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Neuroscience

電気けいれん発作になったラットとシナプス後密度タンパク質のてんかん発作による変化を調べることで

Published: August 15, 2017 doi: 10.3791/56016
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2
1Department of Molecular and Integrative Physiology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Neuroscience Program, University of Illinois at Urbana-Champaign

Summary

電気けいれん発作 (ECS) 重度のうつ病に対する電気けいれん療法の実験動物モデルであります。ECS はグローバル、シナプス形成、シナプス可塑性につながる海馬の活動を刺激します。ここでは、ラットの ECS 誘導、シナプス蛋白質のてんかん発作による変化を調べることになったの細胞レベル下の分別の方法について述べる.

Abstract

電気けいれん発作 (ECS) 重度のうつ病の最も効果的な治療、電気けいれん療法の実験動物モデルであります。ECS は低い死亡率と神経細胞死全般強直間代けいれん発作を誘発して画面抗てんかん薬に広く使われているモデルです。ここでは、ECS 誘導法について述べる短い 55 mA の電流が 0.5 に渡されるかどれで男性に s ラット耳クリップ電極を介して重量で 200-250 g。このような二国間の刺激生成期続いた約 10 4 5 間代発作 s。急性または慢性の ECS の中止後、ほとんどのラットの行動と区別する回復偽「発作がない「ラットの。ECS は、世界的に脳の活動を高めます、活動依存的シナプス蛋白質と複数のメソッドを用いたシナプス強度への影響の変化を確認するそれ使用されてもいます。特に、西部のしみとの組み合わせでシナプス後密度 (PSD) の細胞レベル下の分別のこの特殊なシナプス構造体でシナプス蛋白質の豊富な定量可能します。齧歯動物の頭脳の大規模な量を必要とする従来の分別方法と対照をなして我々 はショ糖勾配遠心法なし、単一のラットのなったから psd ファイルを分離するための小規模な画法をここで説明します。このメソッドを使用して、分離された PSD 割合にシナプス後膜蛋白質、PSD95、GluN2B、GluA2 などが含まれていることを紹介します。シナプス マーカー シナプトフィジンと可溶性細胞質タンパク質 α-チューブリンが成功した psd ファイルの分離を示す PSD 分数から除外しました。さらに、慢性的な ECS 減少単一のラットからの海馬の PSD タンパク質の遺伝的、薬理学的、または機械的治療後変更を検出する小規模 PSD 分別手法を適用できることを示す、PSD の GluN2B 式.

Introduction

電気けいれん療法は、重度の薬剤抵抗性うつ病、双極性うつ病、パーキンソン病、統合失調症1,2を含む、大鬱病性障害患者を治療するために使用されています。この療法は、帽状電極1,2,3経由で麻酔をかけられた患者の頭に配信電気刺激による発作が生成されます。ECS の反復的な管理は、薬剤抵抗性うつ病1,2,3に臨床的に有益されています。しかし、ヒトの抗うつ効果の長期的効果の正確なメカニズムは、とらえどころのない推移しています。ECS は、電気けいれん療法の動物モデルで、その治療メカニズムを調査する使用は広く。齧歯類で、なったで成体神経新生を促進する ECS 急性と慢性の ECS 治療と再編成ニューラル ネットワーク4、5、認知の柔軟性に寄与する可能性があります。さらに、ECS による脳活動のグローバルな昇格、転写の豊富さを変更脳由来神経向性因子6、および代謝型グルタミン酸受容体 17 N メチル D アスパラギンなど複数のタンパク質など(NMDA) 型グルタミン酸受容体サブユニット7。これらの変更は、シナプス結合の数、構造、および海馬7,8,9の強度の長期的な修正を媒介に関与しています。

ECS のモデルで電気刺激がてんかん注入電極、角膜電極または耳電極を介して全般強直間代けいれん発作10,11を換起する齧歯動物に配信されます。脳定位固定装置注入電極の脳外科手術では、実験者の損傷を最小限に抑える手術技能を改善するために膨大な時間を必要とします。少ない侵襲角膜電極や麻酔を必要とする角膜上皮剥離や乾燥原因になります。耳クリップ電極の使用は、手術や麻酔なしの齧歯動物で使用できる最小限の損傷の原因となるために、これらの制限をバイパスします。確かに、耳クリップ電極を介して現在に目を覚まし配信ラットは確実にステージ 4 5 強直間代発作を誘発してなった10代でシナプス蛋白質の変化がわかった。

齧歯動物の脳の特定領域におけるシナプス蛋白質の ECS による豊かさを調べると、その検出と定量に最も適している実験方法を選択することが重要です。脳の細胞レベル下の分別は、水溶性ゾル性細胞質蛋白質の粗分離膜蛋白質;オルガネラ範囲蛋白質;そして PSD12,13,14など、特別な細胞レベル下の構造の蛋白質。PSD は、ニューロンのシナプス蛋白質は、シナプス後膜12,13,15に近い高濃度で整然と密な細胞内ドメインです。PSD の分離は豊かさとシナプス グルタミン酸受容体、足場蛋白質および PSD12のシグナル伝達タンパク質の機能のダイナミックな変化から、PSD で濃縮シナプス蛋白質の研究に有用,15,16,17は、シナプス可塑性といくつかの神経疾患17,18, synaptopathy に関連付けられます。PSD を浄化するために使用される従来の細胞レベル下の分別のショ糖勾配14,差動遠心分離によって脳の粗膜画分から洗剤不溶性分画の分離に関与19. この従来の方法での大きな課題は大量の齧歯動物の脳1914,が必要です。10-20 の齧歯動物の治療あたり PSD 画分を分離するための準備は広範なコストと時間の投資が必要です、多くの治療法がある場合、実質的に不可能です。

このような課題を克服するために、我々 は直接 PSD 画分のショ糖勾配遠心法20,21, なしを分離し、単一のラットのなったから psd ファイルを分離するために適用できるようにそれを修正するより簡単な方法を適応しています。脳。私たち小規模 PSD 画法結果約 2 なった、免疫沈降とウェスタンブロットなどを含むいくつかの生化学的な試金で使用するために十分なから PSD タンパク質の 30-50 μ g。西部にしみが付くことシナプス後密度タンパク質 95 (PSD-95) の濃縮とシナプス マーカー シナプトフィジンおよび可溶性細胞質タンパク質 α-チューブリンの除外を明らかにして psd ファイルを分離する方法の成功例を示します。私たち ECS の誘導と小規模の PSD の分別方法は他の齧歯動物の頭脳領域に容易に適応、ECS の PSD タンパク質の発現に及ぼす影響を評価するための比較的シンプルで信頼性の高い方法を提供します。

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Protocol

動物科目を含むすべての実験手順は、機関の動物は気とイリノイ大学アーバナ ・ シャンペーン校で利用委員会によって承認されています。

1. ラット コロニーの維持

  1. ラット (材料の表を参照) を繁殖し、12 時間の明暗サイクルとアドリブへの食料と水の標準的な条件でそれらを維持します。
  2. (P) 28 生後日ラットの子犬を引き離すし、2-4 の男性または女性の同腹子のグループにそれらの家します。
  3. 非毒性の永久的な黒のマーカーで識別のためにラットの尾をマークします。
  4. 週 3 回雄ラットの重さし、自分の bodyweights を記録します。

2. ECS マシンの準備

  1. 7:30、駆除動物準備室のベンチとベンチに ECS マシン (パルス発生器) を配置します。
  2. ふた付きのきれいで、空のケージで 200-250 グラムの重量を量る個々 の雄ラットを配置します。ECS の誘導と扱われるすべての雄ラットのためにこれを繰り返します。30 分間、慣らすラットをしましょう。
  3. ラットは檻の中で娯楽 habituating、ECS 誘導用パルスジェネレーター ショック期間 0.5、0.5 ms のパルス幅 100 パルス/秒の周波数に設定 s、および電流 55 mA (図 1A)。
  4. パルス発生器を準備するには、「リセット」ボタンを押すと「準備」のボタンが点灯していることを確認します。耳クリップがパルス発生器に接続されていないと、数秒間の「ショック」ボタンを押していることを確認します。
    注: この時点で、パルス発生器は ECS 誘導のため準備ができています。
  5. 耳クリップをパルス発生器に差し込みます。

3. 急性 ECS の誘導

注: 参照してください図 1B、トップ パネル。

  1. 滅菌生理食塩水で耳クリップを濡れているし、彼らが飽和していることを確認します。
  2. 生理食塩水に浸したガーゼでそれらをラップすることによって滅菌生理食塩水でネズミの耳を濡れています。一度彼らはウェット、ガーゼを削除します。
  3. 耳、軟骨の主要なバンドを越える位置ごとの 1 つのクリップを取り付けます。
  4. 真のループが確立されている ECS マシンで確認します。ない場合は、エラー メッセージまたは「1」の読書がコンピューターに表示されます。
  5. 厚い, 非金属製の手袋を着用します。手袋をはめた手でラットを軽く押しながら、数秒間の「ショック」ボタンを押すし、ゆっくりと発作を観察するラットのグリップを解放します。(NS)「発作がない「偽のコントロールは、同じラットを扱う、現在を提供しませんします。
  6. クローヌスが始まる耳クリップを外し、「口と顔の運動」が含まれています (ステージ 1)、「頭うなずいて」(ステージ 2)「前肢クローヌス」改訂ラシーンのスケール22よると焼付き挙動を記録 (第 3 期)、「前肢クローヌスと飼育」(ステージ 4) と「飼育と前肢クローヌスと落ちる」(5 期)。発作は約 10 に続く必要があります s。タイマーを使用して発作の持続時間を記録します。
  7. 発作終了後、ラットをその家のケージに戻ります。ラットの発作からの回復性を確認する別の 5 分のラットを監視します。単独でケージに入ってそれを維持し、回復室にケージを返します。
  8. 次のラットに ECS 誘導を繰り返します。
  9. 残りの日の朝は少なくとも 1 回と午後まで彼らは実験のために安楽死させて次の日に、ラットを監視します。
    注: ECS 誘導法の臨床症状に注意を要求する付随的副作用としてと 。たとえば、ECS 誘導プロトコルは、ラットに 15 s、原因の不必要な苦痛よりも長く続く発作を引き起こすことができます。この場合、(10 mg/kg, i. p.) はジアゼパムあるいはペントバルビ タール (25-30 mg/kg, i. p.) を使用して発作を終了します。ラットは、呼吸困難や厳しい行動異常発作停止を開発する場合、は、斬首刑に続いて炭酸ガス吸入による安楽死します。

4. 慢性 ECS の誘導

注: は、図 1B下のパネルを参照してください。

  1. 前述の手順 1-3 で、連続 7 日間の朝の同じ時間で 1 日あたり 1 つの ECS を誘発します。
  2. ラット 2 回自宅に返される翌日ケージを監視します。

5. 均質化となったラットの分別

注: は、図 2を参照してください。

  1. 320 mM ショ糖、ピロりん酸ナトリウム 5 mM、1 mM EDTA、10 mM HEPES pH 7.4 を含む新鮮な均質化バッファー (溶液) を準備 200 nM オカダ酸とプロテアーゼ阻害剤。フィルター滅菌真空ろ過 0.22 μ m 孔径のフィルターを使用してバッファー、氷の上に置きます。
  2. 特定の時点で次の ECS の急性または慢性 ECS (図 1) ポイントは、斬罪にギロチンを使用してその後 5-10 分のための CO2吸入ラットを安楽死させます。
  3. 脳を取り外して解剖23,24を前述のように氷の上に金属製のプレートになった。
  4. 30 mm の培養に 1 匹のラットからの 2 つの場所なった皿し、はさみを使用して小さな断片にそれらをミンチします。
  5. 1 mL ピペットを使用してマニュアルのガラス ホモジナイザーにみじん切りにしたなったを転送し、1 mL の冷たい均質化バッファー (溶液、ステップ 5.1) を追加します。丸杵をガラス ホモジナイザーに挿入します。ガラスのホモジナイザーは、氷の上ですが、ゆっくりと着実にストローク上下、1 分間 10-15 回杵に海馬組織の小片が消えるまで。
  6. 磨砕液を 1 mL ピペットを使用して 1.7 mL 遠心チューブに転送し、不溶性の組織と核 (P1 分数) を含むペレットから postnuclear 上清 (S1 分数) を区切るための 4 ° C で 10 分間の 800 x g でホモジネートを遠心分離します。1 mL ピペットを使用して 2 つの独立した新しい 1.7 mL 遠心管に 50 μ L と S1 の端数の 950 μ L を転送、これらのチューブを氷に保存できます。氷の上の P1 分数ペレットを保存します。
  7. 13,800 x g と別の培養上清 (S2 分数) ゾル性細胞質可溶性タンパク質を豊かに 4 ° C で 10 分間の S1 分数 (950 μ L) を遠心し、ペレット (P2 分画)、濃縮膜結合蛋白質、シナプトソーム蛋白質を含みます。氷の上で格納、S2 分数を 1 mL ピペットを使用して新しい 1.7 mL 遠心機に転送。
  8. 498 μ 1 mL ピペットを使用して冷たい水で (P2 分数) ペレットを再懸濁します。1 M HEPES (pH 7.4) の 2 μ l 添加 4 mM HEPES (pH 7.4) の最終的な集中を達成するために 20 μ L ピペットを使用します。30 分ストアの撹拌で 4 ° C で氷で再懸濁の P2 分数をインキュベートします。
  9. BCA アッセイを用いた S1、S2、P2 の分数のタンパク質濃度を決定します。1 mg/mL の濃度を達成し、使用するまで-80 ° C で保存する各画分に 50 mM HEPES (pH 7.4) を追加または PSD を分離する P2 端数を処理します。

6. 粗膜蛋白質 (P2) 画分から psd ファイルの分離

  1. (LS2 分数) の分離の上澄みと分離のペレット (LP1 分数) を分離する遠心分離機の 25,000 x g と 4 ° C で 20 分間 P2 分数 (500 μ L)。氷の上で格納、LS2 分数を 1 mL ピペットを使用して新しい 1.7 mL 遠心チューブに転送。
  2. 1 1 mL ピペットを使用して PBS バッファー x 1% 洗剤の 250 μ L 混合 50 mM HEPES (pH 7.4) の 250 μ L で LP1 ペレットを再懸濁します。15 分のために穏やかな攪拌と 4 ° C で孵化させなさい。
  3. 遠心分離機の再懸濁の LP1 ペレット 25,000 x g とペレット (PSD 分数) から清 (非 PSD 分数) を分離する 4 ° C で 3 時間。1.7 mL の微量遠心チューブに上清を除去し、50 mM HEPES (pH 7.4) の 100 μ L で PSD ペレットを再懸濁します 200 μ L ピペットを使用しています。
  4. LS2、非-PSD、PSD 分数 BCA アッセイを用いたタンパク質濃度を決定します。1 mg/mL の濃度を達成するために使用されるまで-80 ° C で保存し各画分に 50 mM HEPES (pH 7.4) を追加します。
    注: 手順 5-6 (すなわち液 A、HEPES バッファー、および PBS バッファー) で使用されているすべてのソリューションは、イオン ・有機物・微粒子の無料純水ですべきであります。

7. 西部にしみが付くこと

  1. 氷の上の各蛋白分画を解凍します。(S2、P2、および PSD 1 mg/ml) 各画分の 12 μ L を 20 μ L ピペットを使用して新しい 1.7 mL 遠心チューブに転送します。
  2. 5 x SDS サンプルバッファーの 3 μ L を追加し、75 の ° c の水浴中で 30 分間インキュベートします。部屋の温度 (RT) にサンプルを冷却します。
  3. 蛋白質のサンプルの 10 μ L を 20 μ L ピペットを使用して 4-20% 勾配 15 よく櫛の SDS ポリアクリルアミド ゲル電気泳動 (SDS-PAGE) ゲルのウェルに読み込みます。SDS-PAGE 装置、80-100 V 連続したバッファーのゲルを実行 (25 mM トリス、グリシン、190 mM と 0.1 %sds; pH 8.3)。
    注: 各ゲルは、NS ラットおよび次の急性または慢性の ECS 異なる時点で ECS ラットからの蛋白質のサンプルを含める必要があります。
  4. 25-30 V で転送装置で二フッ化ビニル (PVDF) 膜への SDS のページから蛋白質のゲルの転送 (60 mA) 転送バッファーに 9-12 時間 (25 mM トリス、190 mM グリシンと 20% メタノール; pH 8.3)。
  5. PVDF 膜に転送装置から外し、トリス緩衝生理食塩水 (TBS) 室温多目的ローテーター上で 5 分間洗浄
  6. 5% の牛乳の膜をブロックし、0.1 %1 のため TBS でトゥイーン 20 は、洗浄バッファーで一次抗体 (表 1) でそれをインキュベート (1% のミルクと 0.1 %tbs でトゥイーン 20) 4 ° C で多目的回転子の一泊 (希薄のための材料表を参照してください)。
  7. 洗浄バッファーの 4 回 10 分ずつの膜を洗浄し、ペルオキシダーゼ (HRP) をインキュベーションして-標識二次抗体室温多目的回転子の 1 h のバッファーを洗濯するに
  8. 5 分 10 分のための 4 回膜洗浄バッファーの放置と TBS を洗ってください。
  9. 1 分用強化 chemifluorescence 基板の膜をインキュベートし、x 線フィルムにそれを公開します。フィルムのプロセッサを露出したフィルムを現像します。

8 西部のしみの定量化

  1. 西部のしみの TIFF ファイルとしてこのファイルをコンピューターに保存でスキャン。
  2. 「ファイル」、「画像を開く、」右矢印「グレー スケール」下のグレースケール画像として ImageJ プログラムで西部のしみを開く
  3. ImageJ ツールバーから長方形選択ツールを選択し、興味の蛋白質の 1 つの西部のしみの帯域をカバーする四角形を描画します。
  4. 「分析」の下で地域と選択したバンドの平均密度を取得する「測定」をヒットします。
  5. そのサイズと形状を変更することがなく背景領域に四角形を移動します。領域と背景の平均密度に 8.4 手順を繰り返します。
  6. 興味の蛋白質のバンドのバック グラウンド減算密度を与える西部のしみバンドの背景バンドの平均密度の値を減算します。
  7. 関心のすべての西部のしみバンド 8.2 8.6 手順を繰り返します。
  8. Α-チューブリン; などのハウスキーピング遺伝子産物のバック グラウンド減算バンド密度による興味の蛋白質のバンドのバック グラウンド減算密度を分割します。この手順では、興味の蛋白質の正規化された値を生成します。

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Representative Results

ここで説明されて詳細な手順を使用して 1 つの電気ショック (55 mA、100 パルス/秒 0.5 s) ラット (図 1A B) 4-5 強直間代発作へ耳クリップ電極による臨時ステージを届け。ラットの合計 8 は急性の ECS 誘導を受け、ステージ 4-5 強直間代発作を表示しました。発作が続いた約 10 s、およびすべてのラットが発作停止の 1-2 分以内に回復します。偽「発作がない」ラットは電気ショック受けなかったし、したがって発作が表示されませんでした。合計 4 せ物のラットが使用されました。慢性の ECS 誘導ラットは 7 日間連続の 1 日あたり 1 つの電気ショックを受けた、ステージ 4-5 各電気ショック (図 1A B) 時に強直間代発作を表示されます。ラットの合計 8 が慢性の ECS 誘導を受け、合計 4 せ物のラットは「発作がない」ラットとして使用されました。慢性 ECS を受信したほとんどのラットは行動区別されたから偽の「発作がない」ラット、少数の開発されたボディ震え、7th電気ショックによる探索的活動を削減。

調べる活動のグローバルな昇格の ECS 誘起変更蛋白質の表現、なった場合、ラットでささげられた 3 h、24 h 急性 ECS の後、24 h と 96 h に慢性的な ECS 治療 (図 1B) の最終的な ECS 後。各ラットから 2 つなった急速に解剖され私たちの最適化された小規模な分別のプロトコル (図 2) を受けます。2 つなった不溶性組織と核 (S1 分数) の無料の初期のホモジネートだった再粗膜ペレットを含むから可溶性細胞質タンパク質 (S2 分数) を含む上清を分離する 10 分間 13,800 × g で遠心分離シナプトソーム (P2 分数) (図 2)。私達の西部のしみの検出細胞質タンパク質 α-チューブリンの成功の分別を示す急性および慢性の ECS (図 3および図 4) 投与ラットからなったの S2 分数が P2 分数ではなく、粗膜ペレットから細胞質可溶性蛋白質。

PSD95 膜準グアニル酸キナーゼ (MAGUK) 家族のメンバーと PSD12,18,25の主要なコンポーネントであります。PSD95, NMDA 受容体サブユニット GluN2B P2 分数が S2 の分数 (図 3および図 4) ないでのみ検出された.(図 3および図 4) なった S2 画分と比較して P2 分数で別グルタミン酸作動性 α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic 酸 (AMPA) 受容体サブユニット GluA2 の強い発現が検出されましたシナプス後膜蛋白質が粗膜 P2 分数ペレットで濃縮されていることを示します。興味深いことに、シナプス小胞タンパク質シナプトフィジンおよび内在性膜タンパク質線条体濃縮チロシン脱燐酸化酵素 61 (ステップ61)26が S2、P2 の分数 (図 3および図 4) も同様に検出されました。シナプス小胞の小さいサイズを考慮した-39 の nm27とエンドソームの平均径、粗膜ペレット (P2 分数) を分離する遠心分離ないかもしれないすべてのシナプス小胞とエンドソームをペレットに十分な。これらの結果は一緒に私たち粗分別のプロトコルできます豊かな膜結合タンパク質と膜貫通タンパク質シナプス小胞とおそらく P2 の粗膜画分のエンドソームに関連付けられていないことを示します。

だった粗膜 P2 率調べる活動のグローバルな昇格の ECS 誘起は、なったシナプス蛋白質の発現を変化させる場合、冷たい水で分離、HEPES バッファーで再停止され、を分離するために 20 分間 25,000 × g で遠心分離、分離ペレット (LP1) (図 2)。LP1 ペレットは、HEPES 緩衝液 1% トリトン X-100 洗剤を含むで再停止されるされ、25,000 x g PSD ペレット (図 2) を取得する 3 h 以上で遠心分離します。PSD 分数の後続の西部のしみの検出 PSD95、GluN2B、および GluA2 (図 3および図 4) シナプス蛋白質17,25,28知られています。しかし、PSD の分数は、α-チューブリンを欠けていたと、重要なは、シナプス マーカー シナプトフィジン (図 3および図 4)。PSD の分数 (図 3および図 4) ステップ61GluN2B と GluA2 を脱、彼らの負の調節因子29,30,31として機能が見つかりませんでした。ステップの6126PSD の濃縮 PSD95 を介したシナプスの排除を示す最近の報告書と一致。完全に、私たち小規模な画法が正常に P2 原油の膜画分から PSD タンパク質を分離が示唆されました。

西部にしみが付くことの定量化は、GluN2B 式は P2 分数で不変だったが、急性 ECS 後増加傾向に 3 h、24 h で PSD 分数で表示を明らかにした (n = 4) (図 3B)。GluA2 式は、3 h で次の急性 ECS (図 3C) 24 h P2 と psd ファイルの両方で変更されませんでした。24 h と慢性 ECS 後 96 h、GluN2B 式 P2 割合で減少傾向を表示し、PSD 分数で有意に減少した (24 h: p < 0.05、n = 4; 48 h: p < 0.01、n = 4) (図 4B)。対照的に、慢性的な ECS は P2 と PSD の分画の GluA2 式を影響しなかった (n = 4) (図 4C)。

Figure 1
図 1: 急性 ECS および慢性の ECS の誘導のスキーマします。(A) A ラット耳クリップ電極と電気ショックによるパルス発生器に接続されていた (55 mA、100 パルス/秒 0.5 s) ステージ 4 5 強直間代発作を引き出すために適用されました。(B) 急性 ECS は、1 つの電気ショックによって誘導されました。慢性的な ECS は、7 日間連続の 1 日あたり 1 つの電気ショックによって誘発されました。表示時間のポイントは、ECS の急性または慢性の ECS 誘導、なったの解剖の前に最後の ECS の誘導期間を表します。偽の「発作がない」(NS) 制御ラットは同じ処理されたが、電気ショックを受けなかった。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 2
図 2: S2、P2、および単一のラットのなったから PSD 画分を分離する細胞レベル下の分別のワークフロー 。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 3
図 3:海馬 S2、P2、およびその受信 NS または急性 ECS のラットから PSD 分数におけるシナプス蛋白質の検査。(A) 代表的な西部のしみは s2、P2、NMDA 受容体サブユニット GluN2B、AMPA 受容体、GluA2、ステップ61の蛋白質の表現を表示し、偽「発作がない」(NS) ことラットのラットとのなったから PSD 分数を受けた急性 ECS。細胞質可溶性タンパク質の α-チューブリンは S2 画分に濃縮されています。シナプトフィジンはシナプス小胞タンパク質であり、PSD 分数ではなく P2 分数の原油の膜で濃縮されます。Psd ファイル 95 は、P2 と PSD の両方の分画に濃縮されています。(B・C)GluN2B の定量化 (B) と GluA2 (C) 3 と 24 h 後急性 ECS で P2 と PSD の分数 (n = 時点あたり 4 ラット)。GluN2B と GluA2 P2 分数で表現と α-チューブリン S2 画分に正常化しました。GluN2B と GluA2 PSD 分数で表現は、PSD 分数の psd ファイル 95 に正規化されました。データはパーセント ± SEM. として表示されますこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 4
図 4:海馬 S2、P2、およびその受信 NS または慢性の ECS のラットから PSD 分数におけるシナプス蛋白質の検査。代表西部のしみの α-チューブリン;シナプトフィジン;ステップ61;シナプス蛋白質、偽「発作がない」(NS) ことラットのラットとのなったから S2、P2、および PSD の分数で PSD95 GluN2B、および GluA2、を含む慢性 ECS を受け取った。細胞質可溶性タンパク質の α-チューブリンは S2 画分に濃縮されています。シナプトフィジンはシナプス小胞タンパク質であり、PSD 分数ではなく P2 分数の原油の膜で濃縮されます。Psd ファイル 95 は、P2 と PSD の両方の分画に濃縮されています。(B ・ C)GluN2B の定量化 (B) と GluA2 (C) 24、96 慢性 ECS 後 h P2 と PSD の分数 (n = 時点あたり 4 ラット)。GluN2B と GluA2 P2 分数で表現は、S2 の割合で α-チューブリンに正規化されました。GluN2B と GluA2 PSD 分数で表現は、PSD 分数の psd ファイル 95 に正規化されました。% ± SEM; としてデータが表示されます。* p < 0.05 * * p < コントロール (ANOVA および Tukey の事後テスト) に比べ 0.01。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

分数 蛋白分画 タンパク質マーカー
P1 核 ヒストン H1
S1 細胞質膜/ チューブリンは (骨格) と GAPDH (細胞質)
P2 原油シナプトソーム AMPA と NMDA 受容体サブユニット
S2 細胞質/光膜 GAPDH (細胞質) と LAMP1 (リソソーム)
シナプトソーム膜 Synaptosome/ミトコンドリア AMPA と NMDAR 受容体サブユニット、シナプトフィジン (シナプス マーカー)
PSD PSD AMPA と NMDA 受容体サブユニット、PSD95、PICK1、CaMKII

表 1: 内分を区別するために蛋白質のマーカーおよび抗体のリスト。

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Discussion

ここでは、ラットになったニューロン活動のグローバルな刺激を引き出す ECS 誘導法について述べる。ECS 人間1,2,3薬物難治性うつ病の治療に臨床的に使用される電気けいれん療法の動物モデルであります。重度のうつ病の治療に電気けいれん療法の使用にもかかわらず、正確なメカニズムは不明します。ECS の齧歯動物の反 depressant のような行動を誘導する海馬神経新生4,32を刺激するため、ECS が新しい場合を調査するため広く使用されています、海馬歯状回で大人生まれるニューロン抗うつ剤動作5,32に貢献します。

ECS は、てんかん注入電極、角膜電極または耳クリップ電極33,34を通じて現在の配送時に齧歯動物で重度の軽度の一般化された強直間代発作を誘発します。患者の脳波は、片側刺激は35,36よりも二国間の電気刺激がより顕著となった一般化された発作を引き起こすことを明らかにしました。私たち ECS 誘導法36両側刺激により誘発されるヒトの発作を模倣、両耳に接続されている非侵襲的耳クリップ電極を通じて現在の配達によって強直間代発作が引き起こされます。我々 は、鎮静剤や麻酔を適用するラットの ECS の効果をチェックしていない、それは麻酔薬をラットに与えるかもしれない電気刺激によって誘発される発作の程度を減らすことができる実行可能な事実を麻酔状態は、生理学的脳ネットワークの強化された抑制と湿らせた興奮口調で関連付けられています。さらに、ECS 誘導法の重要なステップは、実験段階 4-5 を引き出すために電流の強さをダイヤルする強直 - 間代発作年齢、重量、および齧歯動物の種に基づく一般化です。 私たち ECS の誘導法は、目を覚まし男性 Sprague-dawley ラット 200-250 グラムの重量を量るに数秒以内 4 5 ステージ発作を誘導するために最適化されています。ECS 誘導ラット麻酔状態の下でを使用している場合、ステージ 4 を 5 に至る発作の成功誘導強度、期間、および現在配信の頻度を変更ください。

ECS はまたニューロンの多動性を刺激し、死亡率は非常に低い33chemoconvulsants、ピロカルピン、kainite、てんかん重積状態を誘発する、引き起こすなどとは対照的と急性一過性発作を引き起こしての利点します。自発的再発性発作と重度の組織学的変化37,38の慢性的な症状は。ECS は、画面抗てんかん薬33,34に日常的に利用されているが ECS の急性および慢性の ECS 慢性てんかんの生成で起因しない、従って使用できません動物モデルのエナンチオマーを勉強します。代わりに、ECS は広く式またはシナプスの永続的な変化に貢献する修飾シナプス蛋白質の生体内で脳活動の広範な標高が変更範囲を調べるため採用されています。強度と構造 (図 3および図 4)10,40。本研究ではのみ ECS 後 PSD タンパク質の量に雌ラットの周期、発情の予期せぬ効果を除外するのに雄ラットを使用しました。しかし、前頭葉と海馬39、発情周期を支配するホルモンの変化は、基底可能性があります影響を意味の PSD 地域の psd ファイル 95 および SAP102 を含む足場タンパク質に男女差がないことが分かったPSD タンパク質の量。

ECS が新生ニューロン、シナプス形成、シナプス可塑性5,6,7,8,9,の変化を誘発する程度を調べる複数の方法が採用されています。11,40。 興奮性シナプス電流 (EPSC) の電気生理学的記録は広く21シナプスのグルタミン酸作動性興奮性シナプスの結合強度の変化の検出に使用します。たとえば、マウスの急性の ECS41の層 II-III の皮質錐体ニューロンにおける興奮性シナプス強度の恒常的ダウンスケー リング ミニチュア EPSC 録音が明らかに。しかし、ECS によって誘発されるシナプス可塑性に寄与するシナプス蛋白質の同定は電気生理学的記録は、遺伝子ノックアウトと組み合わせる必要がありますので挑戦的なまたは特定の候補者のシナプス蛋白質のノックダウン。強度と有効性興奮性シナプス伝達17,18,25のシナプス後膜とシナプス蛋白質の PSD の濃縮でグルタミン酸受容体のレベルの変化を調節します。免疫組織化学は、ECS によるシナプス蛋白質の発現変化を検討する使用ことができます、この手法時のみ 1-2 候補シナプス蛋白質を調べることができ、特にそれらを認識してよく検証された抗体が必要です。非特異染色せずには。

西部のしみとの組み合わせで脳組織の細胞レベル下の分別では、電気生理学および免疫組織化学 ECS によって変更されますシナプス蛋白質を識別するに上の利点を提供しています。脳組織の細胞レベル下の分別は可溶性細胞質蛋白質 (S2 分数) 原油の膜 (P2 分数) から小胞体とゴルジ体膜、膜結合型細胞内小器官、膜などを分離する迅速かつ原油生化学的手法と43,44,フォーム シナプトソーム42再シールするシナプス ターミナル膜。PSD の割合がさらにすることができますシナプス蛋白質42,43,44を豊かにする P2 画分から分離しました。PSD の端数の公平なプロテオーム解析では、ECS によってそのレベルが変更されますすべての PSD タンパク質を識別できます。西部にしみが付くことは、無指定バンドから容易に識別することができます PSD の蛋白質の表現の変更を検討する急速に実行できます。

以前脳分別法大量の齧歯動物の脳組織42,43,44, この手法の使用のために挑戦を調べるとき可溶化や個人から膜タンパク質が必要です。齧歯動物の脳または単一の脳から脳の特定地域。定量的遺伝子組換え動物または特定の治療を受けている動物に別および対照動物から 1 つの脳領域からプロテオームを比較する需要が高まっています。したがって、改訂し、単一のラットの 2 つなったから原油の可溶性及び膜画分を分離する伝統的な脳画法を最適化しました。膜結合型 PSD95 が検出されたに対し、細胞質タンパク質 α-チューブリン P2 の分数の欠如によって示されるように、私たち小規模粗分別のプロトコルが正常に原油 P2 膜分画細胞質 S2 可溶性画分を分離した、P2 がない S2 分数 (図 3、および図 4A)。ここで説明した方法を使用して、我々 が定量的に示される急性 ECS は大幅増加61式をステップと GluN2B と、細胞外シグナル調節キナーゼ 1/2 原油で、その基板のチロシンリン酸化を減少P2 細胞膜画分ラット急性 ECS10次 48 h になった。

突然、S2 に含まれる分数シナプトフィジン;ステップ61;はるかに低い程度、GluA2 (図 3、および図 4A)。ステップ61は、小胞体 (ER) と PSD45に関連する糖膜蛋白26です。粗膜ペレット (P2 分数) を分離する遠心分離しないペレット シナプトソームとしてエンドソームを含むすべてのシナプス小胞に十分なされている可能性があります、GluA2 とステップ61を含むリソソーム不可能です。それにもかかわらず、GluN2B、GluA2、および PSD95 の濃縮をオフにし、P2 画分における α-チューブリンの欠如を示す膜結合タンパク質や膜貫通蛋白質でシナプス小胞に関連付けられていないことの分別のプロトコル豊かにできるとP2 原油の膜画分にエンドソーム。

P2 の粗膜画分に含まれるシナプトソーム P2 分数におけるシナプス蛋白質の試験の活動依存的変化の 1 つの制限は変更の正確な位置を特定できないこと。PSD の濃縮のシナプス蛋白質が決定すると、psd ファイルを分離するためさらに生化学的な分別が使用できます。以前 PSD 分別法齧歯動物の脳組織の大規模な量が必要です(すなわち、 10-20 齧歯動物の頭脳) とショ糖勾配42,43,44。この従来の方法は単一のラットの 2 つになったから、PSD 分数の十分な量を分離する十分な我々 は直接ショ糖勾配20,21 なし PSD 画分を分離する簡単な方法を適応しています。.このメソッドの結果約西部にしみが付くことを含むいくつかの生化学的な試金のため十分な PSD タンパク質の 30-50 μ g。私たちのメソッド PSD のほんの一部に集中するため知られている、PSD95、GluN2B、および GluA2 を豊かにし慢性の ECS 誘導 (図 3および図 4) PSD の GluN2B 式の変化を検知します。

ここでは、我々 の定量的な西部のしみの分析は、3 h で次の急性 ECS (図 3C) 24 h P2 と PSD の分画の GluA2 式で大きな変化を認めなかった。GluN2B 式 P2 分数で不変だったが、急性 ECS (図 3B)、シナプスとシナプスの差動制御の可能性を示唆している後に 3 h、24 h で PSD の割合で増加傾向を表示GluN2B を含む NMDA 受容体。また GluN2B 式 P2 分数で慢性の ECS の後減少傾向を表示し、次の慢性 ECS (図 4B) 24、96 h で PSD 分数で有意に減少したことが観測されました。非常に投機的 ECS の反復的な誘導 PSD から GluN2B のような除去は櫛谷サイトに PSD 膜または横方向拡散から直接内面を含む複数のメカニズムによって媒介される可能性があります。著しく神経活動の長期強化を前報を考慮した61式をステップを増加させるし、示唆 P2 分数の培養海馬神経細胞46GluN2B のチロシンリン酸化を軽減その P2 と PSD 画分慢性 ECS は、ために可能性があります後に GluN2B 式の減少は61式をステップと櫛谷膜から GluN2B の後続の除去を強化しました。

要約すると、我々 は我々 小規模 PSD 画法は、ECS 誘導プロトコルとの組み合わせでできる生体内で区別するために私たちグルタミン酸受容体の活動依存的規制シナプス後膜でを示しています。合計原形質膜とシナプス膜を含みます。このプロトコルでは、興奮性シナプスのシナプス蛋白質に簡単に適用することができ、組織重量に基づいて各ソリューションのボリュームを調整することによって他の齧歯動物のなったまたは他の頭脳領域の変更ことができます。したがって、私たちの小規模の PSD の画法は多目的、各動物種と遺伝的、薬理学的、または機械的処理シナプス蛋白質の生体内変化を検討する将来のアプリケーションに採用されることができます。

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Disclosures

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

Acknowledgments

著者は博士エリック C. ボルトンをありがとう PSD 分別のため小規模のプロトコルと私たちを提供するためのジョンズ ・ ホプキンス大学で博士リチャード ・ l. Huganir の研究室での分別および博士グラハム H. Diering 彼の遠心分離機を使用することが可能します。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Spargue-Dawley rat Charles River Laboratories ECS supplies
A pulse generator Ugo Bsile, Comerio, Italy 57800 ECS supplies
MilliQ water purifying system EMD Millipore Z00Q0VWW Subcellular fractionation supplies
Sucrose Em science SX 1075-3 Subcellular fractionation supplies
Na4O7P2 SIGMA-ALDRICH 221368 Subcellular fractionation supplies
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) SIGMA-ALDRICH E9884 Subcellular fractionation supplies
HEPES SIGMA-ALDRICH H0527 Subcellular fractionation supplies
Okadaic acid TOCRIS 1136 Subcellular fractionation supplies
Halt Protease Inhibitor Thermo Scientific 78429 Subcellular fractionation supplies
NaVO3 SIGMA-ALDRICH 72060 Subcellular fractionation supplies
EMD Millipore Sterito Sterile Vacuum Bottle-Top Filters Fisher Scientific SCGPS05RE Subcellular fractionation supplies
Iris Scissors WPI (World Precision Instruments) 500216-G Subcellular fractionation supplies
30 mm tissue culture dish Fisher Scientific 08-772B Subcellular fractionation supplies
Glass homogenizer and a Teflon pestle VWR 89026-384 Subcellular fractionation supplies
1.7 mL microcentrifuge tube DENVILLE SCIENTIFIC INC.  C2170 (1001002) Subcellular fractionation supplies
Sorvall Legend XT/XF Centrifuge  Thermo Fisher 75004521 Subcellular fractionation supplies
Pierce BCA Protein Assay Reagent A, 500 mL Thermo Fisher #23228 Western blot supplies
Pierce BCA Protein Assay Reagent B, 25 mL Thermo Fisher #1859078 Western blot supplies
SDS-polyacrylamide gel (SDS-PAGE) BIO-RAD #4561086S Western blot supplies
Running Buffer Made in the lab Western blot supplies. 
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophorsis Cell for MiniPrecast Gels, 4-gel BIO-RAD #1658004 Western blot supplies
Polyvinyl difluoride (PVDF) membrane  Milipore IPVH00010 Western blot supplies
Transfer Buffer Made in the lab Western blot supplies. 
Tris-base Fisher Scientific BP152-1 Western blot supplies
Glycine Fisher Scientific BP381-5 Western blot supplies
Sodium dodecyl sulfate SIGMA-ALDRICH 436143 Western blot supplies
Methanol  Fisher Scientific A454-4 Western blot supplies
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500 detergent for PSD isolation
Mini Trans-Blot Module  BIO-RAD #1703935 Western blot supplies
Nonfat instant dry milk Great value Western blot supplies
Multi-purposee rotator  Thermo Scientific Model-2314 Western blot supplies
Hyblot CL Autoradiography Film DENVILLE SCIENTIFIC INC.  E3018 (1001365) Western blot supplies
Enhanced chemifluorescence substrate  Thermo Scientific 32106 Western blot supplies
a Konica SRX-101A film processor KONICA MINOLTA SRX-101A Western blot supplies
Name of Antibody
PSD-95 Cell Signaling #2507 Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit
Synaptophysin Cell Signaling #4329 Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit
alpha-Tubulin Santacruz SC-5286 Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse
GluN2B Neuromab 75-097 Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse
GluA2 Sigma-aldrich Sab 4501295 Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit
STEP Santacruz SC-23892 Antibody dilution = 1:200 - 500, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse
Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoReserch laboratory 715-035-150 Antibody dilution = 1:2,000-5,000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey
Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoReserch laboratory 711-035-152 Antibody dilution = 1:2,000-5,000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey

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神経科学、問題 126、けいれん発作、海馬、細胞レベル下の分別、シナプス後密度、NMDA 受容体、西部にしみが付くこと
電気けいれん発作になったラットとシナプス後密度タンパク質のてんかん発作による変化を調べることで
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Jang, S. S., Jeong, H. G., Chung, H. … More

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