Elektrokrampftherapie Beschlagnahme (ECS) ist ein experimentellen Tiermodell der Elektrokrampftherapie für schwere Depressionen. ECS stimuliert weltweit Aktivität im Hippocampus, führt zu Synaptogenese und synaptische Plastizität. Hier beschreiben wir Methoden für ECS Induktion bei Ratten und subzellulären Fraktionierung von ihren Hippocampi, Beschlagnahme verursachten Veränderungen in synaptischen Proteine zu untersuchen.
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Methodenartikel
Elektrokrampftherapie Anfälle bei Ratten und Fraktionierung von ihren Hippocampi Beschlagnahme verursachten Veränderungen in den Proteinen der postsynaptischen Dichte prüfen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Elektrokrampftherapie Beschlagnahme (ECS) ist ein experimentellen Tiermodell der Elektrokrampftherapie, die effektivste Behandlung für schwere Depressionen. ECS generalisierte Stärkungsmittel-klonischen Anfällen mit niedrigen Mortalität und neuronalen Tod induziert und ist eine weit verbreitete Modell Bildschirm antiepileptische Drogen. Hier beschreiben wir eine ECS-Induktion-Methode in die kurze 55 mA Strom für 0,5 geliefert wird s zu männlichen Ratten 200-250 g Gewicht über Ohr-Clip-Elektroden. Diese bilaterale Stimulation produziert Stufe 4-5 klonische Anfällen, die dauerte ca. 10 s. Nach der Einstellung der akuten oder chronischen ECS Schein die meisten Ratten erholt, um Verhalten von nisht zu unterscheidend werden "keine Beschlagnahme" Ratten. Da ECS weltweit erhöht die Aktivität des Gehirns, dient es auch aktivitätsabhängige Veränderungen der synaptischen Proteine und deren Auswirkungen auf synaptische Stärke mit mehreren Methoden zu untersuchen. Insbesondere kann subzellulären Fraktionierung der postsynaptischen Dichte (PSD) in Kombination mit Western blotting für die quantitative Bestimmung der Fülle der synaptischen Proteine bei dieser spezialisierten synaptischen Struktur. Im Gegensatz zu früheren Fraktionierung-Methode, die große Menge an Nagetier Gehirne erfordert, beschreiben wir hier eine kleine Fraktionierung-Methode, um die PSD von Hippokampi einer einzigen Ratte ohne Saccharose-Gradienten-Zentrifugierung isoliert. Mit dieser Methode zeigen wir, dass die isolierte PSD Bruchteil postsynaptischen Membranproteine, einschließlich PSD95, GluN2B und GluA2 enthält. Präsynaptischen Marker Synaptophysin und lösliche zytoplasmatischen Protein α-Tubulin wurden von der PSD-Bruch, zeigen erfolgreiche PSD Isolierung ausgeschlossen. Darüber hinaus verringerte chronische ECS GluN2B Ausdruck in der PSD, die darauf hinweist, dass unsere kleine PSD Fraktionierung Methode angewendet werden kann, um die Änderungen im Hippokampus PSD Proteine aus einer einzigen Ratte nach genetischen, pharmakologische oder mechanische Behandlungen zu erkennen .
Einleitung
Elektrokrampftherapie wurde zur Behandlung von Patienten mit großen depressive Störungen, einschließlich schweren Medikamenten-resistenten Depression, bipolare Depression, Parkinson Erkrankungen und Schizophrenie1,2. In dieser Therapie wird Beschlagnahme durch elektrische Impulse geliefert an den Leiter der narkotisierten Patienten über Epicranial Elektroden1,2,3erzeugt. Wiederholte Gabe von ECS wurde klinisch vorteilhaft für resistente depressive Störungen1,2....
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Protokoll
Alle experimentellen Verfahren einschließlich tierische Themen wurden von der institutionellen Tiere kümmern und Nutzung hat an der University of Illinois at Urbana-Champaign genehmigt.
1. die Aufrechterhaltung einer Ratte-Kolonie
- Züchten Sie Sprague-Dawley Ratten (siehe die Tabelle der Materialien) zu und pflegen sie in standard-Bedingungen mit 12-h-hell-dunkel-Zyklus und ad libitum Zugang zu Nahrungsmitteln und Trinkwasser.
- Entwöhnen Sie die Ratte-Welpen an postnatalen Tag (P) 28 zu und beherbergen sie in Gruppen von 2-4 männlich oder weiblich Wurfgeschwistern.
- Markieren Sie die Schwänzen von....
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Ergebnisse
Mit dem detaillierten Verfahren präsentiert hier einen elektrischen Schlag (55 mA, 100 Impulse/s für 0,5 s) über die Ohr-Clip Elektroden induzierten einmalige Bühne 4-5 Tonikum-klonischen Anfällen bei Ratten (Abbildung 1A-B) geliefert. Insgesamt 8 von Ratten akute ECS Induktion empfangen und angezeigt Stufe 4-5 Tonikum-klonischen Anfällen. Die Anfälle dauerten ca. 10 s und alle Ratten, die innerhalb von 1-2 Minuten Beschlagnahme Einstellung w.......
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Diskussion
Hier beschreiben wir eine ECS Induktionsmethode bei Ratten, die die globale Stimulation neuronaler Aktivität in ihren Hippokampi entlockt. ECS ist ein Tiermodell der Elektrokrampftherapie, die klinisch zur Behandlung von Drogen feuerfest depressive Störungen bei Menschen1,2,3. Trotz Verwendung der Elektrokrampftherapie Therapie zur Behandlung von schweren Depressionen bleibt die präzise zugrunde liegende Mechanismus unklar. Da E.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.
Danksagungen
Die Autoren danken Dr. Eric C. Bolton für die Erlaubnis, seine Zentrifuge für die Fraktionierung und Dr. Graham H. Diering in Dr. Richard L. Huganir Lab an Johns Hopkins Universität für die Bereitstellung von uns mit dem kleinen Protokoll für die PSD-Fraktionierung zu verwenden.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Spargue-Dawley-Ratte | Charles River Laboratories | ECS liefert | |
| A Impulsgenerator | Ugo Bsile, Comerio, Italien | 57800 | ECS liefert |
| MilliQ Wasseraufbereitungssystem | EMD Millipore | Z00Q0VWW | Subzelluläre Fraktionierung liefert |
| Saccharose | Em science | SX 1075-3 | Subzelluläre Fraktionierung |
| ZubehörNa4O7P2 | SIGMA-ALDRICH | 221368 | Subzelluläre Fraktionierung liefert |
| Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) | SIGMA-ALDRICH | E9884 | Subzelluläre Fraktionierung |
| liefert HEPES | SIGMA-ALDRICH | H0527 | Subzelluläre Fraktionierung liefert |
| Okadainsäure | TOCRIS | 1136 | Versorgung mit subzellulärer Fraktionierung |
| Halt Protease-Inhibitor | Thermo Scientific | 78429 | Subzelluläre Fraktionierung liefert |
| NaVO3 | SIGMA-ALDRICH | 72060 | Subzelluläre Fraktionierung versorgt |
| EMD Millipore Sterito Sterile Vakuum-Flaschenaufsatzfilter | Fisher Scientific | SCGPS05RE | Subzelluläre Fraktionierung versorgt |
| Irisschere | WPI (World Precision Geräte) | 500216-G | Subzelluläre Fraktionierung versorgt |
| 30 mm Gewebekulturschale | Fisher Scientific | 08-772B | Subzelluläre Fraktionierung versorgt |
| Glashomogenisator und einen Teflonstößel | VWR | 89026-384 | Subzelluläre Fraktionierung versorgt |
| 1,7 mL Mikrozentrifugenröhrchen | DENVILLE SCIENTIFIC INC. | C2170 (1001002) | Subzelluläre Fraktionierung versorgt |
| Sorvall Legend XT/XF Zentrifuge | Thermo Fisher | 75004521 | für die subzelluläre Fraktionierung |
| Pierce BCA Protein Assay Reagenz A, 500 mL | Thermo Fisher | #23228 | Western Blot Zubehör |
| Pierce BCA Protein Assay Reagenz B, 25 mL | Thermo Fisher | #1859078 | Western Blot liefert |
| SDS-Polyacrylamid Gel (SDS-PAGE) | BIO-RAD | #4561086S | Western Blot Zubehör |
| Running Puffer | Hergestellt im Labor | Western-Blot-Zubehör. | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertikale Elektrophorsezelle für MiniPrecast-Gele, 4-Gel | BIO-RAD | #1658004 | Western Blot liefert |
| Polyvinyldifluorid (PVDF) Membran | Milipore | Western-Blot-Zubehör | |
| Transferpuffer | Hergestellt im Labor | Western-Blot-Zubehör. | |
| Tris-Base | Fisher Scientific | BP152-1 | Western Blot liefert |
| Glycin | Fisher Scientific | BP381-5 | Western Blot liefert |
| Natriumdodecylsulfat | SIGMA-ALDRICH | 436143 | Western Blot |
| liefert Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | Western Blot liefert |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | Reinigungsmittel für die PSD-Isolierung |
| Mini Trans-Blot Modul | BIO-RAD | #1703935 | Western Blot liefert |
| fettfreie Instant-Trockenmilch | Tolles Preis-Leistungs-Verhältnis | Western Blot | |
| Zubehör Mehrzweck-Rotator | Thermo Scientific | Model-2314 | Western Blot liefert |
| Hyblot CL Autoradiographie-Film | DENVILLE SCIENTIFIC INC. | E3018 (1001365) | Western-Blot liefert |
| Verstärktes Chemifluoreszenzsubstrat | Thermo Scientific | 32106 | Western Blot liefert |
| einen Konica SRX-101A Filmprozessor | KONICA MINOLTA | SRX-101A | Western Blot liefert |
| Name des AntikörpersPSD-95 | |||
| Cell Signaling | #2507 | Antikörperverdünnung = 1:500 - 1.000, Zeit = 9 - 12 h, Reaktionstemperatur = 4 ° C, Wirtsspezies = | |
| Kaninchen-Synaptophysin-Zellsignalisierung | #4329 | Antikörperverdünnung = 1:500 - 1.000, Zeit = 9 - 12 h, Reaktionstemperatur = 4 ° C, Wirtsspezies = Kaninchen | |
| alpha-Tubulin | Santacruz | SC-5286 | Antikörperverdünnung = 1:500 - 1.000, Zeit = 9 - 12 h, Reaktionstemperatur = 4 ° C, Wirtsspezies = Maus |
| GluN2B | Neuromab | 75-097 | Antikörperverdünnung = 1:500 - 1.000, Zeit = 9 - 12 h, Reaktionstemperatur = 4 ° C, Wirtsspezies = Maus |
| GluA2 | Sigma-aldrich | Sab 4501295 | Antikörperverdünnung = 1:500 - 1.000, Zeit = 9 - 12 h, Reaktionstemperatur = 4 ° C, Wirtsspezies = Kaninchen |
| STEP | Santacruz | SC-23892 | Antikörperverdünnung = 1:200 - 500, Zeit = 9 - 12 h, Reaktionstemperatur = 4 ° C, Wirtsspezies = Maus |
| Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoReserch laboratory | 715-035-150 | Antikörperverdünnung = 1:2.000-5.000, Zeit = 1 h, Reaktionstemperatur = RT, Wirtsspezies = Esel Peroxidas |
| AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoReserch laboratory | 711-035-152 | Antikörperverdünnung = 1:2.000-5.000, Zeit = 1 h, Reaktionstemperatur = RT, Wirtsspezies = Esel |
Referenzen
- Dierckx, B., Heijnen, W. T., van den Broek, W. W., Birkenhager, T. K. Efficacy of electroconvulsive therapy in bipolar versus unipolar major depression: a meta-analysis. Bipolar Disord. 14 (2), 146-150 (2012).
- McClintock, S. M., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
