Primordiala könsceller Transplantation för CRISPR/Cas9-baserade bli ledande i Xenopus

Summary

Gener som är nödvändig för överlevnad utgöra tekniska hinder för att skapa mutant linjer. Bli ledande kringgår dödlighet genom att kombinera genomet redigering med primordiala könsceller transplantation till skapa vildtyp djur som bär könsceller mutationer. Bli ledande tillåter också effektiv generering av homozygot null mutanter i F₁ generationen. Här demonstreras steget transplantation.

Abstract

Skapandet av muterade linjer genom gen editering accelererar genetisk analys i många organismer. CRISPR/Cas9 metoder har anpassats för användning i afrikanska kloförsedda grodan, Xenopus, långvariga modellorganism för biomedicinsk forskning. Traditionell avel system för att skapa homozygot muterad linjer med CRISPR/Cas9-riktad mutagenes har flera tidsödande och mödosamma steg. För att underlätta skapandet av muterade embryon, särskilt för att övervinna de hinder som är associerad med knackar ut gener som är viktiga för embryogenes, utvecklades en ny metod som kallas bli ledande. Denna teknik utnyttjar robustheten i Xenopus embryon att ”klippa och klistra” embryologiska metoder. Bli ledande använder tredjeparts överföring av primordiala könsceller (PGCs) från effektivt-mutagenized givare embryon till PGC-uppföljningsstudien vildtyp syskon. Denna metod möjliggör effektiv mutationen av viktiga gener genom att skapa chimära djur med vildtyp somatiska celler som bär en mutant könsceller. När två F₀ djur som bär ”leapfrog transplantationer” (dvs, mutant könsceller) är intercrossed, de producerar homozygot eller sammansatt heterozygot, null F₁ embryon, vilket sparar en hel tid att skaffa fenotypiska data. Bli ledande ger också en ny metod för att analysera maternell effekt gener, som är refraktära mot F₀ fenotypiska analys efter CRISPR/Cas9 mutagenes. Detta manuskript Detaljer metoden för bli ledande, med särskild tonvikt på hur man lyckas utföra PGC transplantation.

Introduction

Hur genotyp kodar fenotyp har varit en stor fråga i biologi eftersom återupptäckten av Mendels lagar. En förståelse för gener, deras reglering och växelverkan inom genen nätverk roller och funktioner kodade produkter löften att ge verktyg för avtäckning nya biologi och ameliorating sjukdomstillstånd. För mer än hälften en talet¹, har afrikanska kloförsedda grodan, Xenopus, varit en ledande modell för studier på en mängd olika ämnen i grundläggande biologi och biomedicin, inklusive genetisk kontroll av utveckling. Historiskt har de flesta forskning om Xenopus har använt allotetraploid grodan, X. laevis, men mer nyligen, på grund av dess diploidy, X. tropicalis har utvecklats som en amfibie genetisk modell. Hela genomet sekvenser har samlats från både Xenopus arter^2,3. Gemenskapens ”groda” är nu vid en vändpunkt där grundläggande genomet ändring teknik tillåter studier av geners funktion, praktiskt taget på kommer. Programmerbara CRISPR/Cas9 endonucleases har gjort mutagenicitet gener högeffektiva, med biallelic mutation möjligt i de flesta celler av djur^{4,5,6,7, 8,9,10,11}. Dessa studier, ministerkvartetten Bhattacharya et al. ¹² och Shigeta o.a. ¹³, har visat att många geners funktion kan studeras av mutagenicitet i F₀ mosaik djur. Detta tillvägagångssätt har många fördelar; Cas9-sgRNA-microinjected embryon visas dock ofta variabla fenotyper på grund av ofullständig förlust av funktion (LOF). Mer påtagligt, generering av muterade linjerna är mycket fördelaktigt för vissa program – i synnerhet när man studerar gener som har ett moderns mRNA-bidrag. Maternell mRNA och proteiner och deras påverkan på epigenetik, kvarstår under en längre period i embryogenes^14,15,16, rendering tidigt utvecklings bidrag från många gener eldfasta F₀ analyser. Därför krävs andra LOF tillvägagångssätt.

När man vill skapa mutant linjer, har sökvägen till att erhålla homozygot LOF embryon flera hinder. Första, effektiv mutagenes att producera biallelic mutationer kan vara ofördelaktigt eftersom förlust av viktiga genen funktioner resulterar i fel att överleva till könsmognad, störa produktionen av en livskraftig linje. En gemensam lösning är försiktig titrering av mängden Cas9-sgRNA levereras. Här är målet att uppnå en balans mellan att minska dödlighet samtidigt också maximera könsceller mutagenes effektivitet. Ett andra problem uppstår från systemet med standard avel, där fenotypiska analyser är uppskjuten tills den F₂ generationen. Med standardmetoden, könsmogna F₀ djur som överför mutant alleler genom könsceller är outcrossed för att producera F₁ heterozygot ”bärare”, som odlas sedan till könsmognad. Två F₁ heterozygoter är sedan intercrossed för att producera F₂ mutant embryon i förväntade Mendelian frekvens på 25%. Två generationer av avel är således nödvändiga för analys av muterade fenotyper. Muterade djur kan vara antingen homozygoter eller sammansatta heterozygoter (dvs avkomma som innehåller två olika muterade alleler, vilket beror på genotyperna av de föräldra djur som används i den F₁ intercross).

Dessa hinder kan övervinnas genom att begränsa programmerbara nuclease-medierad mutagenes att könsceller, som ligger bakom en ny metod som kallas utvecklingssprång¹⁷. Bli ledande har två huvudsakliga komponenter: (1) Mikroskop Cas mRNA tillsammans med sgRNA eller nuclease-sgRNA komplex (eller, i princip, TALENs eller zink finger nukleotider) på encelliga scenen för att effektivt mutagenize embryonala genomen, följt av (2) transplantation av PGCs till vildtyp syskon embryon, där de endogena PGCs togs bort. När båda stegen är effektiv, komplett könsceller ersättning med muterade könsceller kan erhållas. Blackler visade i början av 1960 att Xenopus PGCs kunde transplanteras mellan embryon på den sena neurula och tidig tailbud arrangerar^18,19. För att bli ledande, ändrades Blacklers strategi genom att utföra transplantationerna på blastula etapp¹⁷, när PGCs är lokaliserade i vegetal stången av embryo^20,21. Transplantation före gastrulation har två huvudsakliga fördelar. Först, engraftment transplantationer och efterföljande normala utveckling befanns vara effektivare när transplantation görs i ett skede blastula (opublicerade observationer). Andra, genom att utföra blastula-scenen transplantationer strax efter zygotic transkription har börjat, kan man undvika den dödlighet som följd utvecklingsmässiga genen mutationer som stör gastrulation eller som annars leder till missbildade sena neurulae. PGC transplantation räntebärande (”leapfrogged”) embryon odlas till könsmognad och intercrosses mellan dessa F₀ djur har visat att, i många fall 100% av F₁ avkomman visar LOF fenotypen (de flesta som är sammansatta heterozygoter), som anger komplett könsceller ersättning med de rikta mutationerna.

Det förväntas att bli ledande kommer att påskynda genetiska metoder i Xenopus. Bli ledande föreskrivs också ett alternativ till ”host överföring” metod²² LOF analysen av mödra-effekt gener (opublicerade observationer). I den aktuella publikationen presenteras en detaljerad beskrivning av metoden, med särskilt fokus på PGC transplantation, i X. tropicalis (med smärre ändringar för X. laevis). Transplantation av PGCs demonstreras här för att underlätta en snabbare överföring av denna teknik till andra laboratorier som arbetar med Xenopus. Principerna för denna metod bör vara framgångsrika i andra groddjur (t.ex. urodeles), och organism-specifika ändringar i metodik bör möjliggöra för att många andra djur som effektiv mutagenes kan åstadkommas och PGCs är lätt transplanterbara.

Protocol

Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén vid University of California, Irvine. 1. förberedelser för PGC Transplantation Förbereda dissektion verktyg i förväg, som tidigare beskrivits23.Obs: Ögonbryn hår knivar används för att göra snitt med hjälp av en hår slinga att stabilisera embryot medan du utför operationerna. Ögonbryn hår och hår slingor är limmade i borosilikatglas …

Representative Results

Efter transplantation, kvalitativ bestämning av effekten av CRISPR/Cas9 mutagenes bör utföras innan spilla ansträngningen i djurhållning att växa och behålla djuren till könsmognad. Eftersom djur som bär leapfrog transplantationer är somatically vildtyp och könsceller är svårt att få tillgång till direkta mätningar, blir det viktigt att spara slaktkroppar av givare embryon. DNA-analys från slaktkroppar fungerar som en proxy för omfattningen av mutagenes som uppstår i de…

Discussion

Denna rapport ger ett detaljerat protokoll för transplantation av vegetal vävnad innehållande PGCs. Transplantation av PGCs används i samband med editering teknik (t.ex. CRISPR/Cas9) för att ändra könsceller av djur medan att behålla nästan alla dess somatiska vävnader som genetiskt vildtyp. För att bli ledande för att lyckas, finns det ett antal kritiska faktorer att överväga innan du utför utför transplantationer.

För att säkerställa fullständig ersättning av k?…

Materials

Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11252-20 or 11252-30
Eyebrow hair knife			Homemade
Hair loop			Homemade
Pasteur pipettes, borosilicate glass	Fisher Scientific	13-678-20A
Krazy Glue (Cyanoacrylate-based)	Elmer's Products, Inc.	KG581	To affix eyebrow hair and hair loops into Pasteur pipettes, other similar glues can be used.
Oligodeoxynucleotides, custom ordered	Integrated DNA Technologies	Custom ordered	Template oligos for sgRNA synthesis, see Nakayama et al., 2014 for design details.
Megascript T7 kit	Ambion/ThermoFisher	AM1334	Or use Megashortscript T7 (AM1354) kit
Phenol, Tris buffered			High quality distilled phenol from any commercial supplier
Chloroform			High quality chloroform from any commercial supplier
Ethanol			High quality ethanol from any commercial supplier
Diethylpyrocarbonate (DEPC)	Sigma Chemical Co.	D5758-50ML
Cas9 protein, with nuclear localization signal	PNA Bio, Inc.	CP01	Reconstituted using DEPC-treated water according to manufacturer's recommendations
10X Marc's Modified Ringers solution			Homemade. Recipe (ref 26) for 1X MMR (lacking EDTA) is 100mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES. Solution is pH adjusted to 7.4.
Agarose			Any Molecular Biology grade agarose is sufficient
60 X15 mm Petri plates	Falcon	351007
24-well plates	Falcon	3047
L-Cysteine	Sigma Chemical Co.	C7352-100G	Free base, not HCl salt
Proteinase K	Roche	03 115 828 001	Typically ~20mg/ml from Roche
sera Micron	sera		Tadpole food. Resuspend in growth medium. Can be purchased from a variety of online retailers