Elektrokrampftherapie Anfälle bei Ratten und Fraktionierung von ihren Hippocampi Beschlagnahme verursachten Veränderungen in den Proteinen der postsynaptischen Dichte prüfen
Summary
Elektrokrampftherapie Beschlagnahme (ECS) ist ein experimentellen Tiermodell der Elektrokrampftherapie für schwere Depressionen. ECS stimuliert weltweit Aktivität im Hippocampus, führt zu Synaptogenese und synaptische Plastizität. Hier beschreiben wir Methoden für ECS Induktion bei Ratten und subzellulären Fraktionierung von ihren Hippocampi, Beschlagnahme verursachten Veränderungen in synaptischen Proteine zu untersuchen.
Abstract
Elektrokrampftherapie Beschlagnahme (ECS) ist ein experimentellen Tiermodell der Elektrokrampftherapie, die effektivste Behandlung für schwere Depressionen. ECS generalisierte Stärkungsmittel-klonischen Anfällen mit niedrigen Mortalität und neuronalen Tod induziert und ist eine weit verbreitete Modell Bildschirm antiepileptische Drogen. Hier beschreiben wir eine ECS-Induktion-Methode in die kurze 55 mA Strom für 0,5 geliefert wird s zu männlichen Ratten 200-250 g Gewicht über Ohr-Clip-Elektroden. Diese bilaterale Stimulation produziert Stufe 4-5 klonische Anfällen, die dauerte ca. 10 s. Nach der Einstellung der akuten oder chronischen ECS Schein die meisten Ratten erholt, um Verhalten von nisht zu unterscheidend werden “keine Beschlagnahme” Ratten. Da ECS weltweit erhöht die Aktivität des Gehirns, dient es auch aktivitätsabhängige Veränderungen der synaptischen Proteine und deren Auswirkungen auf synaptische Stärke mit mehreren Methoden zu untersuchen. Insbesondere kann subzellulären Fraktionierung der postsynaptischen Dichte (PSD) in Kombination mit Western blotting für die quantitative Bestimmung der Fülle der synaptischen Proteine bei dieser spezialisierten synaptischen Struktur. Im Gegensatz zu früheren Fraktionierung-Methode, die große Menge an Nagetier Gehirne erfordert, beschreiben wir hier eine kleine Fraktionierung-Methode, um die PSD von Hippokampi einer einzigen Ratte ohne Saccharose-Gradienten-Zentrifugierung isoliert. Mit dieser Methode zeigen wir, dass die isolierte PSD Bruchteil postsynaptischen Membranproteine, einschließlich PSD95, GluN2B und GluA2 enthält. Präsynaptischen Marker Synaptophysin und lösliche zytoplasmatischen Protein α-Tubulin wurden von der PSD-Bruch, zeigen erfolgreiche PSD Isolierung ausgeschlossen. Darüber hinaus verringerte chronische ECS GluN2B Ausdruck in der PSD, die darauf hinweist, dass unsere kleine PSD Fraktionierung Methode angewendet werden kann, um die Änderungen im Hippokampus PSD Proteine aus einer einzigen Ratte nach genetischen, pharmakologische oder mechanische Behandlungen zu erkennen .
Introduction
Elektrokrampftherapie wurde zur Behandlung von Patienten mit großen depressive Störungen, einschließlich schweren Medikamenten-resistenten Depression, bipolare Depression, Parkinson Erkrankungen und Schizophrenie1,2. In dieser Therapie wird Beschlagnahme durch elektrische Impulse geliefert an den Leiter der narkotisierten Patienten über Epicranial Elektroden1,2,3erzeugt. Wiederholte Gabe von ECS wurde klinisch vorteilhaft für resistente depressive Störungen1,2,3. Der genaue Mechanismus zugrunde liegt die langfristige Wirksamkeit der antidepressiven Wirkung beim Menschen blieben jedoch schwer. ECS ist ein Tiermodell der Elektrokrampftherapie und ist weit verbreitet, seine therapeutischen Mechanismus zu untersuchen. Bei Nagetieren akute ECS und ECS Langzeitbehandlung Förderung der adulten Neurogenese in den Hippocampi und reorganisieren der neuronalen Netzwerk4,5, kognitive Flexibilität zu Verbesserungen beitragen dürfte. Darüber hinaus ändert globale Erhöhung der Aktivität des Gehirns von ECS die Fülle der Transkripte, wie eine Gehirn neurotropic Faktor6und mehrere Proteine, einschließlich metabotropen Glutamat-Rezeptor 17 und N-Methyl-D-Aspartat-abgeleitet (NMDA) Typ Glutamat-Rezeptor-Untereinheiten7. Diese Änderungen sind bei der Vermittlung von langfristigen Veränderung der Synapse Nummer, Struktur und Stärke im Hippocampus7,8,9beteiligt.
ECS-Modelle ist elektrischer Stimulation an Nagetieren per stereotaxically implantierte Elektroden, Hornhaut Elektroden oder Ohrelektroden zu evozieren generalisierten Stärkungsmittel-klonischen Anfällen10,11geliefert. Stereotaktischen Implantation von Elektroden beinhaltet Gehirnchirurgie und erfordert viel Zeit zur Verbesserung der Experimentator chirurgischen Fähigkeiten um Verletzungen zu minimieren. Weniger invasiven Hornhaut Elektroden könnte Korneaabnutzung und Trockenheit verursachen und erfordern Anästhesie. Die Verwendung von Ohr-Clip Elektroden umgeht diese Einschränkungen, weil sie auf Nagetiere ohne Chirurgie oder Anästhesie verwendet werden können und nur minimale Verletzungen verursachen. In der Tat fanden wir, dass aktuelle gelieferten zu wach Ratten über Ohr-Clip Elektroden zuverlässig induziert Stufe 4-5 Tonikum-klonischen Anfällen und synaptischen Proteine in ihrer Hippokampi10verändert.
Um die ECS-induzierte Fülle der synaptischen Proteine in bestimmten Gehirnregionen von den Nagetieren zu untersuchen, ist es wichtig, die experimentellen Methoden zu wählen, die am besten geeignete für ihre Erkennung und Quantifizierung. Subzellulären Fraktionierung des Gehirns ermöglicht für die grobe Lokalisierung der löslichen cytosolischen Proteine; Membranproteinen; Organell-Grenzen Proteine; auch Proteine in speziellen subzellulären Strukturen, wie z. B. die PSD12,13,14. Die PSD ist eine Dichte und gut organisierte subzelluläre Domain in Neuronen in denen synaptischen Proteine hochkonzentriert an und in der Nähe der postsynaptischen Membran12,13,15 sind. Die Isolation der PSD eignet sich für die Untersuchung von synaptischen Proteinen angereichert an der PSD, da dynamische Änderungen in die Fülle und die Funktion der postsynaptischen Glutamatrezeptoren, Gerüstbau Proteine und Signal Transduction Proteine in der PSD-12 , 15 , 16 , 17 sind korreliert mit synaptische Plastizität und die Synaptopathy in mehrere neurologische Störungen17,18beobachtet. Eine vorherige subzellulären Fraktionierung-Methode verwendet, um die PSD zu reinigen beteiligt die Isolation der Waschmittel-unlösliche Fraktion aus Roh Membran Bruchteil des Gehirns durch die differentielle Zentrifugation von Saccharose Steigungen14, 19. die größte Herausforderung bei dieser traditionellen Methode ist, dass es erfordert große Mengen von Nagetier Gehirne14,19. Vorbereitung von 10-20 Nagetiere zu isolieren, die PSD-Fraktion pro Behandlung erfordert umfangreiche Kosten- und Zeitaufwand und ist nicht praktisch durchführbar, wenn es viele Behandlungen gibt.
Um diese Herausforderung zu meistern, haben wir eine einfachere Methode angepasst, die direkt den PSD-Bruch ohne Saccharose Steigung Zentrifugierung20,21, isoliert und überarbeitet um auf PSD-Isolierung aus der Hippocampi einer einzigen Ratte anwendbar Gehirn. Unsere kleine PSD-Fraktionierung-Methode führt zu über 30-50 µg der PSD Proteine aus 2 Hippokampi, ausreichend für den Einsatz in mehreren biochemischen Tests, einschließlich Immunopräzipitation und westliche Beflecken. Westliche Beflecken, zeigt den Erfolg unserer Methode zur Isolierung von der PSD durch die Enthüllung der Bereicherung der postsynaptischen Dichte Protein 95 (PSD-95) und der Ausschluss von präsynaptischen Marker Synaptophysin und lösliche zytoplasmatischen Protein α-Tubulin. Unsere ECS Induktion und kleine PSD Fraktionierung Methoden sind leicht anpassbar an anderen Nagetier Gehirnregionen und bieten eine relativ einfache und zuverlässige Möglichkeit zur Bewertung der Auswirkungen von ECS auf die Expression von Proteinen, PSD.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschreiben wir eine ECS Induktionsmethode bei Ratten, die die globale Stimulation neuronaler Aktivität in ihren Hippokampi entlockt. ECS ist ein Tiermodell der Elektrokrampftherapie, die klinisch zur Behandlung von Drogen feuerfest depressive Störungen bei Menschen1,2,3. Trotz Verwendung der Elektrokrampftherapie Therapie zur Behandlung von schweren Depressionen bleibt die präzise zugrunde liegende Mechanismus unklar. D…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Dr. Eric C. Bolton für die Erlaubnis, seine Zentrifuge für die Fraktionierung und Dr. Graham H. Diering in Dr. Richard L. Huganir Lab an Johns Hopkins Universität für die Bereitstellung von uns mit dem kleinen Protokoll für die PSD-Fraktionierung zu verwenden.
Materials
| Spargue-Dawley rat | Charles River Laboratories | ECS supplies | |
| A pulse generator | Ugo Bsile, Comerio, Italy | 57800 | ECS supplies |
| MilliQ water purifying system | EMD Millipore | Z00Q0VWW | Subcellular fractionation supplies |
| Sucrose | Em science | SX 1075-3 | Subcellular fractionation supplies |
| Na4O7P2 | SIGMA-ALDRICH | 221368 | Subcellular fractionation supplies |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | SIGMA-ALDRICH | E9884 | Subcellular fractionation supplies |
| HEPES | SIGMA-ALDRICH | H0527 | Subcellular fractionation supplies |
| Okadaic acid | TOCRIS | 1136 | Subcellular fractionation supplies |
| Halt Protease Inhibitor | Thermo Scientific | 78429 | Subcellular fractionation supplies |
| NaVO3 | SIGMA-ALDRICH | 72060 | Subcellular fractionation supplies |
| EMD Millipore Sterito Sterile Vacuum Bottle-Top Filters | Fisher Scientific | SCGPS05RE | Subcellular fractionation supplies |
| Iris Scissors | WPI (World Precision Instruments) | 500216-G | Subcellular fractionation supplies |
| 30 mm tissue culture dish | Fisher Scientific | 08-772B | Subcellular fractionation supplies |
| Glass homogenizer and a Teflon pestle | VWR | 89026-384 | Subcellular fractionation supplies |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | DENVILLE SCIENTIFIC INC. | C2170 (1001002) | Subcellular fractionation supplies |
| Sorvall Legend XT/XF Centrifuge | Thermo Fisher | 75004521 | Subcellular fractionation supplies |
| Pierce BCA Protein Assay Reagent A, 500 mL | Thermo Fisher | #23228 | Western blot supplies |
| Pierce BCA Protein Assay Reagent B, 25 mL | Thermo Fisher | #1859078 | Western blot supplies |
| SDS-polyacrylamide gel (SDS-PAGE) | BIO-RAD | #4561086S | Western blot supplies |
| Running Buffer | Made in the lab | Western blot supplies. | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophorsis Cell for MiniPrecast Gels, 4-gel | BIO-RAD | #1658004 | Western blot supplies |
| Polyvinyl difluoride (PVDF) membrane | Milipore | IPVH00010 | Western blot supplies |
| Transfer Buffer | Made in the lab | Western blot supplies. | |
| Tris-base | Fisher Scientific | BP152-1 | Western blot supplies |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | Western blot supplies |
| Sodium dodecyl sulfate | SIGMA-ALDRICH | 436143 | Western blot supplies |
| Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | Western blot supplies |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | detergent for PSD isolation |
| Mini Trans-Blot Module | BIO-RAD | #1703935 | Western blot supplies |
| Nonfat instant dry milk | Great value | Western blot supplies | |
| Multi-purposee rotator | Thermo Scientific | Model-2314 | Western blot supplies |
| Hyblot CL Autoradiography Film | DENVILLE SCIENTIFIC INC. | E3018 (1001365) | Western blot supplies |
| Enhanced chemifluorescence substrate | Thermo Scientific | 32106 | Western blot supplies |
| a Konica SRX-101A film processor | KONICA MINOLTA | SRX-101A | Western blot supplies |
| Name of Antibody | |||
| PSD-95 | Cell Signaling | #2507 | Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit |
| Synaptophysin | Cell Signaling | #4329 | Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit |
| alpha-Tubulin | Santacruz | SC-5286 | Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse |
| GluN2B | Neuromab | 75-097 | Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse |
| GluA2 | Sigma-aldrich | Sab 4501295 | Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit |
| STEP | Santacruz | SC-23892 | Antibody dilution = 1:200-500, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse |
| Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoReserch laboratory | 715-035-150 | Antibody dilution = 1:2000-5000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey |
| Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoReserch laboratory | 711-035-152 | Antibody dilution = 1:2000-5000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey |
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