Isolatie van endotheliale voorlopercellen van menselijke navelstrengbloed

Summary

Het doel van dit protocol is te isoleren van endotheliale voorlopercellen van bloed van de navelstreng. Enkele van de toepassingen zijn het gebruik van deze cellen als een biomarker voor het identificeren van patiënten met cardiovasculaire risico, behandeling van ischemische ziekten, en creëren weefsel-engineered vasculaire en hart ventiel construeert.

Abstract

Het bestaan van endotheliale voorlopercellen (Spoon) in perifeer bloed en haar betrokkenheid in vasculogenese werd eerst gemeld door Ashara en collega’s¹. Later, gedocumenteerd anderen het bestaan van gelijkaardige types van Spoon afkomstig uit beenmerg^2,3. Meer recentelijk, Yoder en Ingram bleek dat Spoon afgeleid van navelstrengbloed had een hogere proliferatieve potentieel in vergelijking met degenen geïsoleerd van volwassene perifere bloed^4,5,6. Afgezien van betrokkenheid bij postnatale vasculogenese, Spoon ook is gebleken belofte als een bron van de cel voor het maken van weefsel-engineered vasculaire en hart ventiel constructies^7,8. Er zijn diverse protocollen van de isolatie, waarvan sommige betrekking hebben op de cel sorteren van mononucleaire cellen (MDL) afkomstig van de bronnen die eerder vermeld met behulp van endotheliale en hematopoietische markers of kweken van deze multinationals met gespecialiseerde endothelial groei medium, of een combinatie van deze technieken-⁹. Hier presenteren we een protocol voor de isolatie en cultuur van Spoon met behulp van gespecialiseerde endothelial medium aangevuld met factoren die de groei, zonder het gebruik van immunosorting, gevolgd door de karakterisatie van de geïsoleerde cellen gebruikend het westelijke bevlekken en immunokleuring.

Introduction

Enkele onderzoekers hebben onderzocht de kenmerken en mogelijkheden van menselijke Spoon^{5,10,11,12,13}. Spoon kunnen worden omschreven als het circulerende cellen die de mogelijkheid om te voldoen aan endothelial weefsel in sites van hypoxie, ischemie, letsel of tumor vorming en bijdragen tot de vorming van nieuwe vasculaire structuren^4,14. Hun waargenomen betrokkenheid in neovascularization, in de vorm van postnatale vasculogenese, heeft geleid tot een goed begrip van de pathofysiologie van deze cellen en hun gebruik in therapeutische toepassingen^{4,15, 16}. het aantal Spoon in een individu is aangetoond te worden gecorreleerd met cardiovasculaire pathologie^{9,15,16,17,18,19 ,20}. Andere studies hebben ook onderscheid gemaakt tussen Spoon een ventiel fibroblast-achtige fenotype en voorgesteld dat deze cellen kunnen worden gebruikt voor weefselengineering hart kleppen^7,21.

De bepaalde cel oppervlakte moleculen die nodig zijn voor het isoleren van Spoon zijn niet duidelijk geïdentificeerd als gevolg van de verschillen tussen de onderzoeken⁴. De hechting van MDL naar een bepaalde matrix, met de blootstelling aan een verscheidenheid van kweekomstandigheden, is uitgevoerd door verschillende groepen^1,17,22,23, suggereren dat vermeende Spoon kan verschillende fenotypische eigenschappen weergeven Deze eigenschappen omvatten een gebrek aan phagocytotic vermogen, buis vorming in Matrigel, en de opname van low-density lipoproteins Dil-geacetyleerd. De hoge clonogenic en proliferatieve potentieel zijn twee eigenschappen met welke Spoon hierarchized^{5 kunnen}. Spoon kunnen ook in vitro tubuli wanneer cocultured met menselijke foetale Long fibroblasten⁴vormen. Deze cellen zijn bekend uitspreken endothelial cel oppervlakte markeringen en sommige van de hematopoietische markeringen^13,24,25te delen. De positief geformuleerde markeringen die zijn geaccepteerd voor fenotypering Spoon zijn CD31, CD34, vasculaire endotheliale groeifactor receptor 2 (VEGFR2), von Willebrand Factor (vWF), CD133, c-Kit, en vasculaire endothelial cadherine (VE-cadherine)^{4 , 18}. cellen die mede express CD90, CD45, CD14, CD115 of alpha-gladde spier actine (α-SMA) worden niet beschouwd als Spoon omwille van hun beperkte proliferatieve potentiële, vermogen om de phagocytose van bacteriën, en het onvermogen om te vormen van DOVO menselijke schepen in vivo^4,7. Dit artikel schetst een gewijzigd protocol voor de isolatie van endotheliale voorlopercellen van menselijke navelstrengbloed zonder de behoefte aan een willekeurige cel sorteren van protocollen. Voor dit artikel, hebben we een aantal CD31, CD34 en VEGFR2 als de positieve markers, met α-SMA als negatieve indicator gebruikt.

In dit artikel, stellen wij voor een methode van isoleren en kweken van endotheliale voorlopercellen van navelstrengbloed zonder cel sorteren via gespecialiseerd endothelial groeimedium aangevuld met groeifactoren (BAVA). Deze BAVA bevat vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) en fibroblast groeifactor (FGF), die de overleving, proliferatie, en migratie van endotheliale cellen²⁶te vergroten. Het omvat ook ascorbinezuur, die verantwoordelijk is voor het behoud van de geplaveide morfologie van cellen; insuline-achtige groeifactor-1 (IGF-1), waarin angiogenic en trekkende functie; en heparine, waardoor verbeterde stabiliteit op lange termijn van de factoren die de groei in de middelgrote²⁶. Andere factoren die de groei toegevoegd aan het kweekmedium endothelial cel bevat suppletie met epidermale groeifactor (EGF), die helpt bij het stimulerende celproliferatie en differentiatie en hydrocortison, die de cellen met EFG^{26 sensibiliseert} . We laten zien dat het gebruik van deze specifieke groeisnelheid medium hogere aantallen Spoon t.o.v. endothelial Basaal medium (EBM) of Dulbecco van bewerkt Eagle Medium (DMEM levert).

Protocol

dit onderzoek werd uitgevoerd met de goedkeuring van de Universiteit van Arkansas institutionele Review Board (erkenningsnummer 16-04-722). Navelstreng bloed eenheden werden verzameld in citraatoplossing fosfaat dextrose (CPD) op de Arkansas navelstrengbloed Bank en eenheden die niet voldeed aan de eis voor opslag werden geschonken voor onderzoek. Koord bloed eenheden werden methoden.NETeller naar het lab binnen de 24u van collectie bij omgevingstemperaturen. 1. isolatie van endotheliale voorl…

Representative Results

Isolatie en uitbreiding van endotheliale voorlopercellen:Een schema (Figuur 1) wordt geleverd aan de beeltenis van het algemeen protocol. De verschillende bloed component lagen werden waargenomen na verloop centrifugeren van de dichtheid van menselijke navelstrengbloed met kleurovergang medium dichtheid. Bij zaaien MDL op de platen van collageen-behandeld, werd de uitgroei van de koloniën eerst waargenomen tussen dagen 5 en 7(<st…

Discussion

Zoals eerder vermeld, aanhanger Spoon bezitten een geplaveide morfologie. Onze geïsoleerde MDL gevorderd van een spindel-vormig cel kolonie (Figuur 2A-2D) in een vroeg stadium naar een geplaveide kolonie (Figuur 2E-2F) over een periode van tien dagen in cultuur. Spoon hebben het label verschillend door verschillende onderzoeksgroepen, namelijk als laat endothelial progenitor cellen¹⁰, endotheel kolonievo…

Materials

A) For isolation and culturing
EGM-2 BulletKit	Lonza	CC-3162	This product comes with all the growth factors needed to make the Endothelial Growth Medium
Fetal Bovine Serum	Thermofisher Scientific	26140079
Pencillin-Streptomycin-Glutamine (100X)	Thermofisher Scientific	10378016
Ficoll-Paque	GE Heatlhcare	17-1440-02
Hank's Balanced Salt Solution	Thermofisher Scientific	14170-112
Ammonium Chloride	Stem Cell Technologies	7850
1X Phosphate Buffer Saline	Thermofisher Scientific	14190250
Rat Tail I Collagen	Corning	354236
Glacial Acetic Acid	Amresco	0714-500ML
0.05% Trypsin-EDTA	Thermofisher Scientific	25300054
HEPES buffer	Thermofisher Scientific	15630080
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Thermofisher Scientific	10566-016
B) Antibodies and cell lysates
CD31	Abcam	ab28364	1:250 dilution  for Western blotting
CD34	Santa Cruz Biotechnology	sc-7045	1:100 dilution for Western blotting
α-SMA	abcam	ab5694	1:100 dilution for Western blotting
α-tubulin	abcam	ab7291	1:2500 dilution for Western blotting
VEGFR2	abcam	sc504	1:100 dilution for Western blotting
Human umbilical vein endothelial cell lysate	Santa Cruz Biotechnology	sc24709
Valve interstitial cell lysate			Primary cell line cultured from own lab and lysed with RIPA buffer
C) Western blotting and immunostaining
10X Tris/Glycine/SDS buffer	Biorad	161-0772	Used as running buffer
10X Tris/Glycine buffer	Biorad	161-0771	Used as transfer buffer
Immobilon-FL transfer membrane	Merck Millipore	IPFL0010	This is a PVDF transfer membrane that has 45 µm pore size and is mentioned in the protocol as western blot membrane
4X Laemmli sample buffer	Biorad	161-0747
2-mercaptoethanol	Biorad	161-0710
10% Criterion TGX precast gel	Biorad	5671033
Prolong Gold antifade	Thermofisher Scientific	P36930	Used for mounting immunostained coverslips for long term storage
Methanol	VWR Analytical	BDH1135-4LP