يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

عزل خلايا غشائي السلف من دم الحبل السري البشري

11.4K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/56021

⸱

سبتمبر 14, 2017

 ,  , 

في هذه المقالة

ملخص

والهدف من هذا البروتوكول عزل السلف غشائي الخلايا من دم الحبل السري. وتشمل بعض التطبيقات باستخدام هذه الخلايا كالعلامات البيولوجية لتحديد المرضى مع مخاطر القلب والأوعية الدموية، علاج الأمراض الدماغية، وخلق صمام الأوعية الدموية والقلب هندسة الأنسجة بنيات.

الملخص

وذكرت عشارة والزملاء1أولاً وجود خلايا السلف غشائي (ابكس) في الدم المحيطي ومشاركته في فاسكولوجينيسيس. في وقت لاحق، آخرون توثيق وجود أنواع مماثلة من ابكس التي تنشأ من نخاع العظام2،3. في الآونة الأخيرة، كان يودر وانجرام أظهرت أن ابكس المستمدة من دم الحبل السري احتمال التكاثري أعلى مقارنة بتلك المعزولة من الكبار الطرفية الدم4،،من56. وبصرف النظر عن تورطه في فاسكولوجينيسيس بعد الولادة، كما أظهرت ابكس الوعد كمصدر خلية لإنشاء هندسة الأنسجة والأوعية الدموية والقلب صمام بنيات7،8. مختلف عزل البروتوكولات موجودة، التي تنطوي على الفرز خلية من الخلايا وحيدات النوى (الشركات المتعددة الجنسيات) المستمدة من المصادر المذكورة آنفا مع مساعدة علامات بطانية والمكونة للدم، أو استزراع هذه الشركات المتعددة الجنسيات مع نمو غشائي المتخصصة المتوسطة، أو مزيج من هذه الأساليب9. هنا، نقدم بروتوكولا للعزلة وثقافة ابكس استخدام المتخصصة غشائي المتوسطة وتستكمل مع عوامل النمو، دون استخدام إيمونوسورتينج، متبوعاً بتوصيف الخلايا المعزولة باستخدام النشاف الغربية و إيمونوستينينج.

المقدمة

لقد درسنا العديد من المحققين بخصائص وإمكانيات بشرية ابكس5،،من1011،،من1213. يمكن وصف ابكس كتعميم الخلايا التي لها القدرة على التمسك بالانسجة غشائي في مواقع من نقص، الاسكيمية، والإصابة، أو تشكيل الورم وتسهم في تشكيل هياكل الأوعية الدموية الجديدة4،14. مشاركتها الملحوظة في نيوفاسكولاريزيشن، في شكل فاسكولوجينيسيس بعد الولادة، وقد أدى إلى فهم الفسيولوجيا المرضية لهذه الخلايا واستخدامها في تطبيقات علاجية4،

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

هذا البحث أجرى على موافقة من جامعة "أركنسو مجلس المراجعة المؤسسية" (الموافقة رقم 16-04-722). وجمعت وحدات دم الحبل السري في سترات الفوسفات الدكستروز (وثيقة البرنامج القطري) الحل في "بنك الدم الحبل أركنسو"، والوحدات التي لا تفي بالحاجة إلى تخزين تم التبرع بها للبحث. كانت وحدات دم الحبل السري المهربة إلى المختبر خلال 24 ساعة جمع في درجات الحرارة المحيطة.

1-"عزل خلايا السلف بطانية" من "دم الحبل السري"

  1. إعداد الكواشف.
    1. و "إعداد اجتماع فريق الخبراء" عن طريق إضافة متوسطة القاعدية غشائي (EBM) إلى 10% مصل بقرى الجنين (FBS) تستكمل مع 20 نانوغرام/مليلتر من مثل الأنسولين عامل النمو (IGF)، وحمض الأسكوربيك ميكروغرام/مل....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

العزلة والتوسع في السلف غشائي الخلايا:
ويرد تخطيطي (الشكل 1) يصور البروتوكول عموما. طبقات مكونات الدم المختلفة لوحظت عقب كثافة الطرد المركزي التدرج من دم الحبل السري البشري مع المتوسطة الكثافة المتدرجة. عند البذر الشركات المتعددة الجنسيات على لوحات المعالجة بالكولاجين، لوحظ ثمرة المستعمرات أولاً بين 5 أيام و 7 (الشكل 2أ). هذه المستعمرات استمرت في النمو، وكان خلية على شكل شوكي مورفولوجيا (

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

كما ذكر آنفا، تمتلك ملتصقة ابكس مورفولوجيا حصاة كبيرة. تقدم لدينا الشركات المتعددة الجنسيات معزولة من مستعمرة خلية على شكل محور الدوران (الشكل 2أ-2D) في المراحل الأولى إلى مستعمرة حصاة كبيرة (الشكل 2ه-2F) على مدى فترة مدتها عشرة أيام في الثقافة. ابكس قد وصفت بشكل مختلف من مجموعات بحثية مختلفة، أي كالراحل السلف غشائي الخلايا10، مستعمرة غشائي تشكيل خلايا5، أو السلف غشائي الخلايا

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

هذه المواد ويستند إلى العمل المدعوم من "المؤسسة الوطنية للعلوم" تحت "رقم المنحة" CMMI 1452943 وكلية يكرم جامعة اركنساس. ونود أيضا أن نعترف "بنك الدم الحبل أركنسو" لتزويدنا بوحدات دم الحبل السري.

....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي>أ) للعزل والاستزراع < / قوي >
EGM-2 BulletKitLonzaCC-3162يأتي هذا المنتج مع جميع عوامل النمو اللازمة لصنع Endothelial Growth Medium
Fetal Bovine SerumThermofisher Scientific26140079
Pencillin-Streptomycin-Glutamine (100x)Thermofisher Scientific10378016
Ficoll-PaqueGE Heatlhcare17-1440-02
الملح المتوازن من هانكThermofisher Scientific14170-112
تقنيات الخلايا الجذعيةلكلوريد الأمونيوم7850
1x عازلة الفوسفاتملحي Thermofisher Scientific14190250
ذيل الفئران I الكولاجينCorning354236
حمض الخليك الجليديأمريسكو0714-500 مل
0.05٪ تريبسين-EDTAثيرموفيشر علمي25300054
عازلة HEPESThermofisher Scientific15630080
Dulbecco's Modified Eagle'sThermofisher ScientificScientific 10566-016
B) الأجسام المضادة ومحللات الخلايا < / قوية>
CD31 Abcamab283641:250 التخفيف   للنشاف الغربي
CD34سانتا كروز التكنولوجيا الحيويةsc-70451:100 التخفيف للنشاف الغربي
&alpha ;-SMAabcamab56941:100 التخفيف للنشاف الغربي
& -tubulinabcamab72911: 2,500 التخفيف للنشاف الغربي
VEGFR2abcamsc5041: 100 تخفيف للنشاف الغربي
الوريد السري البشري للخلايا البطانية سانتاكروز التكنولوجيا الحيويةsc24709   ؛
الخلايا الخلالية للصمامخط الخلايا الأولية المزروعة من المختبر الخاص وتحللها باستخدام RIPA buffer
C) النشاف الغربي والتلوين المناعي < / قوي >
10x Tris / Glycine / SDS عازلةBiorad161-0772تستخدم كمخزن مؤقت
للتشغيل 10x Tris / GlycineBuffer Biorad161-0771تستخدم كمخزن مؤقت للنقل
غشاء نقل Immobilon-FLMerck MilliporeIPFL0010هذا غشاء نقل PVDF يحتوي على 45 & micro ؛ حجم المسام م ومذكور في البروتوكول باسم غشاء اللطخة الغربية
4x عازلة عينة LaemmliBiorad161-0747
2-mercaptoethanolBiorad161-0710
10٪ Criterion TGX جل مسبقة الصبBiorad5671033
إطالة الذهب المضاد للتلاشيThermofisher ScientificP36930يستخدم لتركيب أغطية ملطخة بالمناعة للتخزين طويل الأجل
الميثانولVWR التحليليBDH1135-4LP
محلول محلول محللة

المراجع

  1. Asahara, T., et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 275 (5302), 964-967 (1997).
  2. Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. J ....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

عزل الخلاياالطرد المركزي بتدرج الكثافةوسط نمو الخلايا البطانيةتحليل لطخة ويسترنتوصيف الصبغ المناعيطلاء الكولاجينتحضين المزارع الخلويةتكوين المستعمرات