Первичных зародышевых клеток Трансплантация для ТРИФОСФАТЫ/Cas9-основе скачка в Xenopus
Summary
Генов, необходимых для выживания создают технические препятствия для создания мутантных линий. Скачка обходит летальность, объединяя генома, редактирование с помощью первичных зародышевых клеток трансплантации для создания одичал тип животных, перевозящих герминальных мутаций. Прорыва также позволяет эффективно поколения гомозиготных null мутантов в поколении1 F. Здесь трансплантация шаг продемонстрировал.
Abstract
Создание мутантных линий путем изменения генома ускорения генетического анализа у многих организмов. ТРИФОСФАТЫ/Cas9 методы были адаптированы для использования в африканских когтистые лягушка Xenopus, давно модельный организм для биомедицинских исследований. Традиционными для выведения схемы для создания гомозиготных мутантных линий с ТРИФОСФАТЫ/Cas9-пристрелнных мутагенеза имеют несколько шагов длительным и трудоемким. Чтобы облегчить создание эмбрионов мутантов, особенно в том, чтобы преодолеть препятствия, связанные с выбивания генов, которые необходимы для эмбриогенеза, был разработан новый метод под названием скачка. Этот метод использует надежность зародыши Xenopus «вырезать и вставить» эмбрионального методы. Скачка использует передачи первичных зародышевых клеток (PGCs) от эффективно mutagenized донорских эмбрионов в удаленной PGC wildtype братьев и сестер. Этот метод позволяет эффективно мутации важно генов путем создания химерных животных с wildtype соматические клетки, которые несут мутант микрофлорой. Когда два животных0 F ношение «чехарда трансплантации» (то есть, мутантные клетки семенозачатка) являются intercrossed, они производят гомозиготных, или составные гетерозиготных, null F1 эмбрионов, тем самым экономя время полной поколения для получения фенотипические данных. Прорыва также предоставляет новый подход для анализа гены материнского эффекта, которые являются тугоплавкие F фенотипического анализа0 после ТРИФОСФАТЫ/Cas9 мутагенеза. Эта рукопись подробно метод прорыва, с уделением особого внимания как успешно выполнять PGC трансплантации.
Introduction
Как генотип кодирует фенотип был основной вопрос в биологии с момента повторного законов Менделя. Понимание роли генов, их регулирования и взаимодействия в рамках генных сетей и функции закодированные продуктов обещания предоставить инструменты для выявления новой биологии и совершенствуясь болезни государства. Для более чем половины столетия1африканских когтистые лягушка Xenopus, был ведущим модель для исследования на самые разнообразные темы в базовой биологии и биомедицины, включая генетического контроля развития. Исторически большинство исследований по Xenopus использовала интрогрессии лягушка, X. laevis, но совсем недавно, благодаря своей diploidy, X. tropicalis был разработан как амфибии генетической модели. Полный геном последовательности были собраны от обоих видов Xenopus 2,3. «Лягушка сообщества» является теперь в поворотный момент где основные генома модификации технологии позволяет исследование функции гена, практически на волю. Программируемый ТРИФОСФАТЫ/Cas9 эндонуклеазами сделали мутагенез генов высокоэффективных, с biallelic мутации возможно в большинстве клеток животных4,5,6,7, 8,9,10,11. Эти исследования, подчеркнул Бхаттачарья и др. 12 и Шигета и др. 13, показали, что функции многих генов может быть изучен мутагенеза в F0 мозаика животных. Этот подход имеет множество преимуществ; Однако Cas9-sgRNA-microinjected эмбрионы часто отображения переменной фенотипов из-за неполной потери функции (LOF). Более значительно, поколение мутантных линий является весьма выгодным для некоторых приложений — в частности, при изучении генов, которые имеют материнской вклад мРНК. Матери мРНК и белки и их влияния на epigenetics, сохраняются для длительного периода в эмбриогенезе14,15,16, предоставление раннего развития вклад многих генов Огнеупорные материалы для F0 анализы. Таким образом необходимы другие подходы LOF.
При поиске для создания мутантных линий, путь для получения гомозиготных LOF эмбрионы есть несколько препятствий. Во-первых, эффективное мутагенеза производить biallelic перегласовок может быть невыгодно, поскольку потеря функций важно генов приводит к сбою дожить до половой зрелости, мешая производства жизнеспособных линии. Общее решение является тщательное титрования количество доставлены Cas9-sgRNA. Здесь цель – добиться баланса между снижение летальности также максимизируя эффективность мутагенеза микрофлорой. Вторая проблема возникает от стандартного разведения схемы, где фенотипические анализы откладываются до F2 поколения. Используя стандартный подход, сексуально зрелых F0 животных, которые передают мутант аллели через микрофлорой outcrossed для производства F1 гетерозиготных «носители», которые затем выросла до половой зрелости. Два F1 heterozygotes затем intercrossed производить F2 черепашки эмбрионов на ожидаемый Менделевское частоте 25%. Таким образом два поколения размножения необходимых для анализа мутант фенотипов. Мутанта животных может быть рецессивной или составные heterozygotes (т.е., потомства содержащий два разных мутантные аллели, которая зависит от генотипы родителей животных, используемых в Интеркросс1 F).
Эти препятствия могут быть преодолены, ограничивая программируемые нуклеиназы опосредованной мутагенеза в зародышевых клеток, которая лежит в основе новый метод под названием скачок17. Скачка имеет два основных компонента: (1 микроинъекции мРНК Cas вместе с sgRNA, или нуклеиназы sgRNA комплексов (или, в принципе, Таленс или цинка палец nucleases) на стадии одноклеточных, эффективно mutagenize эмбриональных геномов, следуют (2) Трансплантация PGCs в wildtype сестру эмбрионов, где эндогенного PGCs были удалены. Когда оба шаги являются эффективным, полный микрофлорой замена мутант зародышевые клетки могут быть получены. Blackler в начале 1960-х годов показал, что Xenopus PGCs могут быть трансплантированы между эмбрионов в конце Нейрула и раннего tailbud этапов18,19. Для скачка, Blackler подход был изменен путем выполнения пересадки на стадии Бластула17, когда PGCs локализованы в растительный полюс эмбриона20,21. Трансплантация перед гаструляция имеет два основных преимущества. Во-первых приживления трансплантатов и последующего нормального развития было установлено быть более эффективным, когда Трансплантация проводится на этапе Бластула (неопубликованные наблюдения). Во-вторых выполняя Бластула этап трансплантаций вскоре после того, как началась zygotic транскрипции, можно избежать летальность, вытекающие из развития генных мутаций, которые нарушают гаструляция или что в противном случае привести к искаженной конце neurulae. PGC трансплантации подшипник («leapfrogged») эмбрионов выращиваются для половой зрелости, и intercrosses между этими животными0 F показали, что во многих случаях 100% F1 потомства отображения LOF фенотипу (большинство из них составные heterozygotes), указав полный микрофлорой замена с целевой мутации.
Ожидается, что скачок ускорит генетических подходов в Xenopus. Прорыва также предоставляет альтернативу «хозяин передачи» метод22 для анализа LOF гены материнского эффекта (неопубликованные наблюдения). В текущей публикации подробное описание метода, особенно упором на трансплантации PGC, представлен в X. tropicalis (с незначительными изменениями на X. laevis). Трансплантация PGCs продемонстрировали здесь для облегчения более быстрой передачи этой технологии других лабораторий, работающих с Xenopus. Принципы этого метода должен быть успешными в других амфибий (например, urodeles), и организм конкретных изменений в методологии следует предусматривать приложения для многих других животных, в которых может быть достигнуто эффективное мутагенеза и PGCs легко которые спасаютжизньпритрансплантации.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот отчет содержит подробный протокол для трансплантации растительной ткани, содержащие PGCs. трансплантация PGCs используется в сочетании с геном редактирования технологий (например, ТРИФОСФАТЫ/Cas9) для изменения микрофлорой животного во время поддержание почти все его соматическ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была выполнена при поддержке гранта, 5R21HD080684-02, из Национального института здоровья ребенка и развития человеческого потенциала. Автор хотела бы поблагодарить Кена Чо за его неизменную энтузиазм и поддержку. Автор также хотели бы признать Брюс Blumberg, для использования его камеры, Ревекка Чарни, для критических чтении рукопись и Шон Макнамара и Marcin Wlizla в национальном Xenopus ресурсов (RRID:SCR_013731), для ценных разговоры о X. tropicalis кормления и ухода за животными схемы.
Materials
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 or 11252-30 | |
| Eyebrow hair knife | Homemade | ||
| Hair loop | Homemade | ||
| Pasteur pipettes, borosilicate glass | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Krazy Glue (Cyanoacrylate-based) | Elmer's Products, Inc. | KG581 | To affix eyebrow hair and hair loops into Pasteur pipettes, other similar glues can be used. |
| Oligodeoxynucleotides, custom ordered | Integrated DNA Technologies | Custom ordered | Template oligos for sgRNA synthesis, see Nakayama et al., 2014 for design details. |
| Megascript T7 kit | Ambion/ThermoFisher | AM1334 | Or use Megashortscript T7 (AM1354) kit |
| Phenol, Tris buffered | High quality distilled phenol from any commercial supplier | ||
| Chloroform | High quality chloroform from any commercial supplier | ||
| Ethanol | High quality ethanol from any commercial supplier | ||
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma Chemical Co. | D5758-50ML | |
| Cas9 protein, with nuclear localization signal | PNA Bio, Inc. | CP01 | Reconstituted using DEPC-treated water according to manufacturer's recommendations |
| 10X Marc's Modified Ringers solution | Homemade. Recipe (ref 26) for 1X MMR (lacking EDTA) is 100mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES. Solution is pH adjusted to 7.4. | ||
| Agarose | Any Molecular Biology grade agarose is sufficient | ||
| 60 X15 mm Petri plates | Falcon | 351007 | |
| 24-well plates | Falcon | 3047 | |
| L-Cysteine | Sigma Chemical Co. | C7352-100G | Free base, not HCl salt |
| Proteinase K | Roche | 03 115 828 001 | Typically ~20mg/ml from Roche |
| sera Micron | sera | Tadpole food. Resuspend in growth medium. Can be purchased from a variety of online retailers |
References
- Gurdon, J. B., Hopwood, N. The introduction of Xenopus laevis into developmental biology: of empire, pregnancy testing and ribosomal genes. Int J Dev Biol. 44 (1), 43-50 (2000).
- Hellsten, U., et al. The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis. Science. 328 (5978), 633-636 (2010).
- Session, A. M., et al. Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis. Nature. 538 (7625), 336-343 (2016).
- Blitz, I. L., Biesinger, J., Xie, X., Cho, K. W. Biallelic genome modification in F(0) Xenopus tropicalis embryos using the CRISPR/Cas system. Genesis. 51 (12), 827-834 (2013).
- Nakayama, T., Fish, M. B., Fisher, M., Oomen-Hajagos, J., Thomsen, G. H., Grainger, R. M. Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis. Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).
- Guo, X., et al. Efficient RNA/Cas9-mediated genome editing in Xenopus tropicalis. Development. 141 (3), 707-714 (2014).
- Wang, F., Shi, Z., Cui, Y., Guo, X., Shi, Y. B., Chen, Y. Targeted gene disruption in Xenopus laevis using CRISPR/Cas9. Cell Biosci. 5, 15 (2015).
- Jaffe, K. M., et al. c21orf59/kurly Controls Both Cilia Motility and Polarization. Cell Rep. 14 (8), 1841-1849 (2016).
- Liu, Z., et al. Efficient genome editing of genes involved in neural crest development using the CRISPR/Cas9 system in Xenopus embryos. Cell Biosci. 6, 22 (2016).
- Naert, T., et al. CRISPR/Cas9 mediated knockout of rb1 and rbl1 leads to rapid and penetrant retinoblastoma development in Xenopus tropicalis. Sci Rep. 6 (35264), (2016).
- Ratzan, W., Falco, R., Salanga, C., Salanga, M., Horb, M. E. Generation of a Xenopus laevis F1 albino J strain by genome editing and oocyte host-transfer. Dev Biol. 426 (2), (2016).
- Bhattacharya, D., Marfo, C. A., Li, D., Lane, M., Khokha, M. K. CRISPR/Cas9: An inexpensive, efficient loss of function tool to screen human disease genes in Xenopus. Dev Biol. 408 (2), 196-204 (2015).
- Shigeta, M., et al. Rapid and efficient analysis of gene function using CRISPR-Cas9 in Xenopus tropicalis founders. Genes Cells. 21 (7), 755-771 (2016).
- Hontelez, S., et al. Embryonic transcription is controlled by maternally defined chromatin state. Nat Commun. 6, 10148 (2015).
- Peshkin, L., et al. On the Relationship of Protein and mRNA Dynamics in Vertebrate Embryonic Development. Dev Cell. 35 (3), 383-394 (2015).
- Owens, N. D., et al. Measuring Absolute RNA Copy Numbers at High Temporal Resolution Reveals Transcriptome Kinetics in Development. Cell Rep. 14 (3), 632-647 (2016).
- Blitz, I. L., Fish, M. B., Cho, K. W. Leapfrogging: primordial germ cell transplantation permits recovery of CRISPR/Cas9-induced mutations in essential genes. Development. 143 (15), 2868-2875 (2016).
- Blackler, A. W. Transfer of germ-cells in Xenopus laevis. Nature. 185, 859-860 (1960).
- Blackler, A. W., Fischberg, M. Transfer of primordial germ-cells in Xenopus laevis. J Embryol. Exp Morph. 9, 634-641 (1961).
- Bounoure, L. . L’origine des cellules reproductrices et le problem de la lignee germinale. , (1939).
- Nieuwkoop, P. D., Sutasurya, L. A. . Primordial Germ Cells in the Chordates: Embryogenesis and phylogenesis. , (1979).
- Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. C. Fertilization of cultured Xenopus oocytes and use in studies of maternally inherited molecules. Methods Cell Biol. 36, 213-230 (1991).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Embryo dissection and micromanipulation tools. CSH Protoc. , (2007).
- Nakayama, T., et al. Cas9-based genome editing in Xenopus tropicalis. Methods Enzymol. 546, 355-375 (2014).
- Ogino, H., McConnell, W. B., Grainger, R. M. High-throughput transgenesis in Xenopus using I-SceI meganuclease. Nat Protoc. 1 (4), 1703-1710 (2006).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early development of Xenopus laevis.: a laboratory manual. , (2000).
- Kay, B. K., Kay, B. K., Peng, H. B. Injection of oocytes and embryos. Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology (Methods in Cell Biology Vol. 36). , (1991).
- Nieuwkoop, P., Faber, J. . Normal Table of Xenopus laevis. (Daudin): A Systematical and Chronological Survey of the Development from the Fertilized Egg till the End of Metomorphosis. , (1994).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Res. 42 (22), e168 (2014).
- Sander, V., Reversade, B., De Robertis, E. M. The opposing homeobox genes Goosecoid and Vent1/2 self-regulate Xenopus patterning. EMBO J. 26 (12), 2955-2965 (2007).
- Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
- Kim, J. M., Kim, D., Kim, S., Kim, J. S. Genotyping with CRISPR-Cas-derived RNA-guided endonucleases. Nat Commun. 5, 3157 (2014).
- Kim, H. J., Lee, H. J., Kim, H., Cho, S. W., Kim, J. S. Targeted genome editing in human cells with zinc finger nucleases constructed via modular assembly. Genome Res. 19 (7), 1279-1288 (2009).
- Qiu, P., Shandilya, H., D’Alessio, J. M., O’Connor, K., Durocher, J., Gerard, G. F. Mutation detection using Surveyor nuclease. Biotechniques. 36 (4), 702-707 (2004).
- Ota, S., et al. Efficient identification of TALEN-mediated genome modifications using heteroduplex mobility assays. Genes Cells. 18 (6), 450-458 (2013).
- Dahlem, T. J., et al. Simple Methods for Generating and Detecting Locus- Specific Mutations Induced with TALENs in the Zebrafish Genome. PLoS Genet. 8 (8), e1002861 (2012).
- Ramlee, M. K., Yan, T., Cheung, A. M., Chuah, C. T., Li, S. High-throughput genotyping of CRISPR/Cas9-mediated mutants using fluorescent PCR-capillary gel electrophoresis. Sci Rep. 5, 15587 (2015).
- Bhattacharya, D., Marfo, C. A., Li, D., Lane, M., Khokha, M. K. CRISPR/Cas9: An inexpensive, efficient loss of function tool to screen human disease genes in Xenopus. Dev Biol. 408 (2), 196-204 (2015).
- Yu, C., Zhang, Y., Yao, S., Wei, Y. A PCR Based Protocol for Detecting Indel Mutations Induced by TALENs and CRISPR/Cas9 in Zebrafish. PLoS ONE. 9 (6), e98282 (2014).
- Mock, U., Hauber, I., Fehse, B. Digital PCR to assess gene-editing frequencies (GEF-dPCR) mediated by designer nucleases. Nat Protoc. 11 (3), 598-615 (2016).
- Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).
- Shi, J., Wang, E., Milazzo, J. P., Wang, Z., Kinney, J. B., Vakoc, C. R. Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains. Nat Biotechnol. 33 (6), 661-667 (2015).
- Koebernick, K., Loeber, J., Arthur, P. K., Tarbashevich, K., Pieler, T. Elr-type proteins protect Xenopus Dead end mRNA from miR-18-mediated clearance in the soma. Proc Natl Acad Sci USA. 107, 16148-16153 (2010).
- Yang, J., Aguero, T., King, M. L. The Xenopus maternal-to-zygotic transition from the perspective of the germline. Curr Top Dev Biol. 113, 271-303 (2015).
