חשמל התקפים חולדות ו Fractionation של Hippocampi שלהם כדי לבחון תפיסה-induced שינויים בחלבונים Postsynaptic צפיפות
Summary
חשמל התקף (ECS) הוא מודל חיה ניסיוני של נזעי חשמל עבור דיכאון חמור. ECS מעוררת באופן גלובלי פעילות ההיפוקמפוס, המוביל synaptogenesis פלסטיות סינפטית. כאן, אנו מתארים שיטות עבור ה-ECS אינדוקציה בחולדות, fractionation subcellular של hippocampi שלהם כדי לבחון שינויים התקף-induced חלבונים סינפטיים.
Abstract
חשמל התקף (ECS) הוא מודל חיה ניסיוני של נזעי חשמל, הטיפול היעיל ביותר לטיפול בדיכאון חמור. ECS המניע מוכללת ויהיו clonic טוניקה עם התמותה נמוכה ומוות עצביים, הוא מודל נפוץ לתרופות אנטי-אפילפטי מסך. כאן, אנו מתארים שיטה אינדוקציה ECS ב אשר מועבר זרם 55-mA קצרה עבור 0.5 s כדי זכר חולדות 200-250 גר’ במשקל באמצעות אלקטרודות האוזן-קליפ. גירוי דו צדדיים כאלה המיוצרים שלב 4-5 ויהיו clonic שנמשכה בערך 10 s. לאחר הפסקת ECS אקוטי או כרוני, שאם רוב חולדות משוחזרים בהתנהגותו לבין “אין תפיסה” חולדות. כי ECS מתרוממת באופן גלובלי פעילות מוחית, זה גם שימש כדי לבחון שינויים תלויי-פעילות של חלבונים סינפטיים והשפעתם על כוח סינפטית באמצעות מספר שיטות. בפרט, fractionation subcellular של צפיפות postsynaptic (PSD) בשילוב עם סופג המערבי מאפשר הקביעה כמותית של השפע של חלבונים סינפטיים-מבנה סינפטית מיוחד זה. בניגוד שיטה fractionation הקודם דורש כמות גדולה של המוח מכרסמים, נתאר כאן שיטה fractionation בקנה מידה קטן כדי לבודד את PSD מ hippocampi של עכברוש בודד, ללא סוכרוז צנטריפוגה הדרגתיות. באמצעות שיטה זו, אנו מראים כי השבר PSD מבודד מכיל חלבונים postsynaptic ממברנה, כולל PSD95, GluN2B ו- GluA2. סמן presynaptic synaptophysin, חלבון מסיס cytoplasmic α-טובולין נכללו השבר PSD, הוכחת בידוד PSD מוצלחת. יתר על כן, ECS כרונית ירד GluN2B ביטוי PSD, המציין כי שיטת fractionation שלנו PSD בקנה מידה קטן יכול להיות מיושם כדי לזהות את השינויים בחלבונים PSD בהיפוקמפוס מעכברוש יחיד לאחר טיפולים גנטיים, תרופתי או מכני .
Introduction
נזעי חשמל שימש לטיפול בחולים עם הפרעות דיכאון, כולל דיכאון עמיד לתרופות, דיכאון ביפולרי, פרקינסון מחלות של סכיזופרניה1,2. בטיפול זה, התקף נוצר על ידי גירוי חשמלי מועברים לראש המטופלים ומורדמת באמצעות epicranial אלקטרודות1,2,3. ניהול חוזרות של ECS כבר תועלת קלינית הפרעות דיכאון עמיד לתרופות-1,2,3. עם זאת, המכניזם המדויק שבבסיס יעילותם לטווח ארוך של האפקט נוגדות דיכאון אצל בני אדם נותר חמקמק. ECS במודל חיה של נזעי חשמל ומשמש באופן נרחב כדי לחקור את המנגנון הטיפולי. בחולדות, ECS אקוטי והן טיפול כרוני ECS לקדם נוירוג’נסיס למבוגרים ב hippocampi ולארגן מחדש את4,רשת עצבית5, שזה סביר לתרום לשיפור איכות על גמישות קוגניטיבית. יתר על כן, הרמה הכללית של פעילות מוחית על ידי ה-ECS הפיצולים השפע של תעתיקים, כגון מוח נגזר פקטור neurotropic6וחלבונים מרובות, כולל metabotropic גלוטמט קולטן 17 ו את N-מתיל-D-אספרטט (NMDA) סוג גלוטמט קולטן subunits7. שינויים אלה מעורבים תיווכה שינוי לטווח ארוך של מספר סינפסה, מבנה והעוצמה ב8,7,9ההיפוקמפוס.
ECS דגמים, גירוי חשמלי מועבר מכרסמים באמצעות אלקטרודות stereotaxically מושתל, אלקטרודות הקרנית או אלקטרודות האוזן לעורר מוכללת ויהיו clonic טוניקה10,11. Stereotaxic השרשת אלקטרודות כרוך ניתוח מוח ודורש זמן ניכר לשיפור מיומנויות ניתוח של הנסיין כדי למזער את הפגיעה. אלקטרודות הקרנית פולשני פחות יכול לגרום שחיקה הקרנית ויובש, דורש הרדמה. השימוש של האוזן-קליפ אלקטרודות עוקף מגבלות אלה כי הם יכולים לשמש על מכרסמים ללא ניתוח או הרדמה, לגרום פגיעה מינימלית. אכן, אנחנו נמצא כי חולדות נמסור ער הנוכחי באמצעות אלקטרודות האוזן-קליפ אמינה גורם ויהיו clonic טוניקה שלב 4-5, הפיצולים חלבונים סינפטיים שלהם hippocampi10.
כדי לבחון את השפע ECS-induced של חלבונים סינפטיים באזורי מוח מסוימים המכרסמים, חשוב לבחור את שיטות נסיוניות המתאימים ביותר שלהם זיהוי, כימות. Fractionation subcellular של המוח מאפשר הבידוד גולמי של חלבונים מסיסים cytosolic; קרום חלבונים; אברון-גבולות חלבונים; ואפילו חלבונים קונסטרוקציות subcellular מיוחדים, כגון PSD12,13,14. PSD הוא תחום subcellular צפוף ומאורגן היטב בנוירונים שבו חלבונים סינפטיים הם מרוכז בבית, ליד ה13,12,ממברנה postsynaptic15. בידודו של PSD שימושית לצורך המחקר של חלבונים סינפטיים מועשר ב PSD, מאז שינויים דינמיים שפע ומתפקדים של רצפטורים גלוטמט postsynaptic פיגומים חלבונים, חלבונים התמרה חושית אות ב ה PSD12 , 15 , 16 , 17 נמצאים בקורלציה עם פלסטיות סינפטית, את synaptopathy נצפו הפרעות נוירולוגיות מספר17,18. בשיטת subcellular fractionation הקודם כדי לטהר את PSD מעורב הבידוד של השבר דטרגנט-לא מסיס מן השבר ממברנה גולמי של המוח על ידי צנטריפוגה דיפרנציאלית סוכרוז מעברי צבע14, 19. האתגר העיקרי בשיטה מסורתית זו הוא כי זה דורש כמויות גדולות של מכרסם המוח14,19. הכנה של 10-20 מכרסמים כדי לבודד את השבר PSD לכל טיפול דורש השקעה זמן ועלות נרחב, והוא לא ממש ריאלי. אם ישנם טיפולים רבים.
כדי להתגבר על האתגר הזה, לנו יש להתאים שיטה פשוטה יותר ישירות מבודד השבר PSD, ללא סוכרוז צנטריפוגה הדרגתיות20,21, ומתוקנים שזה יהיה ישים PSD בידוד מ hippocampi של עכברוש בודד המוח. שיטת fractionation בקנה מידה קטן שלנו PSD התשואות על 30-50 µg של החלבונים PSD של hippocampi 2, מספיק לשימוש מספר מבחני הביוכימי, כולל immunoprecipitation, סופג המערבי. סופג המערבי מדגים את ההצלחה של השיטה שלנו עבור בידוד של PSD חושף את העשרת של צפיפות postsynaptic חלבון 95 (PSD-95) להדרה של סמן presynaptic synaptophysin, חלבון מסיס cytoplasmic α-טובולין. שלנו ECS אינדוקציה ושיטות בקנה מידה קטן PSD fractionation בקלות לצורכי אזורים במוח מכרסמים אחרים ומספקים דרך יחסית פשוטה ואמינה כדי להעריך את ההשפעות של ECS על הביטוי של חלבונים PSD.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, אנו מתארים בשיטת אינדוקציה ECS בחולדות מעורר גירוי כללי של הפעילות העצבית שלהם hippocampi. ECS הוא במודל חיה של נזעי חשמל, אשר נמצא בשימוש קליני לטיפול הפרעות דיכאון עקשן בסמים אצל בני אדם1,2,3. למרות השימוש נזעי חשמל לטיפול בדיכאון חמור, המנגנ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים תודה ומאפשר לנו להשתמש צנטריפוגה שלו fractionation, ד ר גראהם ה Diering במעבדה של ד ר ריצ’רד ל’ Huganir באוניברסיטת ג’ון הופקינס סיפק לנו הפרוטוקול בקנה מידה קטן עבור fractionation PSD ד ר אריק ג בולטון.
Materials
| Spargue-Dawley rat | Charles River Laboratories | ECS supplies | |
| A pulse generator | Ugo Bsile, Comerio, Italy | 57800 | ECS supplies |
| MilliQ water purifying system | EMD Millipore | Z00Q0VWW | Subcellular fractionation supplies |
| Sucrose | Em science | SX 1075-3 | Subcellular fractionation supplies |
| Na4O7P2 | SIGMA-ALDRICH | 221368 | Subcellular fractionation supplies |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | SIGMA-ALDRICH | E9884 | Subcellular fractionation supplies |
| HEPES | SIGMA-ALDRICH | H0527 | Subcellular fractionation supplies |
| Okadaic acid | TOCRIS | 1136 | Subcellular fractionation supplies |
| Halt Protease Inhibitor | Thermo Scientific | 78429 | Subcellular fractionation supplies |
| NaVO3 | SIGMA-ALDRICH | 72060 | Subcellular fractionation supplies |
| EMD Millipore Sterito Sterile Vacuum Bottle-Top Filters | Fisher Scientific | SCGPS05RE | Subcellular fractionation supplies |
| Iris Scissors | WPI (World Precision Instruments) | 500216-G | Subcellular fractionation supplies |
| 30 mm tissue culture dish | Fisher Scientific | 08-772B | Subcellular fractionation supplies |
| Glass homogenizer and a Teflon pestle | VWR | 89026-384 | Subcellular fractionation supplies |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | DENVILLE SCIENTIFIC INC. | C2170 (1001002) | Subcellular fractionation supplies |
| Sorvall Legend XT/XF Centrifuge | Thermo Fisher | 75004521 | Subcellular fractionation supplies |
| Pierce BCA Protein Assay Reagent A, 500 mL | Thermo Fisher | #23228 | Western blot supplies |
| Pierce BCA Protein Assay Reagent B, 25 mL | Thermo Fisher | #1859078 | Western blot supplies |
| SDS-polyacrylamide gel (SDS-PAGE) | BIO-RAD | #4561086S | Western blot supplies |
| Running Buffer | Made in the lab | Western blot supplies. | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophorsis Cell for MiniPrecast Gels, 4-gel | BIO-RAD | #1658004 | Western blot supplies |
| Polyvinyl difluoride (PVDF) membrane | Milipore | IPVH00010 | Western blot supplies |
| Transfer Buffer | Made in the lab | Western blot supplies. | |
| Tris-base | Fisher Scientific | BP152-1 | Western blot supplies |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | Western blot supplies |
| Sodium dodecyl sulfate | SIGMA-ALDRICH | 436143 | Western blot supplies |
| Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | Western blot supplies |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | detergent for PSD isolation |
| Mini Trans-Blot Module | BIO-RAD | #1703935 | Western blot supplies |
| Nonfat instant dry milk | Great value | Western blot supplies | |
| Multi-purposee rotator | Thermo Scientific | Model-2314 | Western blot supplies |
| Hyblot CL Autoradiography Film | DENVILLE SCIENTIFIC INC. | E3018 (1001365) | Western blot supplies |
| Enhanced chemifluorescence substrate | Thermo Scientific | 32106 | Western blot supplies |
| a Konica SRX-101A film processor | KONICA MINOLTA | SRX-101A | Western blot supplies |
| Name of Antibody | |||
| PSD-95 | Cell Signaling | #2507 | Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit |
| Synaptophysin | Cell Signaling | #4329 | Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit |
| alpha-Tubulin | Santacruz | SC-5286 | Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse |
| GluN2B | Neuromab | 75-097 | Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse |
| GluA2 | Sigma-aldrich | Sab 4501295 | Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit |
| STEP | Santacruz | SC-23892 | Antibody dilution = 1:200-500, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse |
| Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoReserch laboratory | 715-035-150 | Antibody dilution = 1:2000-5000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey |
| Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoReserch laboratory | 711-035-152 | Antibody dilution = 1:2000-5000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey |
References
- Dierckx, B., Heijnen, W. T., van den Broek, W. W., Birkenhager, T. K. Efficacy of electroconvulsive therapy in bipolar versus unipolar major depression: a meta-analysis. Bipolar Disord. 14 (2), 146-150 (2012).
- McClintock, S. M., et al. Multifactorial determinants of the neurocognitive effects of electroconvulsive therapy. J ECT. 30 (2), 165-176 (2014).
- Jelovac, A., Kolshus, E., McLoughlin, D. M. Relapse following successful electroconvulsive therapy for major depression: a meta-analysis. Neuropsychopharmacology. 38 (12), 2467-2474 (2013).
- Inta, D., et al. Electroconvulsive therapy induces neurogenesis in frontal rat brain areas. PLoS One. 8 (7), 69869 (2013).
- Segi-Nishida, E., Warner-Schmidt, J. L., Duman, R. S. Electroconvulsive seizure and VEGF increase the proliferation of neural stem-like cells in rat hippocampus. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (32), 11352-11357 (2008).
- Zetterstrom, T. S., Pei, Q., Grahame-Smith, D. G. Repeated electroconvulsive shock extends the duration of enhanced gene expression for BDNF in rat brain compared with a single administration. Brain Res Mol Brain Res. 57 (1), 106-110 (1998).
- Altar, C. A., et al. Electroconvulsive seizures regulate gene expression of distinct neurotrophic signaling pathways. J Neurosci. 24 (11), 2667-2677 (2004).
- Ploski, J. E., Newton, S. S., Duman, R. S. Electroconvulsive seizure-induced gene expression profile of the hippocampus dentate gyrus granule cell layer. J Neurochem. 99 (4), 1122-1132 (2006).
- Pusalkar, M., et al. Acute and Chronic Electroconvulsive Seizures (ECS) Differentially Regulate the Expression of Epigenetic Machinery in the Adult Rat Hippocampus. Int J Neuropsychopharmacol. 19 (9), (2016).
- Jang, S. S., Royston, S. E., Lee, G., Wang, S., Chung, H. J. Seizure-Induced Regulations of Amyloid-beta, STEP61, and STEP61 Substrates Involved in Hippocampal Synaptic Plasticity. Neural Plast. 2016 (2123748), 1-13 (2016).
- Limoa, E., et al. Electroconvulsive shock attenuated microgliosis and astrogliosis in the hippocampus and ameliorated schizophrenia-like behavior of Gunn rat. J Neuroinflammation. 13 (1), 230 (2016).
- Vinade, L., et al. Affinity purification of PSD-95-containing postsynaptic complexes. J Neurochem. 87 (5), 1255-1261 (2003).
- Dosemeci, A., Tao-Cheng, J. H., Vinade, L., Jaffe, H. Preparation of postsynaptic density fraction from hippocampal slices and proteomic analysis. Biochem Biophys Res Commun. 339 (2), 687-694 (2006).
- Westmark, P. R., Westmark, C. J., Jeevananthan, A., Malter, J. S. Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient. J Vis Exp. (3196), e1-e9 (2011).
- Sheng, M. Molecular organization of the postsynaptic specialization. Proc Natl Acad Sci USA. 98 (13), 7058-7061 (2001).
- Sheng, M., Hoogenraad, C. C. The postsynaptic architecture of excitatory synapses: a more quantitative view. Annu Rev Biochem. 76, 823-847 (2007).
- Ehrlich, I., Malinow, R. Postsynaptic density 95 controls AMPA receptor incorporation during long-term potentiation and experience-driven synaptic plasticity. J Neurosci. 24 (4), 916-927 (2004).
- Schnell, E., et al. Direct interactions between PSD-95 and stargazin control synaptic AMPA receptor number. Proc Natl Acad Sci USA. 99 (21), 13902-13907 (2002).
- Bermejo, M. K., Milenkovic, M., Salahpour, A., Ramsey, A. J. Preparation of synaptic plasma membrane and postsynaptic density proteins using a discontinuous sucrose gradient. J Vis Exp. (91), e51896 (2014).
- Tan, H. L., Queenan, B. N., Huganir, R. L. GRIP1 is required for homeostatic regulation of AMPAR trafficking. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (32), 10026-10031 (2015).
- Diering, G. H., Gustina, A. S., Huganir, R. L. PKA-GluA1 coupling via AKAP5 controls AMPA receptor phosphorylation and cell-surface targeting during bidirectional homeostatic plasticity. Neuron. 84 (4), 790-805 (2014).
- Luttjohann, A., Fabene, P. F., van Luijtelaar, G. A revised Racine’s scale for PTZ-induced seizures in rats. Physiol Behav. 98 (5), 579-586 (2009).
- Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. -. F., Chang, R. C. -. C. Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region. J Vis Exp. (7), e269 (2007).
- Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse. J Vis Exp. (1543), e1-e6 (2009).
- Kim, M. J., et al. Synaptic accumulation of PSD-95 and synaptic function regulated by phosphorylation of serine-295 of PSD-95. Neuron. 56 (3), 488-502 (2007).
- Won, S., Incontro, S., Nicoll, R. A., Roche, K. W. PSD-95 stabilizes NMDA receptors by inducing the degradation of STEP61. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (32), 4736-4744 (2016).
- Qu, L., Akbergenova, Y., Hu, Y., Schikorski, T. Synapse-to-synapse variation in mean synaptic vesicle size and its relationship with synaptic morphology and function. J Comp Neurol. 514 (4), 343-352 (2009).
- Delaney, A. J., Sedlak, P. L., Autuori, E., Power, J. M., Sah, P. Synaptic NMDA receptors in basolateral amygdala principal neurons are triheteromeric proteins: physiological role of GluN2B subunits. J Neurophysiol. 109 (5), 1391-1402 (2013).
- Zhang, Y., et al. The tyrosine phosphatase STEP mediates AMPA receptor endocytosis after metabotropic glutamate receptor stimulation. J Neurosci. 28 (42), 10561-10566 (2008).
- Braithwaite, S. P., et al. Regulation of NMDA receptor trafficking and function by striatal-enriched tyrosine phosphatase (STEP). Eur J Neurosci. 23 (11), 2847-2856 (2006).
- Paul, S., Nairn, A. C., Wang, P., Lombroso, P. J. NMDA-mediated activation of the tyrosine phosphatase STEP regulates the duration of ERK signaling. Nat Neurosci. 6 (1), 34-42 (2003).
- Malberg, J. E., Eisch, A. J., Nestler, E. J., Duman, R. S. Chronic antidepressant treatment increases neurogenesis in adult rat hippocampus. J Neurosci. 20 (24), 9104-9110 (2000).
- Kandratavicius, L., et al. Animal models of epilepsy: use and limitations. Neuropsychiatr Dis Treat. 10, 1693-1705 (2014).
- Loscher, W. Animal models of epilepsy for the development of antiepileptogenic and disease-modifying drugs. A comparison of the pharmacology of kindling and post-status epilepticus models of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Res. 50 (1-2), 105-123 (2002).
- Stromgren, L. S., Juul-Jensen, P. EEG in unilateral and bilateral electroconvulsive therapy. Acta Psychiatr Scand. 51 (5), 340-360 (1975).
- Abrams, R., Volavka, J., Fink, M. EEG seizure patterns during multiple unilateral and bilateral ECT. Compr Psychiatry. 14 (1), 25-28 (1973).
- Duman, R. S., Vaidya, V. A. Molecular and cellular actions of chronic electroconvulsive seizures. J ECT. 14 (3), 181-193 (1998).
- Andre, V., Ferrandon, A., Marescaux, C., Nehlig, A. Electroshocks delay seizures and subsequent epileptogenesis but do not prevent neuronal damage in the lithium-pilocarpine model of epilepsy. Epilepsy Res. 42 (1), 7-22 (2000).
- Sinclair, D., et al. Effects of sex and DTNBP1 (dysbindin) null gene mutation on the developmental GluN2B-GluN2A switch in the mouse cortex and hippocampus. J Neurodev Disord. 8 (14), 1-19 (2016).
- Sakaida, M., et al. Electroconvulsive seizure-induced changes in gene expression in the mouse hypothalamic paraventricular nucleus. J Psychopharmacol. 27 (11), 1058-1069 (2013).
- Hu, J. H., et al. Homeostatic scaling requires group I mGluR activation mediated by Homer1a. Neuron. 68 (6), 1128-1142 (2010).
- Blackstone, C. D., et al. Biochemical characterization and localization of a non-N-methyl-D-aspartate glutamate receptor in rat brain. J Neurochem. 58 (3), 1118-1126 (1992).
- Blackstone, C. D., Levey, A. I., Martin, L. J., Price, D. L., Huganir, R. L. Immunological detection of glutamate receptor subtypes in human central nervous system. Ann Neurol. 31 (6), 680-683 (1992).
- Lau, L. F., et al. Interaction of the N-methyl-D-aspartate receptor complex with a novel synapse-associated protein, SAP102. J Biol Chem. 271 (35), 21622-21628 (1996).
- Braithwaite, S. P., Paul, S., Nairn, A. C., Lombroso, P. J. Synaptic plasticity: one STEP at a time. Trends Neurosci. 29 (8), 452-458 (2006).
- Jang, S. S., et al. Regulation of STEP61 and tyrosine-phosphorylation of NMDA and AMPA receptors during homeostatic synaptic plasticity. Mol Brain. 8 (1), 55 (2015).
