Elektrokonvulsiv anfall hos råttor och fraktionering av deras Hippocampi att undersöka beslag-inducerade förändringar i postsynaptiska densitet proteiner
Summary
Elektrokonvulsiv beslag (ECS) är en experimentell djurmodell för elektrokonvulsiv terapi vid svår depression. ECS stimulerar globalt aktiviteten i hippocampus, vilket leder till synaptogenes och synaptisk plasticitet. Här, beskriver vi metoder för ECS induktion hos råttor och subcellulär fraktionering av deras hippocampi att undersöka beslag-inducerade förändringar i synaptic proteiner.
Abstract
Elektrokonvulsiv beslag (ECS) är en experimentell djurmodell för elektrokonvulsiv terapi, den mest effektiva behandlingen för svår depression. ECS inducerar generaliserade tonisk-kloniska anfall med låg mortalitet och neuronala dödsfall och är en allmänt använd modell till skärmen antiepileptika. Här, vi beskriver en metod för induktion av ECS i som en kort 55-mA ström levereras för 0,5 s till manliga råttor 200-250 g i vikt via örat-clip elektroder. Sådana bilaterala stimulering produceras stage 4-5 kloniska anfall som varade ca 10 s. Efter upphörande av akut eller kronisk ECS, de flesta råttor återhämtat sig för att vara behaviorally omöjlig att skilja från sham ”inga beslag” råttor. Eftersom ECS globalt höjer hjärnans aktivitet, har det också använts för att undersöka aktivitet-beroende förändringar av synaptic proteiner och deras effekter på synaptisk styrka med flera metoder. I synnerhet tillåter subcellulär fraktionering av postsynaptiska densiteten (PSD) i kombination med Western blotting för kvantitativ bestämning av överflödet av synaptic proteiner vid denna specialiserade synaptic struktur. I motsats till en föregående fraktionering metod som kräver stor mängd gnagare hjärnor, beskriver vi här en småskalig fraktionering metod för att isolera PSD från hippocampi på en enda råtta, utan sackaros gradient centrifugering. Med den här metoden visar vi att den isolera PSD-fraktionen innehåller postsynaptiska membranproteiner, inklusive PSD95, GluN2B och GluA2. Presynaptiska markör synaptophysin och lösliga cytoplasmiska proteinet α-tubulin uteslöts från den PSD fraktionen, demonstrerar framgångsrika PSD isolering. Kronisk ECS minskade dessutom GluN2B uttryck i PSD, som visar att vår småskaliga PSD fraktionering metod kan användas för att upptäcka förändringar i hippocampus PSD proteiner från en enda råtta efter genetiska, farmakologiska eller mekaniska behandlingar .
Introduction
Elektrokonvulsiv terapi har använts för att behandla patienter med stora depressiva störningar, inklusive svår resistent depression, bipolär depression, Parkinsons sjukdomar och schizofreni1,2. I denna behandling genereras beslag av elektrisk stimulans levereras till chefen för sövda patienter via epicranial elektroder1,2,3. Upprepad administrering av ECS har gynnat kliniskt resistenta depressiva störningar1,2,3. Den exakta mekanismen bakom den långsiktiga effekten av antidepressiva effekten hos människa har dock förblivit svårfångade. ECS är en djurmodell för elektrokonvulsiv terapi och används ofta för att undersöka dess terapeutiska mekanism. Hos gnagare, både akut ECS och långtidsbehandling med ECS främja adult neurogenes i hippocampi och omorganisera den neurala nätverk4,5, som sannolikt kommer att bidra till förbättringar i kognitiv flexibilitet. Dessutom förändrar global förhöjning av hjärnans aktivitet av ECS överflödet av avskrifter, såsom en hjärna härrör neurotropa faktor6och flera proteiner, inklusive metabotropa glutamat receptor 17 och den N-metyl-D-aspartat (NMDA) typ glutamat receptor subenheter7. Dessa förändringar är inblandade i medla långsiktig ändring av synaps nummer, struktur och styrka i hippocampus7,8,9.
I ECS modeller levereras elektrisk stimulering till gnagare via stereotaxically implanterade elektroder, korneal elektroder eller örat elektroder att framkalla generaliserade tonisk-kloniska anfall10,11. Stereotaxic implantation av elektroder innebär hjärnkirurgi och kräver betydande tid att förbättra de experimenter’s kirurgiska färdigheter för att minimera skadan. Mindre invasiva korneal elektroder kan orsaka korneal nötning och torrhet och kräver narkos. Användning av örat-clip elektroder kringgår dessa begränsningar eftersom de kan användas på gnagare utan kirurgi eller anestesi och minimal skada. Faktiskt, fann vi att nuvarande levereras till vaken råttor via örat-clip elektroder tillförlitligt inducerar etapp 4-5 tonisk-kloniska anfall och förändrar synaptic proteiner i deras hippocampi10.
För att undersöka ECS-inducerad överflödet av synaptic proteiner i de delar av hjärnan av gnagare, är det viktigt att välja de experimentella metoder som är mest lämpade för deras upptäckt och kvantifiering. Subcellulär fraktionering av hjärnan tillåter för råolja isolering av lösliga cytosoliska proteiner; membranproteiner; organell-bounds proteiner; och även proteiner i särskilda subcellulära strukturer, såsom PSD12,13,14. PSD är en tät och väl organiserad subcellulär domän i nervceller där synaptic proteiner är starkt koncentrerad vid och nära den postsynaptiska membran12,13,15. Isolering av PSD är användbart för studiet av synaptic proteiner berikad på PSD, sedan dynamiska förändringar i överflöd och funktion av postsynaptiska glutamatreceptorer, byggnadsställningar proteiner och signaltransduktion proteiner i PSD12 , 15 , 16 , 17 är korrelerade med synaptisk plasticitet och den synaptopathy som observerats i flera neurologiska17,18. En tidigare subcellulär fraktionering metod som används för att rena PSD inblandade isoleringen av den olösliga i tvättmedel fraktionen från rå membran fraktionen av hjärnan genom den differentiella centrifugeringen av sackaros lutningar14, 19. den stora utmaningen med denna traditionella metod är att den kräver stora mängder gnagare brains14,19. Beredning av 10-20 gnagare att isolera den PSD fraktionen per behandling kräver omfattande kostnads- och investering i tid och är inte praktiskt genomförbart om det finns många behandlingar.
För att övervinna denna utmaning, har vi anpassat en enklare metod som direkt isolerar den PSD fraktionen, utan sackaros gradient centrifugering20,21, och revideras för att vara tillämplig på PSD isolering från hippocampi på en enda råtta hjärnan. Våra småskaliga PSD fraktionering metod ger om 30-50 µg av PSD proteiner från 2 hippocampi, tillräckligt för användning i flera biokemiska analyser, inklusive immunoprecipitation och Western blotting. Western blotting visar framgången av vår metod för att isolera PSD genom att avslöja anrikningen av postsynaptiska densitet protein 95 (PSD-95) och uteslutandet av presynaptiska markör synaptophysin och lösliga cytoplasmiska proteinet α-tubulin. Våra ECS induktion och småskaliga PSD fraktionering metoder är lätt att anpassa till andra gnagare hjärnan och ger en relativt enkel och pålitlig sätt att utvärdera effekterna av ECS på uttrycket av PSD proteiner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här beskriver vi ett ECS induktion metod hos råttor som framkallar den globala stimuleringen av neuronal aktivitet i deras hippocampi. ECS är en djurmodell för elektrokonvulsiv terapi, som används kliniskt för behandling drog behandlingsresistenta depressiva störningar i människor1,2,3. Trots användning av elektrokonvulsiv terapi för att behandla svår depression, oklar den exakta underliggande mekanismen. Eftersom ECS…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Dr Eric C. Bolton för att tillåta oss att använda hans centrifug för fraktionering och Dr Graham H. Diering i Dr Richard L. Huganir lab vid John Hopkins University för att förse oss med småskaliga protokollet för den PSD fraktioneringen.
Materials
| Spargue-Dawley rat | Charles River Laboratories | ECS supplies | |
| A pulse generator | Ugo Bsile, Comerio, Italy | 57800 | ECS supplies |
| MilliQ water purifying system | EMD Millipore | Z00Q0VWW | Subcellular fractionation supplies |
| Sucrose | Em science | SX 1075-3 | Subcellular fractionation supplies |
| Na4O7P2 | SIGMA-ALDRICH | 221368 | Subcellular fractionation supplies |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | SIGMA-ALDRICH | E9884 | Subcellular fractionation supplies |
| HEPES | SIGMA-ALDRICH | H0527 | Subcellular fractionation supplies |
| Okadaic acid | TOCRIS | 1136 | Subcellular fractionation supplies |
| Halt Protease Inhibitor | Thermo Scientific | 78429 | Subcellular fractionation supplies |
| NaVO3 | SIGMA-ALDRICH | 72060 | Subcellular fractionation supplies |
| EMD Millipore Sterito Sterile Vacuum Bottle-Top Filters | Fisher Scientific | SCGPS05RE | Subcellular fractionation supplies |
| Iris Scissors | WPI (World Precision Instruments) | 500216-G | Subcellular fractionation supplies |
| 30 mm tissue culture dish | Fisher Scientific | 08-772B | Subcellular fractionation supplies |
| Glass homogenizer and a Teflon pestle | VWR | 89026-384 | Subcellular fractionation supplies |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | DENVILLE SCIENTIFIC INC. | C2170 (1001002) | Subcellular fractionation supplies |
| Sorvall Legend XT/XF Centrifuge | Thermo Fisher | 75004521 | Subcellular fractionation supplies |
| Pierce BCA Protein Assay Reagent A, 500 mL | Thermo Fisher | #23228 | Western blot supplies |
| Pierce BCA Protein Assay Reagent B, 25 mL | Thermo Fisher | #1859078 | Western blot supplies |
| SDS-polyacrylamide gel (SDS-PAGE) | BIO-RAD | #4561086S | Western blot supplies |
| Running Buffer | Made in the lab | Western blot supplies. | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophorsis Cell for MiniPrecast Gels, 4-gel | BIO-RAD | #1658004 | Western blot supplies |
| Polyvinyl difluoride (PVDF) membrane | Milipore | IPVH00010 | Western blot supplies |
| Transfer Buffer | Made in the lab | Western blot supplies. | |
| Tris-base | Fisher Scientific | BP152-1 | Western blot supplies |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | Western blot supplies |
| Sodium dodecyl sulfate | SIGMA-ALDRICH | 436143 | Western blot supplies |
| Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | Western blot supplies |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | detergent for PSD isolation |
| Mini Trans-Blot Module | BIO-RAD | #1703935 | Western blot supplies |
| Nonfat instant dry milk | Great value | Western blot supplies | |
| Multi-purposee rotator | Thermo Scientific | Model-2314 | Western blot supplies |
| Hyblot CL Autoradiography Film | DENVILLE SCIENTIFIC INC. | E3018 (1001365) | Western blot supplies |
| Enhanced chemifluorescence substrate | Thermo Scientific | 32106 | Western blot supplies |
| a Konica SRX-101A film processor | KONICA MINOLTA | SRX-101A | Western blot supplies |
| Name of Antibody | |||
| PSD-95 | Cell Signaling | #2507 | Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit |
| Synaptophysin | Cell Signaling | #4329 | Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit |
| alpha-Tubulin | Santacruz | SC-5286 | Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse |
| GluN2B | Neuromab | 75-097 | Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse |
| GluA2 | Sigma-aldrich | Sab 4501295 | Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit |
| STEP | Santacruz | SC-23892 | Antibody dilution = 1:200-500, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse |
| Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoReserch laboratory | 715-035-150 | Antibody dilution = 1:2000-5000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey |
| Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoReserch laboratory | 711-035-152 | Antibody dilution = 1:2000-5000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey |
References
- Dierckx, B., Heijnen, W. T., van den Broek, W. W., Birkenhager, T. K. Efficacy of electroconvulsive therapy in bipolar versus unipolar major depression: a meta-analysis. Bipolar Disord. 14 (2), 146-150 (2012).
- McClintock, S. M., et al. Multifactorial determinants of the neurocognitive effects of electroconvulsive therapy. J ECT. 30 (2), 165-176 (2014).
- Jelovac, A., Kolshus, E., McLoughlin, D. M. Relapse following successful electroconvulsive therapy for major depression: a meta-analysis. Neuropsychopharmacology. 38 (12), 2467-2474 (2013).
- Inta, D., et al. Electroconvulsive therapy induces neurogenesis in frontal rat brain areas. PLoS One. 8 (7), 69869 (2013).
- Segi-Nishida, E., Warner-Schmidt, J. L., Duman, R. S. Electroconvulsive seizure and VEGF increase the proliferation of neural stem-like cells in rat hippocampus. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (32), 11352-11357 (2008).
- Zetterstrom, T. S., Pei, Q., Grahame-Smith, D. G. Repeated electroconvulsive shock extends the duration of enhanced gene expression for BDNF in rat brain compared with a single administration. Brain Res Mol Brain Res. 57 (1), 106-110 (1998).
- Altar, C. A., et al. Electroconvulsive seizures regulate gene expression of distinct neurotrophic signaling pathways. J Neurosci. 24 (11), 2667-2677 (2004).
- Ploski, J. E., Newton, S. S., Duman, R. S. Electroconvulsive seizure-induced gene expression profile of the hippocampus dentate gyrus granule cell layer. J Neurochem. 99 (4), 1122-1132 (2006).
- Pusalkar, M., et al. Acute and Chronic Electroconvulsive Seizures (ECS) Differentially Regulate the Expression of Epigenetic Machinery in the Adult Rat Hippocampus. Int J Neuropsychopharmacol. 19 (9), (2016).
- Jang, S. S., Royston, S. E., Lee, G., Wang, S., Chung, H. J. Seizure-Induced Regulations of Amyloid-beta, STEP61, and STEP61 Substrates Involved in Hippocampal Synaptic Plasticity. Neural Plast. 2016 (2123748), 1-13 (2016).
- Limoa, E., et al. Electroconvulsive shock attenuated microgliosis and astrogliosis in the hippocampus and ameliorated schizophrenia-like behavior of Gunn rat. J Neuroinflammation. 13 (1), 230 (2016).
- Vinade, L., et al. Affinity purification of PSD-95-containing postsynaptic complexes. J Neurochem. 87 (5), 1255-1261 (2003).
- Dosemeci, A., Tao-Cheng, J. H., Vinade, L., Jaffe, H. Preparation of postsynaptic density fraction from hippocampal slices and proteomic analysis. Biochem Biophys Res Commun. 339 (2), 687-694 (2006).
- Westmark, P. R., Westmark, C. J., Jeevananthan, A., Malter, J. S. Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient. J Vis Exp. (3196), e1-e9 (2011).
- Sheng, M. Molecular organization of the postsynaptic specialization. Proc Natl Acad Sci USA. 98 (13), 7058-7061 (2001).
- Sheng, M., Hoogenraad, C. C. The postsynaptic architecture of excitatory synapses: a more quantitative view. Annu Rev Biochem. 76, 823-847 (2007).
- Ehrlich, I., Malinow, R. Postsynaptic density 95 controls AMPA receptor incorporation during long-term potentiation and experience-driven synaptic plasticity. J Neurosci. 24 (4), 916-927 (2004).
- Schnell, E., et al. Direct interactions between PSD-95 and stargazin control synaptic AMPA receptor number. Proc Natl Acad Sci USA. 99 (21), 13902-13907 (2002).
- Bermejo, M. K., Milenkovic, M., Salahpour, A., Ramsey, A. J. Preparation of synaptic plasma membrane and postsynaptic density proteins using a discontinuous sucrose gradient. J Vis Exp. (91), e51896 (2014).
- Tan, H. L., Queenan, B. N., Huganir, R. L. GRIP1 is required for homeostatic regulation of AMPAR trafficking. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (32), 10026-10031 (2015).
- Diering, G. H., Gustina, A. S., Huganir, R. L. PKA-GluA1 coupling via AKAP5 controls AMPA receptor phosphorylation and cell-surface targeting during bidirectional homeostatic plasticity. Neuron. 84 (4), 790-805 (2014).
- Luttjohann, A., Fabene, P. F., van Luijtelaar, G. A revised Racine’s scale for PTZ-induced seizures in rats. Physiol Behav. 98 (5), 579-586 (2009).
- Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. -. F., Chang, R. C. -. C. Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region. J Vis Exp. (7), e269 (2007).
- Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse. J Vis Exp. (1543), e1-e6 (2009).
- Kim, M. J., et al. Synaptic accumulation of PSD-95 and synaptic function regulated by phosphorylation of serine-295 of PSD-95. Neuron. 56 (3), 488-502 (2007).
- Won, S., Incontro, S., Nicoll, R. A., Roche, K. W. PSD-95 stabilizes NMDA receptors by inducing the degradation of STEP61. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (32), 4736-4744 (2016).
- Qu, L., Akbergenova, Y., Hu, Y., Schikorski, T. Synapse-to-synapse variation in mean synaptic vesicle size and its relationship with synaptic morphology and function. J Comp Neurol. 514 (4), 343-352 (2009).
- Delaney, A. J., Sedlak, P. L., Autuori, E., Power, J. M., Sah, P. Synaptic NMDA receptors in basolateral amygdala principal neurons are triheteromeric proteins: physiological role of GluN2B subunits. J Neurophysiol. 109 (5), 1391-1402 (2013).
- Zhang, Y., et al. The tyrosine phosphatase STEP mediates AMPA receptor endocytosis after metabotropic glutamate receptor stimulation. J Neurosci. 28 (42), 10561-10566 (2008).
- Braithwaite, S. P., et al. Regulation of NMDA receptor trafficking and function by striatal-enriched tyrosine phosphatase (STEP). Eur J Neurosci. 23 (11), 2847-2856 (2006).
- Paul, S., Nairn, A. C., Wang, P., Lombroso, P. J. NMDA-mediated activation of the tyrosine phosphatase STEP regulates the duration of ERK signaling. Nat Neurosci. 6 (1), 34-42 (2003).
- Malberg, J. E., Eisch, A. J., Nestler, E. J., Duman, R. S. Chronic antidepressant treatment increases neurogenesis in adult rat hippocampus. J Neurosci. 20 (24), 9104-9110 (2000).
- Kandratavicius, L., et al. Animal models of epilepsy: use and limitations. Neuropsychiatr Dis Treat. 10, 1693-1705 (2014).
- Loscher, W. Animal models of epilepsy for the development of antiepileptogenic and disease-modifying drugs. A comparison of the pharmacology of kindling and post-status epilepticus models of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Res. 50 (1-2), 105-123 (2002).
- Stromgren, L. S., Juul-Jensen, P. EEG in unilateral and bilateral electroconvulsive therapy. Acta Psychiatr Scand. 51 (5), 340-360 (1975).
- Abrams, R., Volavka, J., Fink, M. EEG seizure patterns during multiple unilateral and bilateral ECT. Compr Psychiatry. 14 (1), 25-28 (1973).
- Duman, R. S., Vaidya, V. A. Molecular and cellular actions of chronic electroconvulsive seizures. J ECT. 14 (3), 181-193 (1998).
- Andre, V., Ferrandon, A., Marescaux, C., Nehlig, A. Electroshocks delay seizures and subsequent epileptogenesis but do not prevent neuronal damage in the lithium-pilocarpine model of epilepsy. Epilepsy Res. 42 (1), 7-22 (2000).
- Sinclair, D., et al. Effects of sex and DTNBP1 (dysbindin) null gene mutation on the developmental GluN2B-GluN2A switch in the mouse cortex and hippocampus. J Neurodev Disord. 8 (14), 1-19 (2016).
- Sakaida, M., et al. Electroconvulsive seizure-induced changes in gene expression in the mouse hypothalamic paraventricular nucleus. J Psychopharmacol. 27 (11), 1058-1069 (2013).
- Hu, J. H., et al. Homeostatic scaling requires group I mGluR activation mediated by Homer1a. Neuron. 68 (6), 1128-1142 (2010).
- Blackstone, C. D., et al. Biochemical characterization and localization of a non-N-methyl-D-aspartate glutamate receptor in rat brain. J Neurochem. 58 (3), 1118-1126 (1992).
- Blackstone, C. D., Levey, A. I., Martin, L. J., Price, D. L., Huganir, R. L. Immunological detection of glutamate receptor subtypes in human central nervous system. Ann Neurol. 31 (6), 680-683 (1992).
- Lau, L. F., et al. Interaction of the N-methyl-D-aspartate receptor complex with a novel synapse-associated protein, SAP102. J Biol Chem. 271 (35), 21622-21628 (1996).
- Braithwaite, S. P., Paul, S., Nairn, A. C., Lombroso, P. J. Synaptic plasticity: one STEP at a time. Trends Neurosci. 29 (8), 452-458 (2006).
- Jang, S. S., et al. Regulation of STEP61 and tyrosine-phosphorylation of NMDA and AMPA receptors during homeostatic synaptic plasticity. Mol Brain. 8 (1), 55 (2015).
