CRISPR/Cas9-based 跳跃的原始生殖细胞移植在爪
Summary
生存所必需的基因构成了创造突变株系的技术障碍。通过将基因组编辑与原始生殖细胞移植结合在一起, 创造出具有系突变的野生型动物, 从而绕过致命性。跳跃也允许在 F1生成中高效生成纯合 null 突变体。在这里, 移植步骤被证明。
Abstract
基因组编辑的突变株系的建立加速了许多生物体的遗传分析。CRISPR/Cas9 方法已被改编为使用在非洲爪蛙,爪, 一个长期的生物医学研究模型生物。传统的 CRISPR/Cas9-targeted 诱变品系的选育方案具有耗时费力的几个步骤。为了促进突变胚胎的产生, 特别是为了克服与敲出胚胎发育所必需的基因相关的障碍, 一种称为跳跃的新方法被开发出来。此技术利用爪胚胎的健壮性来 “剪切和粘贴” 胚胎方法。跳跃利用原始生殖细胞 (生殖细胞) 从有效的 mutagenized 供体胚胎转移到 PGC 消融的野生兄弟姐妹。这种方法可以通过创建具有突变系的野生体细胞的嵌合体动物来有效地突变基本基因。当携带 “跳跃式移植” (即突变生殖细胞) 的两个 F0动物被交叉时, 它们产生纯合物, 或复合杂, 空 F1胚胎, 从而节省了整整一代的时间来获取表型数据。跳跃也提供了一种新的方法来分析孕产妇效应基因, 这是耐火到 F0表型分析后 CRISPR/Cas9 突变。本手稿详细介绍了跳跃的方法, 特别强调如何成功地执行 PGC 移植。
Introduction
自孟德尔定律重新出现以来, 基因型编码表型在生物学中一直是一个重要的问题。理解基因的作用, 它们的调节和基因网络内的相互作用, 以及编码产品的功能, 有望为揭开新的生物学和改善疾病状态提供工具。在半个多世纪的1中, 非洲爪蛙,爪, 一直是研究基础生物学和生物医学领域的一个主要模型, 包括发展的遗传控制。历史上, 大多数关于爪的研究都使用了体蛙, x 蟾, 但最近由于它的二, x 酵母已经被开发为两栖动物遗传模型。完整的基因组序列已经从爪种2、3中进行了组装。”青蛙群落” 现在正处于一个转折点, 基本基因组修饰技术允许对基因功能的研究, 实际上是可以的。可编程 CRISPR/Cas9 酶已使基因的诱变高效, 与 biallelic 变异可能在大多数细胞的动物4,5,6,7, 8、9、10、11。b.b et al.强调了这些研究12和太et al.13表明, 在 F0马赛克动物中, 可以通过诱变研究许多基因的功能。这种方法有许多优点;然而, 由于功能不完全丧失 (LOF), Cas9-sgRNA-microinjected 胚胎往往显示可变的表型。更重要的是, 突变株的产生对某些应用非常有利, 特别是在研究具有母体 mRNA 贡献的基因时。母体的基因和蛋白质及其对胚胎遗传学的影响, 持续了一段长时间的发育过程14,15,16, 呈现了许多基因的早期发育贡献耐火到 F0分析。因此, 需要其他 LOF 方法。
当寻求创造突变株时, 获得合 LOF 胚胎的途径有几个障碍。首先, 有效的诱变产生 biallelic 突变可能是不利的, 因为基本基因功能的丧失导致无法生存到性成熟, 干扰生产的一个可行的线。一个常见的解决办法是仔细滴定 Cas9-sgRNA 的数量。在这里, 目标是达到减少杀伤力之间的平衡, 同时也最大化系的诱变效率。第二个问题来自标准育种方案, 其中表型分析被推迟到 F2代。使用标准方法, 性成熟的 f0动物通过系传播突变等位基因, outcrossed 产生 f1杂 “载体”, 然后长成性成熟。然后, 两个 f1子交叉生成 f2突变胚胎, 其预期孟德尔频率为25%。因此, 两代育种是必要的分析突变表型。突变动物可以是纯或复合子 (即,包含两个不同的变种等位基因的后代, 这取决于在 F1交叉中使用的亲代动物的基因型)。
这些障碍可以通过限制可编程核酸介导的诱变到生殖细胞来克服, 这是一个新的方法称为跳跃17。跳跃有两个主要组成部分: (1) 将 Cas mRNA 与 sgRNA, 或核酸-sgRNA 配合物 (或在原则上, TALENs 或锌指核酸) 在单细胞阶段注射, 以有效诱变胚胎基因组, 其次是 (2)生殖细胞移植到野生的同胞胚胎, 其中内源性生殖细胞被移除。当两个步骤是有效的, 完全系替换与突变生殖细胞可以得到。Blackler 在二十世纪六十年代代初表明,爪生殖细胞可以移植到晚期 neurula 和早期 tailbud 阶段的胚胎之间,1819。对于跳跃, Blackler 的方法被修改了执行移植在囊胚阶段17, 当生殖细胞被本地化在胚胎的植物极的20,21。肠前移植有两个主要优点。首先, 当移植在囊胚阶段 (未发表的观察) 时, 被发现的移植的植入和随后正常发展是更加高效率的。第二, 通过在合转录开始后不久进行囊胚阶段的移植, 可以避免因发育基因突变而导致的致命性破坏肠, 否则会造成畸形的晚期 neurulae。PGC 移植-轴承 (“超越”) 胚胎生长到性成熟, 和 intercrosses 之间的这些 f0动物已经证明, 在许多情况下, 100% 的 f1后裔显示 LOF 表型 (大多数是化合物子), 表明完全系替换与目标突变。
预计跳跃将加速在爪中的遗传方法。跳跃还提供了一种替代的 “主机传输” 方法22用于 LOF 分析母体效应基因 (未发表的观察).在当前出版物中, 对该方法的详细描述 (特别是针对 PGC 移植) 在x 酵母中介绍 (对x 蟾进行了较小的修改)。生殖细胞的移植在这里演示, 以促进这项技术更快地转移到其他实验室使用爪。这种方法的原则应该是成功的其他两栖动物 (例如, urodeles), 并且有机体特定的修改在方法学应该允许对许多其他动物的应用对高效率的诱变可以完成和生殖细胞很容易移植。
Protocol
Representative Results
Discussion
本报告提供了一个详细的协议, 移植的植物组织含有生殖细胞. 生殖细胞的移植与基因组编辑技术 (例如, CRISPR/Cas9) 一起使用, 以修改动物的系保持其几乎所有的体细胞组织为遗传野生类型。为了取得成功, 在执行移植手术之前有许多关键因素需要考虑。
为了确保完全取代系与突变等位基因, 建议第一个确定的体内效率的 sgRNAs。经验表明, 大多数 sgRNAs 设计的 CRISPRDi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是在国家儿童健康和人类发展研究所的一笔赠款5R21HD080684-02 的支持下进行的。作者希望感谢肯町持续的热情和支持。作者还要感谢布鲁斯布伦伯格使用他的相机, 利百利恰, 为关键的阅读手稿, 和肖恩麦克纳马拉和马辛 Wlizla 在国家爪资源 (RRID:SCR_013731), 为宝贵关于十酵母喂养和动物护理方案的对话。
Materials
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 or 11252-30 | |
| Eyebrow hair knife | Homemade | ||
| Hair loop | Homemade | ||
| Pasteur pipettes, borosilicate glass | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Krazy Glue (Cyanoacrylate-based) | Elmer's Products, Inc. | KG581 | To affix eyebrow hair and hair loops into Pasteur pipettes, other similar glues can be used. |
| Oligodeoxynucleotides, custom ordered | Integrated DNA Technologies | Custom ordered | Template oligos for sgRNA synthesis, see Nakayama et al., 2014 for design details. |
| Megascript T7 kit | Ambion/ThermoFisher | AM1334 | Or use Megashortscript T7 (AM1354) kit |
| Phenol, Tris buffered | High quality distilled phenol from any commercial supplier | ||
| Chloroform | High quality chloroform from any commercial supplier | ||
| Ethanol | High quality ethanol from any commercial supplier | ||
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma Chemical Co. | D5758-50ML | |
| Cas9 protein, with nuclear localization signal | PNA Bio, Inc. | CP01 | Reconstituted using DEPC-treated water according to manufacturer's recommendations |
| 10X Marc's Modified Ringers solution | Homemade. Recipe (ref 26) for 1X MMR (lacking EDTA) is 100mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES. Solution is pH adjusted to 7.4. | ||
| Agarose | Any Molecular Biology grade agarose is sufficient | ||
| 60 X15 mm Petri plates | Falcon | 351007 | |
| 24-well plates | Falcon | 3047 | |
| L-Cysteine | Sigma Chemical Co. | C7352-100G | Free base, not HCl salt |
| Proteinase K | Roche | 03 115 828 001 | Typically ~20mg/ml from Roche |
| sera Micron | sera | Tadpole food. Resuspend in growth medium. Can be purchased from a variety of online retailers |
References
- Gurdon, J. B., Hopwood, N. The introduction of Xenopus laevis into developmental biology: of empire, pregnancy testing and ribosomal genes. Int J Dev Biol. 44 (1), 43-50 (2000).
- Hellsten, U., et al. The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis. Science. 328 (5978), 633-636 (2010).
- Session, A. M., et al. Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis. Nature. 538 (7625), 336-343 (2016).
- Blitz, I. L., Biesinger, J., Xie, X., Cho, K. W. Biallelic genome modification in F(0) Xenopus tropicalis embryos using the CRISPR/Cas system. Genesis. 51 (12), 827-834 (2013).
- Nakayama, T., Fish, M. B., Fisher, M., Oomen-Hajagos, J., Thomsen, G. H., Grainger, R. M. Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis. Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).
- Guo, X., et al. Efficient RNA/Cas9-mediated genome editing in Xenopus tropicalis. Development. 141 (3), 707-714 (2014).
- Wang, F., Shi, Z., Cui, Y., Guo, X., Shi, Y. B., Chen, Y. Targeted gene disruption in Xenopus laevis using CRISPR/Cas9. Cell Biosci. 5, 15 (2015).
- Jaffe, K. M., et al. c21orf59/kurly Controls Both Cilia Motility and Polarization. Cell Rep. 14 (8), 1841-1849 (2016).
- Liu, Z., et al. Efficient genome editing of genes involved in neural crest development using the CRISPR/Cas9 system in Xenopus embryos. Cell Biosci. 6, 22 (2016).
- Naert, T., et al. CRISPR/Cas9 mediated knockout of rb1 and rbl1 leads to rapid and penetrant retinoblastoma development in Xenopus tropicalis. Sci Rep. 6 (35264), (2016).
- Ratzan, W., Falco, R., Salanga, C., Salanga, M., Horb, M. E. Generation of a Xenopus laevis F1 albino J strain by genome editing and oocyte host-transfer. Dev Biol. 426 (2), (2016).
- Bhattacharya, D., Marfo, C. A., Li, D., Lane, M., Khokha, M. K. CRISPR/Cas9: An inexpensive, efficient loss of function tool to screen human disease genes in Xenopus. Dev Biol. 408 (2), 196-204 (2015).
- Shigeta, M., et al. Rapid and efficient analysis of gene function using CRISPR-Cas9 in Xenopus tropicalis founders. Genes Cells. 21 (7), 755-771 (2016).
- Hontelez, S., et al. Embryonic transcription is controlled by maternally defined chromatin state. Nat Commun. 6, 10148 (2015).
- Peshkin, L., et al. On the Relationship of Protein and mRNA Dynamics in Vertebrate Embryonic Development. Dev Cell. 35 (3), 383-394 (2015).
- Owens, N. D., et al. Measuring Absolute RNA Copy Numbers at High Temporal Resolution Reveals Transcriptome Kinetics in Development. Cell Rep. 14 (3), 632-647 (2016).
- Blitz, I. L., Fish, M. B., Cho, K. W. Leapfrogging: primordial germ cell transplantation permits recovery of CRISPR/Cas9-induced mutations in essential genes. Development. 143 (15), 2868-2875 (2016).
- Blackler, A. W. Transfer of germ-cells in Xenopus laevis. Nature. 185, 859-860 (1960).
- Blackler, A. W., Fischberg, M. Transfer of primordial germ-cells in Xenopus laevis. J Embryol. Exp Morph. 9, 634-641 (1961).
- Bounoure, L. . L’origine des cellules reproductrices et le problem de la lignee germinale. , (1939).
- Nieuwkoop, P. D., Sutasurya, L. A. . Primordial Germ Cells in the Chordates: Embryogenesis and phylogenesis. , (1979).
- Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. C. Fertilization of cultured Xenopus oocytes and use in studies of maternally inherited molecules. Methods Cell Biol. 36, 213-230 (1991).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Embryo dissection and micromanipulation tools. CSH Protoc. , (2007).
- Nakayama, T., et al. Cas9-based genome editing in Xenopus tropicalis. Methods Enzymol. 546, 355-375 (2014).
- Ogino, H., McConnell, W. B., Grainger, R. M. High-throughput transgenesis in Xenopus using I-SceI meganuclease. Nat Protoc. 1 (4), 1703-1710 (2006).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early development of Xenopus laevis.: a laboratory manual. , (2000).
- Kay, B. K., Kay, B. K., Peng, H. B. Injection of oocytes and embryos. Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology (Methods in Cell Biology Vol. 36). , (1991).
- Nieuwkoop, P., Faber, J. . Normal Table of Xenopus laevis. (Daudin): A Systematical and Chronological Survey of the Development from the Fertilized Egg till the End of Metomorphosis. , (1994).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Res. 42 (22), e168 (2014).
- Sander, V., Reversade, B., De Robertis, E. M. The opposing homeobox genes Goosecoid and Vent1/2 self-regulate Xenopus patterning. EMBO J. 26 (12), 2955-2965 (2007).
- Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
- Kim, J. M., Kim, D., Kim, S., Kim, J. S. Genotyping with CRISPR-Cas-derived RNA-guided endonucleases. Nat Commun. 5, 3157 (2014).
- Kim, H. J., Lee, H. J., Kim, H., Cho, S. W., Kim, J. S. Targeted genome editing in human cells with zinc finger nucleases constructed via modular assembly. Genome Res. 19 (7), 1279-1288 (2009).
- Qiu, P., Shandilya, H., D’Alessio, J. M., O’Connor, K., Durocher, J., Gerard, G. F. Mutation detection using Surveyor nuclease. Biotechniques. 36 (4), 702-707 (2004).
- Ota, S., et al. Efficient identification of TALEN-mediated genome modifications using heteroduplex mobility assays. Genes Cells. 18 (6), 450-458 (2013).
- Dahlem, T. J., et al. Simple Methods for Generating and Detecting Locus- Specific Mutations Induced with TALENs in the Zebrafish Genome. PLoS Genet. 8 (8), e1002861 (2012).
- Ramlee, M. K., Yan, T., Cheung, A. M., Chuah, C. T., Li, S. High-throughput genotyping of CRISPR/Cas9-mediated mutants using fluorescent PCR-capillary gel electrophoresis. Sci Rep. 5, 15587 (2015).
- Bhattacharya, D., Marfo, C. A., Li, D., Lane, M., Khokha, M. K. CRISPR/Cas9: An inexpensive, efficient loss of function tool to screen human disease genes in Xenopus. Dev Biol. 408 (2), 196-204 (2015).
- Yu, C., Zhang, Y., Yao, S., Wei, Y. A PCR Based Protocol for Detecting Indel Mutations Induced by TALENs and CRISPR/Cas9 in Zebrafish. PLoS ONE. 9 (6), e98282 (2014).
- Mock, U., Hauber, I., Fehse, B. Digital PCR to assess gene-editing frequencies (GEF-dPCR) mediated by designer nucleases. Nat Protoc. 11 (3), 598-615 (2016).
- Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).
- Shi, J., Wang, E., Milazzo, J. P., Wang, Z., Kinney, J. B., Vakoc, C. R. Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains. Nat Biotechnol. 33 (6), 661-667 (2015).
- Koebernick, K., Loeber, J., Arthur, P. K., Tarbashevich, K., Pieler, T. Elr-type proteins protect Xenopus Dead end mRNA from miR-18-mediated clearance in the soma. Proc Natl Acad Sci USA. 107, 16148-16153 (2010).
- Yang, J., Aguero, T., King, M. L. The Xenopus maternal-to-zygotic transition from the perspective of the germline. Curr Top Dev Biol. 113, 271-303 (2015).
