Un lievito modificato - un sistema ibrido per studi di interazione tra DNA e proteine eteromeriche
Summary
Il saggio di un ibrido di lievito modificato qui descritto è un'estensione del saggio classico del lievito un ibrido (Y1H) per studiare e convalidare l'interazione heteromera della proteina-complesso del DNA in un sistema eterologo per qualsiasi studio genomico funzionale.
Abstract
Nel corso degli anni il test di un ibrido del lievito ha dimostrato di essere una tecnica importante per l'identificazione e la convalida delle interazioni fisiche tra proteine quali i fattori di trascrizione (TFs) e il loro target di DNA. Il metodo presentato qui utilizza il concetto sottostante del Y1H ma è modificato ulteriormente per studiare e validare complessi proteici legati al loro DNA target. Quindi, viene definito come il lievito modificato un ibrido (Y1.5H). Questo test è economico e può essere facilmente eseguito in un normale ambiente di laboratorio. Sebbene utilizzando un sistema eterologo, il metodo descritto potrebbe essere un valido strumento per testare e convalidare il complesso proteomico eteromerico legato al loro target di DNA per la genomica funzionale in qualsiasi sistema di studio, in particolare la genomica vegetale.
Introduction
In generale, per comprendere le interazioni proteine-DNA, il saggio Y1H è il sistema preferito utilizzato con successo in un ambiente di laboratorio 1 . Il test Y1H di base coinvolge due componenti: a) un costruttore di reporter con DNA di interesse con successo clonato a monte di un gene che codifica una proteina reporter; E b) un costrutto di espressione che genera una proteina di fusione tra il TF di interesse e un dominio di attivazione della trascrizione di lieviti (AD). Il DNA di interesse è comunemente indicato come 'esca' mentre la proteina di fusione è conosciuta come 'preda'. Negli ultimi anni sono state sviluppate più versioni del test Y1H per soddisfare le esigenze specifiche con i propri vantaggi 2 . Il test Y1H esistente può essere implementato con successo per identificare e convalidare l'interazione di una proteina alla volta con l'esca del DNA, ma manca la capacità di identificare interazioni tra proteine e DNA eterodimeriche o multimeriche.
"> Il metodo descritto qui è una versione modificata dei ricercatori che consentono Y1H di studiare contemporaneamente più proteine legate alla loro sequenza di DNA target. L'obiettivo di questo test è quello di esprimere la proteina di interesse con un dominio di attivazione (pDEST22: TF) e valutare l'attivazione delle regioni del DNA candidato fuso ad un reporter in presenza e / o assenza del partner proteico interagente (pDEST32ΔDBD-TF) nel sistema di lievito.Questo dosaggio ci permetterà di determinare se l'interazione tra questi due Proteine è necessario per l'attivazione del bersaglio.Questo è un sistema compatibile di clonazione GATEWAY e quindi è possibile utilizzare in un ambiente di laboratorio regolare.Questo protocollo è basato sulla trasformazione diretta, che fornisce la facilità di co-trasformazione di TF differenti in un sistema di lievito , Quindi è una strategia vantaggiosa per convalidare i complessi proteici che si legano ai loro possibili bersagli del DNA per la convalida molecolare e funzionale in vitro fO qualsiasi sistema. Le tecniche attuali quali i metodi di purificazione di affinità tandem (TAP) sono costosi e impegnativi nel lavoro, ma consentono la rilevazione di hetrocomplex proteici su larga scala 3 , 4 , 5 . Questo ibrido di lievito modificato può essere eseguito con successo in una regolazione regolare di laboratorio su piccola scala ( figura 1 ) ed è anche conveniente. Il test Y1.5H può facilitare i ricercatori in tutta la comunità per verificare e convalidare la loro ipotesi per definire il ruolo del complesso proteico multimerico legato ad un comune obiettivo del DNA utilizzando un sistema eterologo. Sulla base dei risultati, l'ipotesi potrebbe essere convalidata in vivo nel sistema di studio preferito. Recentemente, abbiamo utilizzato questo approccio per definire il ruolo di un TF e il suo modo di azione per regolare la fioritura in Arabidopsis 6 .Protocol
Representative Results
Discussion
La procedura standard esistente Y1H è idonea per identificare una singola preda di proteine legata all'esca del DNA. Con varie modifiche tecniche, il sistema esistente è stato sfruttato per la definizione di reti regolatorie trascrizionali. Tuttavia, TFs sono noti per funzionare come parte di complessi che coinvolgono due o più TF o proteine, con solo alcuni dei TF in grado di legarsi al DNA. Le proteine oi TF che possiedono solo i domini leganti alla proteina e che non dispongono della capacità di l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo SS Wang, M. Amar e A. Galla per una lettura critica del manoscritto. La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta dall'Istituto Nazionale delle Scienze Mediche Generali degli Istituti Nazionali di Salute con i numeri di premio RO1GM067837 e RO1GM056006 (a SAK). Il contenuto è esclusivamente responsabile degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali degli Istituti Nazionali di Salute.
Materials
| pDEST22 vector | Invitrogen | PQ1000101 | Pro-Quest Two hybrid system kit |
| pDEST32delatDBD | Invitrogen | PQ1000102 | Pro-Quest Two hybrid system kit; this vecor is modified. It is pDEST32 minus DNA binding Domain |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K240020 | |
| YM4271 Strain | Clontech | K1603-1 | MATCHMAKER One-Hybrid System |
| pEXP-AD502 | Invitrogen | PQ1000101 | Pro-Quest Two hybrid system kit |
| GATEWAY LR Clonase II enzyme mix | Invitrogen | 11791020 | |
| YPDA media | Clontech | 630410 | |
| SD-Agar | Clontech | 630412 | |
| SD minimal media | Clontech | 630411 | |
| Uracil DO Supplement | Clontech | 630416 | |
| Tryptophan Do Supplement | Clontech | 630413 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| EDTA | Fisher Scientific | S311-500 | |
| LiAc | Sigma-Aldrich | L4158 | |
| Saplmon Sperm (10mg/ml) | Invitrogen | 15632011 | |
| 96 well round bottom Plate | Greiner bio-one | 650101 | |
| PEG3350 | Sigma-Aldrich | 1546547 | |
| 96-deep well block | USA Scientific | 1896-2000 | |
| Sealable Foil | USA Scientific | 2923-0110 | |
| Araseal | Excel Scientific | B-100 | |
| 2-mercaptoethanol | Fisher Scientific | 034461-100 | |
| ONPG | Sigma-Aldrich | 73660 | |
| Na2CO3 | Sigma-Aldrich | 223484 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S3139 | |
| KCL | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 83266 | |
| HCL | Fisher Scientific | SA54-4 | |
| Drybath | Thermo Fischer | ||
| Voretx | Thermo Fischer | ||
| Centrifgue | Eppendorf | Centrifuge 5810R | |
| Plate Reader | Molecular Device | SPECTRAMAX PLUS Microplate Spectrophotometer | |
| Incubator | Thermo Fisher | Model No. 5250- 37 Degree, 6250-30 degrees | |
| Shaker Incubator | New Brunswick | ||
| Water Bath | Thermo Fisher | IsoTemp 205 | |
| Puncher | |||
| 50 ml Falocn | BD Falcon | ||
| Beaker | Nalgene | ||
| Flask | Nalgene | ||
| Petriplates (150mm) | Greiner bio-one |
References
- Saghbini, M., Hoekstra, D., Gautsch, J. Media formulations for various two-hybrid systems. Methods Mol Biol. 177, 15-39 (2001).
- Reece-Hoyes, J. S., Marian Walhout, A. J. Yeast one-hybrid assays: A historical and technical perspective. Methods. 57 (4), 441-447 (2012).
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).
- Puig, O., et al. The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Gavin, A. -. C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).
- Tripathi, P., Carvallo, M., Hamilton, E. E., Preuss, S., Kay, S. A. Arabidopsis B-BOX32 interacts with CONSTANS-LIKE3 to regulate flowering. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (1), 172-177 (2017).
- Helfer, A., et al. LUX ARRHYTHMO encodes a nighttime repressor of circadian gene expression in the Arabidopsis core clock. Curr Biol : CB. 21 (2), 126-133 (2011).
- Pruneda-Paz, J. L., et al. A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsis transcription factors. Cell Rep. 8 (2), 622-632 (2014).
- Wanke, D., Harter, K. Analysis of Plant Regulatory DNA sequences by the Yeast-One-Hybrid Assay. Methods Mol Biol. 479, 291-309 (2009).
- Klein, P., Dietz, K. -. J. Identification of DNA-Binding Proteins and Protein-Protein Interactions by Yeast One-Hybrid and Yeast Two-Hybrid Screen. Methods Mol Biol. 639, 171-192 (2010).
- Breton, G., Kay, S. A., Pruneda-Paz, J. L. Identification of Arabidopsis Transcriptional Regulators by Yeast One-Hybrid Screens Using a Transcription Factor ORFeome. Methods Mol Biol. 1398, 107-118 (2016).
- Deplancke, B., Vermeirssen, V., Arda, H. E., Martinez, N. J., Walhout, A. J. M. Gateway-Compatible Yeast One-Hybrid Screens. CSH Protoc. 2006 (5), (2006).
- Deplancke, B., Dupuy, D., Vidal, M., Walhout, A. J. M. A gateway-compatible yeast one-hybrid system. Genome Res. 14 (10B), 2093-2101 (2004).
