عزل خلايا غشائي السلف من دم الحبل السري البشري
Summary
والهدف من هذا البروتوكول عزل السلف غشائي الخلايا من دم الحبل السري. وتشمل بعض التطبيقات باستخدام هذه الخلايا كالعلامات البيولوجية لتحديد المرضى مع مخاطر القلب والأوعية الدموية، علاج الأمراض الدماغية، وخلق صمام الأوعية الدموية والقلب هندسة الأنسجة بنيات.
Abstract
وذكرت عشارة والزملاء1أولاً وجود خلايا السلف غشائي (ابكس) في الدم المحيطي ومشاركته في فاسكولوجينيسيس. في وقت لاحق، آخرون توثيق وجود أنواع مماثلة من ابكس التي تنشأ من نخاع العظام2،3. في الآونة الأخيرة، كان يودر وانجرام أظهرت أن ابكس المستمدة من دم الحبل السري احتمال التكاثري أعلى مقارنة بتلك المعزولة من الكبار الطرفية الدم4،،من56. وبصرف النظر عن تورطه في فاسكولوجينيسيس بعد الولادة، كما أظهرت ابكس الوعد كمصدر خلية لإنشاء هندسة الأنسجة والأوعية الدموية والقلب صمام بنيات7،8. مختلف عزل البروتوكولات موجودة، التي تنطوي على الفرز خلية من الخلايا وحيدات النوى (الشركات المتعددة الجنسيات) المستمدة من المصادر المذكورة آنفا مع مساعدة علامات بطانية والمكونة للدم، أو استزراع هذه الشركات المتعددة الجنسيات مع نمو غشائي المتخصصة المتوسطة، أو مزيج من هذه الأساليب9. هنا، نقدم بروتوكولا للعزلة وثقافة ابكس استخدام المتخصصة غشائي المتوسطة وتستكمل مع عوامل النمو، دون استخدام إيمونوسورتينج، متبوعاً بتوصيف الخلايا المعزولة باستخدام النشاف الغربية و إيمونوستينينج.
Introduction
لقد درسنا العديد من المحققين بخصائص وإمكانيات بشرية ابكس5،،من1011،،من1213. يمكن وصف ابكس كتعميم الخلايا التي لها القدرة على التمسك بالانسجة غشائي في مواقع من نقص، الاسكيمية، والإصابة، أو تشكيل الورم وتسهم في تشكيل هياكل الأوعية الدموية الجديدة4،14. مشاركتها الملحوظة في نيوفاسكولاريزيشن، في شكل فاسكولوجينيسيس بعد الولادة، وقد أدى إلى فهم الفسيولوجيا المرضية لهذه الخلايا واستخدامها في تطبيقات علاجية4،15، 16. قد تبين عدد ابكس في فرد إلى الارتباط مع أمراض القلب والأوعية الدموية9،،من1516،،من1718،19 ،20. أيضا دراسات أخرى متباينة ابكس في النمط الظاهري تنتجها الخلايا الليفية مثل صمام واقترح أنه يمكن استخدام هذه الخلايا لصمامات القلب هندسة الأنسجة7،21.
لم يتم تحديد خلية معينة الجزيئات السطحية اللازمة لعزل ابكس الواضح بسبب التباين بين التحقيقات4. انضمام الشركات المتعددة الجنسيات إلى مصفوفة معينة، مع التعرض لمجموعة متنوعة من شروط الثقافة، قامت به عدة مجموعات1،17،22،23، مما يوحي بأنه قد ابكس المفترضة عرض خصائص المظهرية مختلفة. هذه الخصائص تشمل الافتقار إلى القدرة فاجوسيتوتيك وتشكيل أنبوب في ماتريجيل، وامتصاص البروتينات الدهنية لوودينسيتي أسيتيلاتيد ديل. كلونوجينيك عالية وإمكانات التكاثري هي اثنين من الخصائص مع ابكس الذي يمكن أن يكون كهنوت5. يمكن أيضا أن تشكل ابكس في المختبر الأنابيب عند كوكولتوريد مع الرئة الجنين البشري الليفية4. تعرف هذه الخلايا للتعبير عن علامات خلية غشائي السطحية وأن أشاطركم بعض علامات المكونة للدم13،،من2425. هي علامات إيجابية أعرب تكون مقبولة على نطاق واسع ابكس فينوتيبينج CD31، CD34، مستقبلات عامل نمو غشائي الأوعية الدموية 2 (VEGFR2)، فون ويليبراند عامل (فوف)، CD133، كادهيرين بطانية ج-كيت، والأوعية الدموية (VE-كادهيرين)4 , 18-الخلايا التي شاركت إكسبريس CD90، CD45، CD14، CD115، أو أكتين العضلات الملساء ألفا (α-SMA) لا تعتبر أن ابكس بسبب قدرتها المحتملة، التكاثري محدودة phagocytose البكتيريا، وعدم القدرة على تشكيل حيثياته البشرية سفن في فيفو4،7. توضح هذه المقالة بروتوكول تعديل لعزل خلايا غشائي السلف من دم الحبل السري البشري دون الحاجة إلى أية خلية الفرز البروتوكولات. لهذه المادة، كنا CD31، CD34، و VEGFR2 كعلامات إيجابية، مع α-SMA كمؤشر سلبي.
في هذا المقال، فإننا نقترح طريقة لعزل واستزراع خلايا غشائي السلف من دم الحبل السري دون الفرز باستخدام الخلية المتخصصة المتوسطة النمو بطانية وتستكمل مع عوامل النمو (اجتماع فريق الخبراء). اجتماع فريق الخبراء هذا يحتوي على عامل نمو الأوعية الدموية غشائي (VEGF) وعامل النمو تنتجها الخلايا الليفية (صندوق الأجيال القادمة)، الذي تعزز البقاء على قيد الحياة وانتشار الهجرة من الخلايا البطانية26. ويشمل أيضا حمض الأسكوربيك، ومسؤول عن الحفاظ على مورفولوجية حصاة كبيرة من الخلايا؛ يشبه الأنسولين عامل النمو-1 (منتدى إدارة الإنترنت-1)، التي تنص على الأوعية والدالة المهاجرة؛ والهيبارين، مما يسبب تحسن الاستقرار الطويل الأمد لعوامل النمو في المتوسط26. عوامل نمو أخرى إضافة إلى متوسط الثقافة غشائي خلية تتضمن مكملات مع عامل نمو البشرة (لو)، مما يساعد في تحفيز تكاثر الخلايا والتمايز الهيدروكورتيزون، الذي محسس الخلايا إلى لو26 . ونحن تبين أن استخدام هذه الوسيلة نمو محددة تعطي أرقام أعلى من ابكس مقارنة بمتوسط القاعدية غشائي (EBM) أو تعديل النسر المتوسطة (دميم دولبيكو).
Protocol
Representative Results
Discussion
كما ذكر آنفا، تمتلك ملتصقة ابكس مورفولوجيا حصاة كبيرة. تقدم لدينا الشركات المتعددة الجنسيات معزولة من مستعمرة خلية على شكل محور الدوران (الشكل 2أ-2D) في المراحل الأولى إلى مستعمرة حصاة كبيرة (الشكل 2ه-2F) على مدى فترة مدتها عشرة أيام في الثقا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذه المواد ويستند إلى العمل المدعوم من “المؤسسة الوطنية للعلوم” تحت “رقم المنحة” CMMI 1452943 وكلية يكرم جامعة اركنساس. ونود أيضا أن نعترف “بنك الدم الحبل أركنسو” لتزويدنا بوحدات دم الحبل السري.
Materials
| A) For isolation and culturing | |||
| EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | This product comes with all the growth factors needed to make the Endothelial Growth Medium |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher Scientific | 26140079 | |
| Pencillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| Ficoll-Paque | GE Heatlhcare | 17-1440-02 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Thermofisher Scientific | 14170-112 | |
| Ammonium Chloride | Stem Cell Technologies | 7850 | |
| 1X Phosphate Buffer Saline | Thermofisher Scientific | 14190250 | |
| Rat Tail I Collagen | Corning | 354236 | |
| Glacial Acetic Acid | Amresco | 0714-500ML | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| HEPES buffer | Thermofisher Scientific | 15630080 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Thermofisher Scientific | 10566-016 | |
| B) Antibodies and cell lysates | |||
| CD31 | Abcam | ab28364 | 1:250 dilution for Western blotting |
| CD34 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7045 | 1:100 dilution for Western blotting |
| α-SMA | abcam | ab5694 | 1:100 dilution for Western blotting |
| α-tubulin | abcam | ab7291 | 1:2500 dilution for Western blotting |
| VEGFR2 | abcam | sc504 | 1:100 dilution for Western blotting |
| Human umbilical vein endothelial cell lysate | Santa Cruz Biotechnology | sc24709 | |
| Valve interstitial cell lysate | Primary cell line cultured from own lab and lysed with RIPA buffer | ||
| C) Western blotting and immunostaining | |||
| 10X Tris/Glycine/SDS buffer | Biorad | 161-0772 | Used as running buffer |
| 10X Tris/Glycine buffer | Biorad | 161-0771 | Used as transfer buffer |
| Immobilon-FL transfer membrane | Merck Millipore | IPFL0010 | This is a PVDF transfer membrane that has 45 µm pore size and is mentioned in the protocol as western blot membrane |
| 4X Laemmli sample buffer | Biorad | 161-0747 | |
| 2-mercaptoethanol | Biorad | 161-0710 | |
| 10% Criterion TGX precast gel | Biorad | 5671033 | |
| Prolong Gold antifade | Thermofisher Scientific | P36930 | Used for mounting immunostained coverslips for long term storage |
| Methanol | VWR Analytical | BDH1135-4LP |
References
- Asahara, T., et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 275 (5302), 964-967 (1997).
- Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. J Clin Invest. 105 (1), 71-77 (2000).
- Shi, Q., et al. Evidence for circulating bone marrow-derived endothelial cells. Blood. 92 (2), 362-367 (1998).
- Hirschi, K. K., Ingram, D. A., Yoder, M. C. Assessing identity, phenotype, and fate of endothelial progenitor cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (9), 1584-1595 (2008).
- Ingram, D. A., et al. Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. Blood. 104 (9), 2752-2760 (2004).
- Yoder, M. C., et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109 (5), 1801-1809 (2007).
- Sales, V. L., et al. Transforming growth factor-beta1 modulates extracellular matrix production, proliferation, and apoptosis of endothelial progenitor cells in tissue-engineering scaffolds. Circulation. 114, 193-199 (2006).
- Sales, V. L., et al. Endothelial Progenitor Cells as a Sole Source for Ex Vivo Seeding of Tissue-Engineered Heart Valves. Tissue Eng Pt A. 16 (1), 257-267 (2010).
- Liew, A., Barry, F., O’Brien, T. Endothelial progenitor cells: diagnostic and therapeutic considerations. Bioessays. 28 (3), 261-270 (2006).
- Hur, J., et al. Characterization of two types of endothelial progenitor cells and their different contributions to neovasculogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24 (2), 288-293 (2004).
- Ingram, D. A., Caplice, N. M., Yoder, M. C. Unresolved questions, changing definitions, and novel paradigms for defining endothelial progenitor cells. Blood. 106 (5), 1525-1531 (2005).
- Melero-Martin, J. M., et al. In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells. Blood. 109 (11), 4761-4768 (2007).
- Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. Chapter 13. An in vivo experimental model for postnatal vasculogenesis. Methods Enzymol. 445, 303-329 (2008).
- Yoder, M. C. Human endothelial progenitor cells. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), 006692 (2012).
- Siddique, A., Shantsila, E., Lip, G. Y. H., Varma, C. Endothelial progenitor cells: what use for the cardiologist. J Angiogenes Res. 2 (6), (2010).
- Camci-Unal, G., et al. Surface-modified hyaluronic acid hydrogels to capture endothelial progenitor cells. Soft Matter. 6 (20), 5120-5126 (2010).
- Hill, J. M., et al. Circulating endothelial progenitor cells, vascular function, and cardiovascular risk. N Engl J Med. 348 (7), 593-600 (2003).
- Young, P. P., Vaughan, D. E., Hatzopoulos, A. K. Biologic properties of endothelial progenitor cells and their potential for cell therapy. Prog Cardiovasc Dis. 49 (6), 421-429 (2007).
- Mehta, J. L., Szwedo, J. Circulating endothelial progenitor cells, microparticles and vascular disease. J Hypertens. 28 (8), 1611-1613 (2010).
- Nevskaya, T., et al. Circulating endothelial progenitor cells in systemic sclerosis are related to impaired angiogenesis and vascular disease manifestations. Ann Rheum Dis. 66, 67-67 (2007).
- Cebotari, S., et al. Clinical application of tissue engineered human heart valves using autologous progenitor cells. Circulation. 114, 132-137 (2006).
- Ito, H., et al. Endothelial progenitor cells as putative targets for angiostatin. Cancer Res. 59 (23), 5875-5877 (1999).
- Vasa, M., et al. Increase in circulating endothelial progenitor cells by statin therapy in patients with stable coronary artery disease. Circulation. 103 (24), 2885-2890 (2001).
- Wu, X., et al. Tissue-engineered microvessels on three-dimensional biodegradable scaffolds using human endothelial progenitor cells. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (2), 480-487 (2004).
- Boyer, M., et al. Isolation of endothelial cells and their progenitor cells from human peripheral blood. J Vasc Surg. 31 (1), 181-189 (2000).
- Huber, B., Czaja, A. M., Kluger, P. J. Influence of epidermal growth factor (EGF) and hydrocortisone on the co-culture of mature adipocytes and endothelial cells for vascularized adipose tissue engineering. Cell Biol Int. 40 (5), 569-578 (2016).
- Sturdivant, N. M., Smith, S. G., Ali, S. F., Wolchok, J. C., Balachandran, K. Acetazolamide Mitigates Astrocyte Cellular Edema Following Mild Traumatic Brain Injury. Sci Rep. 6, 33330 (2016).
- Lam, N. T., Muldoon, T. J., Quinn, K. P., Rajaram, N., Balachandran, K. Valve interstitial cell contractile strength and metabolic state are dependent on its shape. Integr Biol (Camb). 8 (10), 1079-1089 (2016).
- Tandon, I., et al. Valve interstitial cell shape modulates cell contractility independent of cell phenotype. J Biomech. 49 (14), 3289-3297 (2016).
- Cockshell, M. P., Bonder, C. S. Isolation and Culture of Human CD133+ Non-adherent Endothelial Forming Cells. Bio-Protocol. 6 (7), (2016).
