligo (dT) in vivo , y la posterior identificación de las proteínas reticuladas por espectrometría de masas (MS). Recientemente, aplicando el mismo método, se han reportado simultáneamente varios proteomas vegetales unidos a ARNm de diferentes fuentes de tejido de Arabidopsis : plántulas etioladas, tejido foliar,Protoplastos de mesófilo de hojas y células de raíces cultivadas. Aquí, presentamos el optimizado mRNA interactome método de captura de Arabidopsis thaliana hoja mesofilo protoplastos, un tipo de célula que sirve como una herramienta versátil para los experimentos que incluyen diversos ensayos celulares. Las condiciones para un rendimiento óptimo de la proteína incluyen la cantidad de tejido de partida y la duración de la irradiación UV. En el proteoma unido a ARNm obtenido a partir de un experimento de escala media (10 ^ { 7} células), se encontró que las RBP que tenían capacidad de unión a ARN estaban sobre-representadas y se identificaron muchas RBP nuevas. El experimento se puede ampliar (10 9 células), y el método optimizado se puede aplicar a otros tipos de células vegetales y especies para aislar, catalogar y comparar los proteomas unidos a mRNA en las plantas.

Introduction

Los eucariotas utilizan múltiples vías reguladoras de la biogénesis del ARN para mantener los procesos biológicos celulares. Entre los tipos conocidos de ARN, el ARNm es muy diverso y lleva la capacidad de codificación de las proteínas y sus isoformas 1. La ruta PTGR dirige los destinos de los pre-mRNAs 2 , 3 . RBPs de diferentes familias de genes controlan la regulación de ARN, y en PTGR, mRBPs específicos guían mRNAs a través de interacciones físicas directas, formando mRNPs funcional. Por lo tanto, la identificación y caracterización de mRBPs y sus mRNPs es fundamental para entender la regulación del metabolismo del mRNA celular 2. Durante las últimas tres décadas, varios métodos in vitro – incluyendo los ensayos de desplazamiento de movilidad electroforética de ARN (REMSA), evolución sistemática de ligandos mediante ensayos de enriquecimiento exponencial (SELEX) basado en constructos derivados de la biblioteca, RNA Bind-n-Seq (RBNS), radiomarcado o cuantitativoEnsayos de unión a ARN de fluorescencia, cristalografía de rayos X y espectroscopia de RMN 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 – se han aplicado ampliamente a estudios de RBP, principalmente a partir de células de mamífero. Los resultados de estos estudios de mamíferos RBPs se puede buscar a través de la RNA-binding Protein DataBase (RBPDB), que recoge las observaciones publicadas [ 10] .

Aunque estos enfoques in vitro son herramientas de gran alcance, que determinan los motivos de ARN unido de un determinado grupo de RNA de secuencias y por lo tanto, están limitados en su capacidad para descubrir nuevos ARN objetivo. Lo mismo es cierto para las estrategias computacionales para predecir el genoma de todo RBPs, que se basan en la conservación de la secuencia de proteínas y la estructura [ 15] . Para superar esto, un nuevo método experimental haSe ha establecido que permite la identificación de los motivos de ARN que un RBP de interés interactúa con, así como para la determinación de la ubicación precisa de la unión. Este método, denominado "reticulación e inmunoprecipitación" (CLIP), está compuesto de reticulación UV in vivo seguida por inmunoprecipitación 11 . Los primeros estudios han demostrado que la fotoactivación de nucleótidos de ADN y ARN puede ocurrir a una longitud de onda UV de excitación mayor que 245 nm. La reacción a través de la timidina parece ser favorecida (rango en orden de disminución de la fotoreactividad: dT ≥ dC> rU> rC, dA, dG) 12 . Usando luz UV con una longitud de onda de 254 nm (UV-C), se observó que se crean enlaces covalentes entre nucleótidos de ARN y residuos de proteína cuando están en el rango de sólo unos pocos Angstroms (Å). Por lo tanto, el fenómeno se denomina reticulación de "cero longitud" de RNA y RBP. Esto puede ser seguido por un procedimiento de purificación estricto Con poco fondo 13 , 14 .

Una estrategia complementaria al CLIP consiste en combinar la reticulación UV in vivo con la identificación de proteínas para describir el paisaje de las RBP. Se han aislado varios proteomas unidos a mRNA de este genoma de células de levadura, células madre embrionarias (ESCs) y líneas celulares humanas ( es decir, HEK293 y HeLa) usando este nuevo enfoque experimental, denominado "captura de interactomas de mRNA" 18 , 19 , 20 , 21 . El método se compone de reticulación UV in vivo seguida por purificación de mRNP y proteómica basada en MS. Mediante la aplicación de esta estrategia, se han descubierto muchas RBP no lineales que contienen RBDs no canónicos y se ha puesto de manifiesto que más proteínas tienen capacidades de unión a ARN de lo que se suponía anteriormente"> 15, 16, 17. El uso de este método permite nuevas aplicaciones y para la capacidad de responder a las nuevas preguntas biológicos en la investigación de las prácticas comerciales restrictivas. Por ejemplo, un estudio reciente ha investigado la conservación del proteoma ARNm unido (el núcleo RBP Proteoma) entre la levadura y las células humanas [ 22] .

Se ha descubierto que las RBP de las plantas están implicadas en el crecimiento y desarrollo ( por ejemplo , en la regulación post-transcripcional del tiempo de floración, el reloj circadiano y la expresión génica en mitocondrias y cloroplastos) 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 . Además, se piensa que desempeñan funciones en los procesos celulares que responden a tensiones abióticas ( por ejemplo, frío, sequía, saLinidad y ácido abscísico (ABA)) 31 , 32 , 33 , 34 . Existen más de 200 genes RBP predichos en el genoma de Arabidopsis thaliana , basados ​​en motivos de secuencia de dominio de reconocimiento de ARN (RRM) y homología K (KH); En el arroz, aproximadamente 250 se han observado 35 , 36 . Es notable que muchos RBPs predicho parecen ser únicos a las plantas ( por ejemplo, ningún orthologs del metazoan a aproximadamente el 50% de RBP predichas de Arabidopsis que contienen un dominio de RRM) 35 , sugiriendo que muchos pueden servir a nuevas funciones. Las funciones de la mayoría de las RBP predicho siguen sin caracterizar [ 23] .

El aislamiento de proteomas unidos a ARNm de plántulas etioladas de Arabidopsis , tejido foliar, células de raíces cultivadas y protoplastos de mesofilo de hoja mediante el uso deMRNA interactome captura se ha informado recientemente 38 , 39 . Estos estudios demuestran el fuerte potencial de catalogar sistemáticamente las RBP funcionales en las plantas en un futuro próximo. Aquí, presentamos un protocolo para mRNA interactome captura de protoplastos de plantas ( es decir, células sin paredes celulares). Los protoplastos de mesofila de la hoja de Arabidopsis thaliana son el tipo principal de células foliares. Los protoplastos aislados permiten el acceso óptimo de la luz UV a las células. Este tipo de células se puede utilizar en ensayos que transitoriamente expresar proteínas para la caracterización funcional [ 40 , 41] . Además, la protoplastía se ha aplicado a varios otros tipos de células vegetales y especies 42 , 43 , 44 ( por ejemplo, Petersson et al ., 2009; Bargmann y Birnbaum, 2010 y Hong et al ., 2012).

<P class = "jove_content"> El método abarca un total de 11 pasos ( Figura 1A ). Los protoplastos de mesofilo de hoja de Arabidopsis se aislan primero (etapa 1) y posteriormente se irradian con UV para formar mRNPs reticulados (etapa 2). Cuando los protoplastos se lisan en condiciones desnaturalizantes (etapa 3), los mRNP reticulados se liberan en tampón de lisis / unión y se extraen por perlas de oligo-d (T) 25 (etapa 4). Después de varias rondas de lavados rigurosos, los mRNP se purifican y se analizan adicionalmente. Los péptidos desnaturalizados de mRBPs son digeridos por proteinasa K antes de purificar los ARNm reticulados y la calidad de ARN se verifica mediante qRT-PCR (etapas 5 y 6). Después del tratamiento con RNasa y la concentración de proteína (etapa 7), la calidad de la proteína se controla mediante electroforesis en gel de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE) y tinción con plata (etapa 8). La diferencia en los patrones de bandas de proteína puede visualizarse fácilmente entre una muestra reticulada (CL) y una muestra no reticulada (no CL;La muestra de control negativo de protoplastos que no está sometida a irradiación UV). La identificación de proteínas se logra mediante la proteómica basada en la EM. Las proteínas de la muestra de CL se separan mediante electroforesis unidimensional en gel de poliacrilamida (1D-PAGE) para eliminar la posible contaminación de fondo, se digieren en gel en péptidos cortos usando tripsina y se purifican (etapa 9). La cromatografía líquida de fase inversa nanométrica acoplada a espectrometría de masas (nano-LC-MS) permite la determinación de la cantidad de proteínas definitivas en el proteoma ligado al mRNA (paso 10). Finalmente, las mRBPs identificadas se caracterizan y catalogan usando el análisis bioinformático (paso 11).

Protocol

1. Arabidopsis Leaf Mesophyll Protoplast Aislamiento NOTA: Los protoplastos de mesofilo de hoja de Arabidopsis se aislan esencialmente como se describe en Yoo et al ., 2007, con varias modificaciones 40 . Crecimiento de plantas Remoje aproximadamente 200 semillas de ecotipo Arabidopsis thaliana Col-0 en agua esterilizada durante 2 días a 4 ° C en la oscuridad para estratificación. NOTA:…

Representative Results

Se observó un halo característico, que rodea el gránulo de gránulo en la muestra de CL, en el paso de lavado 4.3 con tampón de lavado 2 ( Figura 1B ). Aunque no se ha investigado, este fenómeno puede explicarse probablemente por la interferencia de los complejos mRNP reticulados con la agregación de gránulos durante la captura magnética, causando la formación de un agregado más difuso. Indica que la captura de perlas de oligo-d (T) 25 f…

Discussion

Aplicamos con éxito la captura de interactomas de mRNA, desarrollada para levaduras y células humanas, para plantar protoplastos de mesofilo en hojas. Las células del mesófilo de la hoja son el tipo principal de tejido de tierra en hojas de la planta. La principal ventaja de este método es que utiliza reticulación in vivo para descubrir las proteínas de un entorno fisiológico.

En este protocolo, presentamos principalmente una serie de condiciones experimentales optimizadas (…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Reconocemos el laboratorio del Prof. Joris Winderickx, que proporcionó el aparato de reticulación UV equipado con la lámpara UV convencional. KG cuenta con el apoyo del fondo de investigación KU Leuven y reconoce el apoyo de la subvención FWO G065713N.

Materials

REAGENTS
0.8 M Mannitol Sigma M1902-500G Primary isotonic Enzyme solution &
MMg solution
2M KCl MERCK Art. 4935 Primary isotonic Enzyme solution &
W5 buffer
0.2 M MES (pH 5.7)
(4-morpholineethanesulfonic acid)
Sigma-aldrich M2933 Primary isotonic Enzyme solution,
W5 buffer &
MMg solution,
Filtration sterilization
Cellulase R10 Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. CELLULASE
“ONOZUKA”
R-10, 10 g
Final isotonic enzyme solution
Macerozyme R10 Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. MACEROZYME R-10, 10g Final isotonic enzyme solution
10% (w/v) BSA
(Bovine Serum Albumin)
Sigma-aldrich A7906-100G Final isotonic enzyme solution &
Filtration sterilization
1M CaCl2 Chem-Lab NV CL00.0317.1000 Final isotonic enzyme solution,
W5 buffer &
Digestion buffer
1M NaCl Fisher Chemical S/3160/60 W5 buffer
2M MgCl2 Sigma M8266-100G MMg solution
1M LiCl
(Lithium Chloride)
Acros 199885000 Lysis/binding buffer,
Wash buffer 1,
Wash buffer 2 &
Low salt buffer
5% (w/v) LiDS
(Lithium Dodecyl Sulphate)
Sigma-aldrich L4632-25G Lysis/binding buffer,
Wash buffer 1 &
Filtration sterilization
1M DTT
(Dithiothreitol)
Thermo Fisher Scientific
Wash buffer 1 &
Wash buffer 2
307866 Lysis/binding buffer,
1M Tris-HCl (pH 7.5) (Tris(hydroxymethyl)aminomethane, Hydrochloric acid S.G. (HCl)) Acros &
Fisher Chemical
167620010 &
H/1200/PB15
Lysis/binding buffer,
Wash buffer 1,
Wash buffer 2,
Low salt buffer &
Elution buffer
0.5 M EDTA (pH 8.0) (Ethylenediaminetetraacetic acid) Sigma-aldrich ED-500G Lysis/binding buffer,
Wash buffer 1,
Wash buffer 2,
Low salt buffer &
Elution buffer
Tween 20 MERCK 8.22184.0500 Regeneration of oligo-d(T)25 beads
0.1 M NaOH VWR PROLABO CHEMICALS 28244.295 Regeneration of oligo-d(T)25 beads
1X PBS (pH 7.4)
(Phosphate Buffered Saline)
containing
(NaCl; KCl; Na2HPO4; KH2PO4)
Fisher Chemical, MERCK,
Sigma-aldrich & SAFC
S/3160/60,
Art. 4935,
71640-250G &
60230
Regeneration of oligo-d(T)25 beads
Proteinase K solution (2 μg/μL) Thermo Fisher Scientific 11789020 Protein digestion
Loading dye Invitrogen LC5925 SDS-PAGE
qPCR master mix Promega A6001 qRT-PCR assay
RNase Cocktail Thermo Fisher Scientific AM2286 RNA digestion
Methanol Sigma-aldrich 322415 Gel fixation and gel destaining
Acetic acid Sigma-aldrich 537020 Gel fixation and gel destaining
Coomassie Brilliant Blue R-250 Thermo Fisher Scientific 20278 Gel staining
1M NH4HCO3
(Ammonium bicarbonate)
 
Sigma-aldrich 09830-500G Gel hydration &
Digestion buffer
CH3CN
(Acetonitrile)
Sigma-aldrich 34851-100ML Gel dehydration &
Peptide dissolving solution
IAA
(Iodoacetic acid)
Sigma-aldrich I4386-10G Alkylating agent
TFA
(Trifluoroacetic acid)
Sigma-aldrich 302031-10X1ML Peptide dissolving solution
FA
(Formic acid)
Sigma-aldrich 06554-5G Peptide extraction
Trypsin solution (6 ng/μL) Promega V5280 Digestion buffer
Name Company Catalog Number Comments
EQUIPMENT
Soil Peltracom LP2D Plant growth
Vermiculite 3 Sibli AS 05VERMICULIET Plant growth
Petri dish (150 x 20 mm) Sarstedt 82.1184.500 Carrier for protoplast suspension
0.22 μm filter Millipore SE2M229104 Homogenization of final isotonic enzyme solution
Razorblade Agar Scientific T585 Rosette leaf strips
35-75 μm nylon mesh SEFAR NITEX 74010 Protoplast suspension filtration
50 mL round bottom tubes Sigma-aldrich T1918-10EA Carrier for protoplast suspension
Hemocytometer
(Bürker hemocytometer)
MARIENFELD 650030 Protoplast cell counting
UV crosslinking apparatus
(HL-2000 HybriLinker)
UVP, LLC UVP95003101 in vivo UV crosslinking
UV lamp
(Sankyo-Denki G8T5)
SANKYO
DENKI
SD G8T5 in vivo UV crosslinking
50 mL glass syringe FORTUNA Optima Z314560 Homogenization of protoplast lysate
Narrow needle (0.9 x 25 mm) Becton Dickinson microlance 3 2021-04 Homogenization of protoplast lysate
Rotator Model L26 Labinco BV 26110912 Sample incubation by rotating
Oligo-d(T)25 magnetic beads
(5 mg/mL)
New England BioLabs S1419S mRNPs and mRNAs binding and pull-down
Magnetic rack Invitrogen CS15000 mRNPs and mRNAs binding and pull-down
Centrifugal filter units
(Amicon Ultra-4 centrifugal filter units)
EMD Millipore UFC800308 mRBP concentration
Pierce Silver Stain Kit Thermo Fisher Scientific 24612 Silver-staining assay
RNA purification kit
(InviTrap Spin Plant RNA Mini Kit)
STRATEC Molecular 1064100300 RNA purification
Spectrophotometer device (NanoDrop 1000 Spectrophotometer) Thermo Fisher Scientific ND-1000 RNA quality and quantity
Real-Time PCR cycler
(StepOne Real-Time PCR cycler)
Thermo Fisher Scientific 4376600 cDNA quantification
µ-C18 columns
(Millipore Zip Tip µ-C18 columns)
Sigma-aldrich 720046-960EA Peptide purification
Mass spectrometer
(Q Exactive Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer)
Thermo Fisher Scientific IQLAAEGAAPFALGMAZR Mass spectrometry-based proteomics
Liquid chromatography instrument (Ultimate 3000 ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC) instrument) Thermo Fisher Scientific ULTIM3000RSLCNANO Mass spectrometry-based proteomics
C18 column
(Easy Spray Pepmap RSLC C18 column)
Thermo Fisher Scientific ES800 Mass spectrometry-based proteomics
C18 precolumn
(Acclaim Pepmap 100 C18 precolumn)
Thermo Fisher Scientific 160321 Mass spectrometry-based proteomics
Name Company Catalog Number Comments
Primers for qRT-PCR assay Sequences
UBQ10 mRNA
(Li et al., 2014)
Fw: AACTTTGGTGGTTTGTGTTTTGG
Rv: TCGACTTGTCATTAGAAAGAAAGAGATAA
18S rRNA
(Durut et al., 2014)
Fw: CGTAGTTGAACCTTGGGATG
Rv: CACGACCCGGCCAATTA

References

  1. Jankowsky, E., Harris, M. E. Specificity and nonspecificity in RNA-protein interactions. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (9), 533-544 (2015).
  2. Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation. FEBS Lett. 582 (14), 1977-1986 (2008).
  3. Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. A census of human RNA-binding proteins. Nat Rev Genet. 15 (12), 829-845 (2014).
  4. Lin, Q., Taylor, S. J., Shalloway, D. Specificity and determinants of Sam68 RNA binding. Implications for the biological function of K homology domains. J Biol Chem. 272 (43), 27274-27280 (1997).
  5. Deo, R. C., Bonanno, J. B., Sonenberg, N., Burley, S. K. Recognition of polyadenylate RNA by the poly(A)-binding protein. Cell. 98 (6), 835-845 (1999).
  6. Kattapuram, T., Yang, S., Maki, J. L., Stone, J. R. Protein kinase CK1 alpha regulates mRNA binding by heterogeneous nuclear ribonucleoprotein c in response to physiologic levels of hydrogen peroxide. J Biol Chem. 280 (15), 15340-15347 (2005).
  7. Patel, G. P., Ma, S., Bag, J. The autoregulatory translational control element of poly(A)-binding protein mRNA forms a heteromeric ribonucleoprotein complex. Nucleic Acids Res. 33 (22), 7074-7089 (2005).
  8. Song, J. K., McGivern, J. V., Nichols, K. W., Markley, J. L., Sheets, M. D. Structural basis for RNA recognition by a type II poly(A)-binding protein. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (40), 15317-15322 (2008).
  9. Lambert, N., Robertson, A., Jangi, M., McGeary, S., Sharp, P. A., Burge, C. B. RNA Bind-n-Seq: quantitative assessment of the sequence and structural binding specificity of RNA binding proteins. Mol Cell. 54 (5), 887-900 (2014).
  10. Cook, K. B., Kazan, H., Zuberi, K., Morris, Q., Hughes, T. R. RBPDB: a database of RNA-binding specificities. Nucleic Acids Res. 39, D301-D308 (2011).
  11. Konig, J., Zarnack, K., Luscombe, N. M., Ule, J. Protein-RNA interactions: new genomic technologies and perspectives. Nat Rev Genet. 13 (2), 77-83 (2012).
  12. Hockensmith, J. W., Kubasek, W. L., Vorachek, W. R., von Hippel, P. H. Laser cross-linking of nucleic acids to proteins. Methodology and first applications to the phage T4 DNA replication system. J Biol Chem. 261 (8), 3512-3518 (1986).
  13. Pashev, I. G., Dimitrov, S. I., Angelov, D. Crosslinking proteins to nucleic acids by ultraviolet laser irradiation. Trends Biochem Sci. 16 (9), 323-326 (1991).
  14. Castello, A., et al. System-wide identification of RNA-binding proteins by interactome capture. Nat Protoc. 8 (3), 491-500 (2013).
  15. Nagy, E., Rigby, W. F. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase selectively binds AU-rich RNA in the NAD(+)-binding region (Rossmann fold). J Biol Chem. 270 (6), 2755-2763 (1995).
  16. Hentze, M. W., Preiss, T. The REM phase of gene regulation. Trends Biochem Sci. 35 (8), 423-426 (2010).
  17. Nicholls, C., Li, H., Liu, J. P. GAPDH: a common enzyme with uncommon functions. Clin Exp Pharmacol Physiol. 39 (8), 674-679 (2012).
  18. Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell. 46 (5), 674-690 (2012).
  19. Castello, A., et al. Insights into RNA Biology from an Atlas of Mammalian mRNA-Binding Proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
  20. Kwon, S. C., et al. The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells. Nat Struct Mol Biol. 20 (9), 1122-1130 (2013).
  21. Mitchell, S. F., Jain, S., She, M., Parker, R. Global analysis of yeast mRNPs. Nat Struct Mol Biol. 20 (1), 127-133 (2013).
  22. Beckmann, B. M., et al. The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs. Nat Commun. 6 (10127), 1-9 (2015).
  23. Bailey-Serres, J., Sorenson, R., Juntawong, P. Getting the message across: cytoplasmic ribonucleoprotein complexes. Trends Plant Sci. 14 (8), 443-453 (2009).
  24. Quesada, V., Macknight, R., Dean, C., Simpson, G. G. Autoregulation of FCA pre-mRNA processing controls Arabidopsis flowering time. EMBO J. 22 (12), 3142-3152 (2003).
  25. Lim, M. H., et al. A new Arabidopsis gene, FLK, encodes an RNA binding protein with K homology motifs and regulates flowering time via FLOWERING LOCUS C. Plant Cell. 16 (3), 731-740 (2004).
  26. Hornyik, C., Terzi, L. C., Simpson, G. G. The spen family protein FPA controls alternative cleavage and polyadenylation of RNA. Dev Cell. 18 (2), 203-213 (2010).
  27. Stern, D. B., Goldschmidt-Clermont, M., Hanson, M. R. Chloroplast RNA metabolism. Annu Rev Plant Biol. 61, 125-155 (2010).
  28. Schmal, C., Reimann, P., Staiger, D. A circadian clock-regulated toggle switch explains AtGRP7 and AtGRP8 oscillations in Arabidopsis thaliana. PLoS Comput Biol. 9 (3), e1002986 (2013).
  29. Staiger, D. RNA-binding proteins and circadian rhythms in Arabidopsis thaliana. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 356 (1415), 1755-1759 (2001).
  30. Fischer, B., et al. NovoHMM: a hidden Markov model for de novo peptide sequencing. Anal Chem. 77 (22), 7265-7273 (2005).
  31. Kwak, K. J., Kim, Y. O., Kang, H. Characterization of transgenic Arabidopsis plants overexpressing GR-RBP4 under high salinity, dehydration, or cold stress. J Exp Bot. 56 (421), 3007-3016 (2005).
  32. Raab, S., Toth, Z., de Groot, C., Stamminger, T., Hoth, S. ABA-responsive RNA-binding proteins are involved in chloroplast and stromule function in Arabidopsis seedlings. Planta. 224 (4), 900-914 (2006).
  33. Liu, H. H., et al. Molecular cloning and characterization of a salinity stress-induced gene encoding DEAD-box helicase from the halophyte Apocynum venetum. J Exp Bot. 59 (3), 633-644 (2008).
  34. Wang, S. C., Liang, D., Shi, S. G., Ma, F. W., Shu, H. R., Wang, R. C. Isolation and Characterization of a Novel Drought Responsive Gene Encoding a Glycine-rich RNA-binding Protein in Malus prunifolia (Willd.) Borkh. Plant Mol Biol Report. 29 (1), 125-134 (2011).
  35. Lorkovic, Z. J., Barta, A. Genome analysis: RNA recognition motif (RRM) and K homology (KH) domain RNA-binding proteins from the flowering plant Arabidopsis thaliana. Nucleic Acids Res. 30 (3), 623-635 (2002).
  36. Ambrosone, A., Costa, A., Leone, A., Grillo, S. Beyond transcription: RNA-binding proteins as emerging regulators of plant response to environmental constraints. Plant Science. 182, 12-18 (2012).
  37. Frank, A., Pevzner, P. PepNovo: de novo peptide sequencing via probabilistic network modeling. Anal Chem. 77 (4), 964-973 (2005).
  38. Marondedze, C., Thomas, L., Serrano, N. L., Lilley, K. S., Gehring, C. The RNA-binding protein repertoire of Arabidopsis thaliana. Sci Rep. 6 (29766), 1-13 (2016).
  39. Reichel, M., et al. In Planta Determination of the mRNA-Binding Proteome of Arabidopsis Etiolated Seedlings. Plant Cell. 28 (10), 2435-2452 (2016).
  40. Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
  41. Niu, Y., Sheen, J. Transient expression assays for quantifying signaling output. Methods Mol Biol. 876, 195-206 (2012).
  42. Petersson, S. V., et al. An auxin gradient and maximum in the Arabidopsis root apex shown by high-resolution cell-specific analysis of IAA distribution and synthesis. Plant Cell. 21 (6), 1659-1668 (2009).
  43. Bargmann, B. O., Birnbaum, K. D. Fluorescence activated cell sorting of plant protoplasts. J Vis Exp. (36), (2010).
  44. Hong, S. Y., Seo, P. J., Cho, S. H., Park, C. M. Preparation of Leaf Mesophyll Protoplasts for Transient Gene Expression in Brachypodium distachyon. J Plant Biol. 55 (5), 390-397 (2012).
  45. Li, Y., Van den Ende, W., Rolland, F. Sucrose Induction of Anthocyanin Biosynthesis Is Mediated by DELLA. Mol Plant. 7 (3), 570-572 (2014).
  46. Durut, N., et al. A duplicated NUCLEOLIN gene with antagonistic activity is required for chromatin organization of silent 45S rDNA in Arabidopsis. Plant Cell. 26 (3), 1330-1344 (2014).
  47. Han, Y. H., Ma, B., Zhang, K. Z. SPIDER: Software for protein identification from sequence tags with De Novo sequencing error. J Bioinform Comput Biol. 3 (3), 697-716 (2005).
  48. Han, X., He, L., Xin, L., Shan, B., Ma, B. PeaksPTM: Mass spectrometry-based identification of peptides with unspecified modifications. J Proteome Res. 10 (7), 2930-2936 (2011).
  49. Zhang, J., et al. PEAKS DB: de novo sequencing assisted database search for sensitive and accurate peptide identification. Mol Cell Proteomics. 11 (4), 010587 (2012).
  50. Zhang, Z., et al. UV crosslinked mRNA-binding proteins captured from leaf mesophyll protoplasts. Plant Methods. 12 (42), 1-12 (2016).
  51. Zhang, Y., et al. Integrative genome-wide analysis reveals HLP1, a novel RNA-binding protein, regulates plant flowering by targeting alternative polyadenylation. CellRes. 25 (7), 864-876 (2015).
  52. Steen, H., Jensen, O. N. Analysis of protein-nucleic acid interactions by photochemical cross-linking and mass spectrometry. Mass Spec Rev. 21 (3), 163-182 (2002).
  53. Miller, C., et al. Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast. Mol Syst Biol. 7 (458), 1-13 (2011).
  54. Eng, J., McCormack, A. L., Yates, J. R. An approach to correlate tandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in a protein database. J Am Soc Mass Spectrom. 5 (11), 976-989 (1994).
  55. Perkins, D. N., Pappin, D. J. C., Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis. 20 (18), 3551-3567 (1999).

Play Video

Cite This Article
Zhang, Z., Boonen, K., Li, M., Geuten, K. mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts. J. Vis. Exp. (125), e56011, doi:10.3791/56011 (2017).

View Video