Een gemodificeerd Yeast-One Hybrid System voor Heteromere Proteïne Complex-DNA Interactie Studies
Summary
De gemodificeerde gist-een-hybride analyse die hier wordt beschreven is een uitbreiding van de klassieke gist-hybride (Y1H) -assay om de heteromeer eiwitcomplex-DNA-interactie te onderzoeken en valideren in een heterologe systeem voor elke functionele genomica-studie.
Abstract
In de loop der jaren is de gist-hybride test een belangrijke techniek voor de identificatie en validatie van fysieke interacties tussen eiwitten zoals transcriptiefactoren (TF's) en hun DNA-doelwit. De hier geplaatste methode maakt gebruik van het onderliggende concept van de Y1H, maar wordt verder gemodificeerd om eiwitcomplexen te binden en te valideren die binden aan hun doel DNA. Derhalve wordt het aangeduid als de gemodificeerde gist-een-hybride (Y1.5H) -assay. Deze analyse is kosteneffectief en kan gemakkelijk uitgevoerd worden in een reguliere laboratoriuminstelling. Alhoewel het gebruik van een heterologe systeem, zou de beschreven methode een waardevol instrument kunnen zijn om het heteromeer eiwitcomplex te binden aan hun DNA-doelwit (en) voor functionele genomica in elk systeem van studie, met name plantgenetica, te testen en te valideren.
Introduction
In het algemeen, om eiwit-DNA-interacties te begrijpen, is de Y1H-analyse het voorkeurssysteem dat succesvol is gebruikt in een laboratoriuminstelling 1 . De basis Y1H analyse omvat twee componenten: a) een reporterconstruct met DNA van belang die succesvol is gekloneerd stroomopwaarts van een gen dat codeert voor een reporter eiwit; En b) een expressieconstruct dat een fusie-eiwit tussen de TF van belang en een gist transcriptie activatie domein (AD) zal genereren. Het DNA van belang wordt vaak aangeduid als 'aas', terwijl het fusie-eiwit bekend staat als 'prooi'. In de afgelopen jaren zijn meerdere versies van de Y1H-test ontwikkeld om aan specifieke behoeften te voldoen met hun eigen voordelen 2 . De bestaande Y1H-analyse kan succesvol worden geïmplementeerd om de interactie van één eiwit tegelijkertijd te identificeren en te valideren met zijn DNA-aas, maar ontbreekt aan de mogelijkheid om heterodimere of multimere eiwit-DNA-interacties te identificeren.
"> De hier beschreven methode is een gewijzigde versie van de bestaande Y1H waardoor onderzoekers gelijktijdig meerdere eiwitten kunnen binden die binden aan hun doel DNA-sequentie (en). Het doel van deze analyse is om het eiwit van belang uit te drukken met een activatie domein (pDEST22: TF) en de activatie van de kandidaat-DNA-regio's die gefuseerd zijn aan een verslaggever in de aanwezigheid en / of afwezigheid van de interactieve eiwitpartner (pDEST32ΔDBD-TF) in het gistsysteem beoordelen. Deze analyse zal ons toelaten om te bepalen of de interactie tussen deze twee Eiwitten zijn nodig voor het activeren van het doel. Dit is een GATEWAY-kloningsysteem en is daarom uitvoerbaar in een reguliere laboratoriumomgeving. Dit protocol is gebaseerd op directe transformatie, die het gemak van de co-transformatie van verschillende TF's in een gistsysteem mogelijk maakt . Zo is het een voordelige strategie om de eiwitcomplexen te binden die binden aan hun mogelijke DNA-doelen voor in vitro moleculaire en functionele validatie fOf elk systeem. Huidige technieken zoals Tandem affiniteitszuivering (TAP) methoden zijn kostbaar en arbeidsintensief, maar laten opsporen van proteïen heterrocomplexen op grote schaal 3 , 4 , 5 . Deze gemodificeerde gist-hybride kan met succes op een kleine schaal worden uitgevoerd ( Figuur 1 ) en is ook kosteneffectief. De Y1.5H-analyse kan onderzoekers over de gehele gemeenschap vergemakkelijken om hun hypothese te testen en te valideren om de rol van multimere eiwitcomplex te binden aan een gemeenschappelijk DNA-doelwit met behulp van een heterologe systeem. Op grond van de bevindingen kan de hypothese in vivo in het voorkeursonderzoek worden gevalideerd. Onlangs hebben we deze benadering gebruikt om de rol van een TF en zijn wijze van actie te bepalen om bloei in Arabidopsis 6 te regelen.Protocol
Representative Results
Discussion
De bestaande Y1H standaardprocedure is geschikt voor het identificeren van een enkelvoudige eiwitbietbinding aan het DNA-aas. Met diverse technische wijzigingen is het bestaande systeem aangewend voor het definiëren van transcriptie regulerende netwerken. TF's zijn echter bekend als een onderdeel van complexen die twee of meer TF's of eiwitten omvatten, waarbij slechts enkele van de TF in staat zijn om aan het DNA te binden. Proteïnen of TF's die alleen de eiwitbindende domeinen bezitten en het vermogen he…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We bedanken SS Wang, M. Amar en A. Galla voor het kritisch lezen van het manuscript. Onderzoek dat in deze publicatie is gerapporteerd, werd ondersteund door het Nationaal Instituut voor Algemene Medische Wetenschappen van de National Institutes of Health onder onderscheidingsnummers RO1GM067837 en RO1GM056006 (naar SAK). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health.
Materials
| pDEST22 vector | Invitrogen | PQ1000101 | Pro-Quest Two hybrid system kit |
| pDEST32delatDBD | Invitrogen | PQ1000102 | Pro-Quest Two hybrid system kit; this vecor is modified. It is pDEST32 minus DNA binding Domain |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K240020 | |
| YM4271 Strain | Clontech | K1603-1 | MATCHMAKER One-Hybrid System |
| pEXP-AD502 | Invitrogen | PQ1000101 | Pro-Quest Two hybrid system kit |
| GATEWAY LR Clonase II enzyme mix | Invitrogen | 11791020 | |
| YPDA media | Clontech | 630410 | |
| SD-Agar | Clontech | 630412 | |
| SD minimal media | Clontech | 630411 | |
| Uracil DO Supplement | Clontech | 630416 | |
| Tryptophan Do Supplement | Clontech | 630413 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| EDTA | Fisher Scientific | S311-500 | |
| LiAc | Sigma-Aldrich | L4158 | |
| Saplmon Sperm (10mg/ml) | Invitrogen | 15632011 | |
| 96 well round bottom Plate | Greiner bio-one | 650101 | |
| PEG3350 | Sigma-Aldrich | 1546547 | |
| 96-deep well block | USA Scientific | 1896-2000 | |
| Sealable Foil | USA Scientific | 2923-0110 | |
| Araseal | Excel Scientific | B-100 | |
| 2-mercaptoethanol | Fisher Scientific | 034461-100 | |
| ONPG | Sigma-Aldrich | 73660 | |
| Na2CO3 | Sigma-Aldrich | 223484 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S3139 | |
| KCL | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 83266 | |
| HCL | Fisher Scientific | SA54-4 | |
| Drybath | Thermo Fischer | ||
| Voretx | Thermo Fischer | ||
| Centrifgue | Eppendorf | Centrifuge 5810R | |
| Plate Reader | Molecular Device | SPECTRAMAX PLUS Microplate Spectrophotometer | |
| Incubator | Thermo Fisher | Model No. 5250- 37 Degree, 6250-30 degrees | |
| Shaker Incubator | New Brunswick | ||
| Water Bath | Thermo Fisher | IsoTemp 205 | |
| Puncher | |||
| 50 ml Falocn | BD Falcon | ||
| Beaker | Nalgene | ||
| Flask | Nalgene | ||
| Petriplates (150mm) | Greiner bio-one |
References
- Saghbini, M., Hoekstra, D., Gautsch, J. Media formulations for various two-hybrid systems. Methods Mol Biol. 177, 15-39 (2001).
- Reece-Hoyes, J. S., Marian Walhout, A. J. Yeast one-hybrid assays: A historical and technical perspective. Methods. 57 (4), 441-447 (2012).
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).
- Puig, O., et al. The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Gavin, A. -. C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).
- Tripathi, P., Carvallo, M., Hamilton, E. E., Preuss, S., Kay, S. A. Arabidopsis B-BOX32 interacts with CONSTANS-LIKE3 to regulate flowering. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (1), 172-177 (2017).
- Helfer, A., et al. LUX ARRHYTHMO encodes a nighttime repressor of circadian gene expression in the Arabidopsis core clock. Curr Biol : CB. 21 (2), 126-133 (2011).
- Pruneda-Paz, J. L., et al. A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsis transcription factors. Cell Rep. 8 (2), 622-632 (2014).
- Wanke, D., Harter, K. Analysis of Plant Regulatory DNA sequences by the Yeast-One-Hybrid Assay. Methods Mol Biol. 479, 291-309 (2009).
- Klein, P., Dietz, K. -. J. Identification of DNA-Binding Proteins and Protein-Protein Interactions by Yeast One-Hybrid and Yeast Two-Hybrid Screen. Methods Mol Biol. 639, 171-192 (2010).
- Breton, G., Kay, S. A., Pruneda-Paz, J. L. Identification of Arabidopsis Transcriptional Regulators by Yeast One-Hybrid Screens Using a Transcription Factor ORFeome. Methods Mol Biol. 1398, 107-118 (2016).
- Deplancke, B., Vermeirssen, V., Arda, H. E., Martinez, N. J., Walhout, A. J. M. Gateway-Compatible Yeast One-Hybrid Screens. CSH Protoc. 2006 (5), (2006).
- Deplancke, B., Dupuy, D., Vidal, M., Walhout, A. J. M. A gateway-compatible yeast one-hybrid system. Genome Res. 14 (10B), 2093-2101 (2004).
