Transplante de células de germes primordial para baseado em CRISPR/Cas9 saltos em Xenopus
Summary
Genes essenciais para a sobrevivência colocam obstáculos técnicos para a criação de linhas de mutantes. Saltos contorna a letalidade combinando genoma edição com transplante de células de germes primordial para criar animais selvagem-tipo carregando mutações do germline. Saltos também permite a geração eficiente de homozigotos mutantes nulos na geração1 F. Aqui, o passo de transplante é demonstrado.
Abstract
A criação de linhas de mutante editando genoma está acelerando a análise genética em muitos organismos. CRISPR/Cas9 métodos foram adaptados para o uso na africana Xenopus, Xenopus, um organismo de longa data modelo para investigação biomédica. Os regimes tradicionais de reprodução para criar linhas mutantes homozigotos com mutagénese CRISPR/Cas9-alvo têm várias etapas demoradas e trabalhosas. Para facilitar a criação de embriões mutantes, particularmente para superar os obstáculos associados a bater para fora os genes que são essenciais para a embriogênese, foi desenvolvido um novo método chamado saltos. Esta técnica utiliza a robustez dos embriões de Xenopus “cortar e colar” métodos embriológicos. Saltos utiliza a transferência de células germinativas primordiais (PGCs) de embriões de doador de forma eficiente-mutagenized em sua PGC-ablated irmãos. Este método permite a eficiente mutação de genes essenciais criando animais quiméricoes com sua células somáticas que carregam uma mutante da linha germinal. Quando dois animais de0 F carregando “saltar transplantes” (isto é, células germinativas mutante) são intercrossed, eles produzem homozigotos, ou compostos heterozigotos, nulos F1 embriões, economizando assim um tempo de geração completo para obter dados fenotípicos. Saltos também fornece uma nova abordagem para a análise de genes de efeito materno, que são refratários à análise fenotípica de0 F seguindo CRISPR/Cas9 mutagênese. Este manuscrito detalha o método dos saltos, com especial ênfase em como executar com sucesso o transplante de PGC.
Introduction
Como genótipo codifica o fenótipo tem sido uma grande questão em biologia desde a redescoberta de leis de Mendel. Uma compreensão das funções dos genes, sua regulação e interações nas redes do gene e as funções das promessas de produtos codificado para fornecer ferramentas para descobrir nova biologia e melhorar Estados de doença. Para mais de meio século1, a africana Xenopus, Xenopus, tem sido um líder modelo para estudos sobre uma grande variedade de tópicos em biologia básica e biomedicina, incluindo o controle genético do desenvolvimento. Historicamente, a maioria das pesquisas sobre Xenopus tem usado o sapo allotetraploid, X. laevis, mas mais recentemente, devido à sua Diploidia, X. tropicalis desenvolveu-se como um modelo genético de anfíbios. Foram montadas sequências do genoma completo de ambas as espécies de Xenopus 2,3. A comunidade de”sapo” é agora um ponto de viragem onde tecnologia de modificação do genoma básicos permite o estudo da função do gene, praticamente à vontade. Programável CRISPR/Cas9 endonucleases fizeram o mutagenesis de genes altamente eficiente, com biallelic mutação possível na maioria das células do animal4,5,6,7, 8,9,10,11. Estes estudos, sublinhados por Bhattacharya et al 12 e Shigeta et al 13, têm mostrado que a função de muitos genes pode ser estudada por mutagênese em animais de mosaico F0 . Esta abordagem tem muitas vantagens; no entanto, Cas9-sgRNA-injetadas embriões frequentemente exibem fenótipos variáveis devido a perda incompleta da função (LOF). Mais significativamente, a geração de linhas mutantes é altamente vantajosa para alguns aplicativos — em especial, ao estudar os genes que têm uma contribuição materna do mRNA. MRNAs maternos e proteínas e suas influências na epigenética, persistirem por um período prolongado na embriogênese14,15,16, tornando as contribuições do desenvolvimento precoce de muitos genes refratários para análises de F0 . Portanto, outras abordagens LOF são necessárias.
Quando pretendem criar linhas mutantes, o caminho para obtenção de embriões LOF homozigotos tem vários obstáculos. Mutagênese em primeiro lugar, eficiente para produzir mutações biallelic pode ser desvantajoso porque a perda das funções essenciais do gene resulta em falha para sobreviver à maturidade sexual, interferindo com a produção de uma linha viável. Uma solução comum é a titulação cuidadosa da quantidade de Cas9-sgRNA entregado. Aqui, o objetivo é alcançar um equilíbrio entre reduzir letalidade enquanto também maximiza a eficiência de mutagénese germline. Um segundo problema surge a partir do esquema de reprodução padrão, onde análises fenotípicas são diferidas até à geração2 de F. Usando a abordagem padrão, sexualmente maduras animais de0 F que transmitem mutante alelos através do germline são outcrossed para produzir F1 heterozigoto “transportadoras”, que em seguida são cultivadas para a maturidade sexual. Dois heterozigotos de1 F são então intercrossed para produzir embriões mutantes de F2 com uma frequência mendeliana esperada de 25%. Assim, duas gerações de reprodução são necessárias para a análise de fenótipos mutantes. Animais mutantes poderiam ser homozigotos ou heterozigotos compostos (ou seja, a descendência que contém dois alelos mutantes diferentes, que depende dos genótipos dos animais parentais utilizados em intercross de1 a F).
Estes obstáculos podem ser superados por confinar programável mediada por nuclease mutagênese de células germinativas, que está subjacente a um novo método chamado saltando17. Saltos tem dois componentes principais: (1) a microinjeção de mRNA Cas juntamente com sgRNA, ou sgRNA-nuclease complexos (ou, em princípio, TALENs ou zinco nucleases de dedo) na fase de célula única para eficientemente mutagenize embrionárias genomas, seguido por (2) o transplante de PGCs em embriões de sua irmã, onde os PGCs endógenos foram removidos. Quando os dois passos são germline eficiente, completa substituição com mutantes de células germinativas pode ser obtido. Blackler demonstrado na década de 1960 que Xenopus PGCs poderiam ser transplantadas entre embriões no neurula atrasado e cedo tailbud fases18,19. Para saltos, abordagem do Blackler foi modificada por realizar os transplantes para o estágio de blástula17, quando PGCs são localizadas no polo vegetal do embrião20,21. Transplante antes gastrulação tem duas vantagens principais. Primeiro, a enxertia de transplantes e o subsequente desenvolvimento normal foi encontrada para ser mais eficiente quando o transplante é realizado na fase de blástula (observações não publicadas). Em segundo lugar, realizando transplantes de blástula-palco logo após a transcrição zigóticos começou, um pode evitar a letalidade decorrentes do desenvolvimento gene mutações que interrompem a gastrulação ou que caso contrário levar ao neurulae tarde malformado. PGC transplante-rolamento (“leapfrogged”) embriões são cultivados a maturidade sexual, e inter-cruzamentos entre estes animais de0 F têm demonstrado que, em muitos casos, 100% da descendência F1 exibir o fenótipo LOF (a maioria sendo composto heterozigotos), indicando a substituição completa do germline com as mutações específicas.
Espera-se que saltos acelerará abordagens genéticas em Xenopus. Saltos também fornece uma alternativa para o método de “transferência de acolhimento”22 para a análise LOF dos genes maternos-efeito (observações não publicadas). Na atual publicação, uma descrição detalhada do método, concentrando-se especialmente na transplantação de PGC, é apresentada em X. tropicalis (com pequenas modificações para X. laevis). O transplante de PGCs é demonstrado aqui para facilitar uma mais rápida transferência desta tecnologia para outros laboratórios que trabalham com Xenopus. Os princípios deste método devem ser bem sucedidos em outros anfíbios (por exemplo, urodeles), e modificações do organismo específico na metodologia permitir aplicação para muitos outros animais na qual mutagênese eficiente pode ser realizado e PGCs são prontamente para transplante.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este relatório fornece um protocolo detalhado para o transplante de tecido vegetal contendo PGCs. transplante de PGCs é usado em conjunto com tecnologias de edição de genoma (por exemplo, CRISPR/Cas9) para modificar o germline de um animal enquanto mantendo a quase todos os tecidos somáticos como geneticamente tipo selvagem. Para saltos para ser bem sucedido, há um número de fatores críticos a considerar antes de realizar a execução de transplantes.
Para garantir a completa …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi realizado com o apoio de uma subvenção, 5R21HD080684-02, do Instituto Nacional de saúde infantil e desenvolvimento humano. O autor deseja agradecer a Ken Cho para seu contínuo entusiasmo e apoio. O autor também gostaria de reconhecer Bruce Blumberg para uso da sua câmera, Rebekah Charney, para a leitura crítica do manuscrito e Sean McNamara e Marcin Wlizla o recurso de Xenopus nacional (RRID:SCR_013731), para o valioso conversas sobre X. tropicalis alimentar e regimes de cuidados com animais.
Materials
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 or 11252-30 | |
| Eyebrow hair knife | Homemade | ||
| Hair loop | Homemade | ||
| Pasteur pipettes, borosilicate glass | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Krazy Glue (Cyanoacrylate-based) | Elmer's Products, Inc. | KG581 | To affix eyebrow hair and hair loops into Pasteur pipettes, other similar glues can be used. |
| Oligodeoxynucleotides, custom ordered | Integrated DNA Technologies | Custom ordered | Template oligos for sgRNA synthesis, see Nakayama et al., 2014 for design details. |
| Megascript T7 kit | Ambion/ThermoFisher | AM1334 | Or use Megashortscript T7 (AM1354) kit |
| Phenol, Tris buffered | High quality distilled phenol from any commercial supplier | ||
| Chloroform | High quality chloroform from any commercial supplier | ||
| Ethanol | High quality ethanol from any commercial supplier | ||
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma Chemical Co. | D5758-50ML | |
| Cas9 protein, with nuclear localization signal | PNA Bio, Inc. | CP01 | Reconstituted using DEPC-treated water according to manufacturer's recommendations |
| 10X Marc's Modified Ringers solution | Homemade. Recipe (ref 26) for 1X MMR (lacking EDTA) is 100mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES. Solution is pH adjusted to 7.4. | ||
| Agarose | Any Molecular Biology grade agarose is sufficient | ||
| 60 X15 mm Petri plates | Falcon | 351007 | |
| 24-well plates | Falcon | 3047 | |
| L-Cysteine | Sigma Chemical Co. | C7352-100G | Free base, not HCl salt |
| Proteinase K | Roche | 03 115 828 001 | Typically ~20mg/ml from Roche |
| sera Micron | sera | Tadpole food. Resuspend in growth medium. Can be purchased from a variety of online retailers |
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