Un sistema híbrido modificado de levadura-uno para estudios de interacción de ADN complejo-proteína heterotérica
Summary
El ensayo de un híbrido de levadura modificado descrito aquí es una extensión del ensayo clásico de levadura híbrida (Y1H) para estudiar y validar la interacción heteromérica de complejo de proteína-ADN en un sistema heterólogo para cualquier estudio de genómica funcional.
Abstract
A lo largo de los años, el ensayo híbrido de levadura ha demostrado ser una técnica importante para la identificación y validación de interacciones físicas entre proteínas tales como factores de transcripción (TFs) y su diana de ADN. El método presentado aquí utiliza el concepto subyacente de la Y1H pero se modifica adicionalmente para estudiar y validar los complejos de proteínas que se unen a su ADN diana. Por lo tanto, se denomina el ensayo de hibridación de hongo de levadura modificado (Y1.5H). Este ensayo es rentable y puede realizarse fácilmente en un entorno de laboratorio regular. Aunque utilizando un sistema heterólogo, el método descrito podría ser una valiosa herramienta para probar y validar el complejo de proteína heteromérica que se une a su (s) diana (s) de ADN para genómica funcional en cualquier sistema de estudio, especialmente genómica de plantas.
Introduction
En general, para comprender las interacciones proteína-ADN, el ensayo Y1H es el sistema preferido utilizado con éxito en un entorno de laboratorio 1 . El ensayo Y1H básico implica dos componentes: a) un constructo reportero con ADN de interés clonado con éxito aguas arriba de un gen que codifica una proteína reportera; Y b) un constructo de expresión que generará una proteína de fusión entre el TF de interés y un dominio de activación de transcripción de levadura (AD). El ADN de interés se conoce comúnmente como "cebo" mientras que la proteína de fusión se conoce como "presa". En años anteriores, se han desarrollado versiones múltiples del ensayo Y1H para adaptarse a necesidades específicas con sus propias ventajas 2 . El ensayo Y1H existente puede implementarse con éxito para identificar y validar la interacción de una proteína a la vez con su cebo de ADN, pero carece de la capacidad para identificar interacciones heterodiméricas o multiméricas de proteína-ADN.
El método descrito aquí es una versión modificada del Y1H existente que permite a los investigadores estudiar simultáneamente múltiples proteínas que se unan a su secuencia o secuencias de ADN diana El objetivo de este ensayo es expresar la proteína de interés con un dominio de activación (pDEST22: TF) y evaluar la activación de las regiones de ADN candidatas fusionadas a un reportero en presencia y / o ausencia de la pareja de proteínas que interactúa (pDEST32ΔDBD-TF) en el sistema de levaduras.Este ensayo nos permitirá determinar si la interacción entre estos dos Proteínas es necesario para la activación de la diana.Este es un sistema compatible con la clonación GATEWAY y por lo tanto viable para su uso en un laboratorio regular.Este protocolo se basa en la transformación directa, que proporciona la facilidad de co-transformación de diferentes TFs en un sistema de levadura Por lo tanto, es una estrategia ventajosa para validar los complejos de proteínas vinculante a sus posibles dianas de ADN para validación molecular y funcional in vitro fO cualquier sistema. Las técnicas actuales, tales como los métodos Tandem de purificación de afinidad (TAP), son costosas y requieren mucho trabajo, pero permiten la detección de hetrocomplexos de proteínas a gran escala 3 , 4 , 5 . Este híbrido de levadura modificado se puede llevar a cabo con éxito en un laboratorio regular a pequeña escala ( Figura 1 ) y también es rentable. El ensayo de Y1.5H puede facilitar a los investigadores de toda la comunidad para probar y validar su hipótesis hacia la definición del papel de complejo de proteínas multiméricas vinculante a una diana común de ADN utilizando un sistema heterólogo. En base a los hallazgos, la hipótesis podría ser validada in vivo en el sistema de estudio preferido. Recientemente, hemos utilizado este enfoque para definir el papel de un TF y su modo de acción para regular la floración en Arabidopsis [ 6] .Protocol
Representative Results
Discussion
El procedimiento estándar de Y1H existente es adecuado para identificar una presa de proteína única que se une a su cebo de ADN. Con varias modificaciones técnicas, el sistema existente ha sido aprovechado para definir las redes reguladoras transcripcionales. Sin embargo, se sabe que los TF funcionan como una parte de complejos que implican dos o más TF o proteínas, con sólo algo de TF capaz de unirse al ADN. Las proteínas o TFs que poseen sólo los dominios de unión a proteínas y carecen de la capacidad para …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias a SS Wang, M. Amar y A. Galla por la lectura crítica del manuscrito. La investigación informada en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud bajo los números de premio RO1GM067837 y RO1GM056006 (a SAK). El contenido es exclusivamente responsabilidad de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.
Materials
| pDEST22 vector | Invitrogen | PQ1000101 | Pro-Quest Two hybrid system kit |
| pDEST32delatDBD | Invitrogen | PQ1000102 | Pro-Quest Two hybrid system kit; this vecor is modified. It is pDEST32 minus DNA binding Domain |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K240020 | |
| YM4271 Strain | Clontech | K1603-1 | MATCHMAKER One-Hybrid System |
| pEXP-AD502 | Invitrogen | PQ1000101 | Pro-Quest Two hybrid system kit |
| GATEWAY LR Clonase II enzyme mix | Invitrogen | 11791020 | |
| YPDA media | Clontech | 630410 | |
| SD-Agar | Clontech | 630412 | |
| SD minimal media | Clontech | 630411 | |
| Uracil DO Supplement | Clontech | 630416 | |
| Tryptophan Do Supplement | Clontech | 630413 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| EDTA | Fisher Scientific | S311-500 | |
| LiAc | Sigma-Aldrich | L4158 | |
| Saplmon Sperm (10mg/ml) | Invitrogen | 15632011 | |
| 96 well round bottom Plate | Greiner bio-one | 650101 | |
| PEG3350 | Sigma-Aldrich | 1546547 | |
| 96-deep well block | USA Scientific | 1896-2000 | |
| Sealable Foil | USA Scientific | 2923-0110 | |
| Araseal | Excel Scientific | B-100 | |
| 2-mercaptoethanol | Fisher Scientific | 034461-100 | |
| ONPG | Sigma-Aldrich | 73660 | |
| Na2CO3 | Sigma-Aldrich | 223484 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S3139 | |
| KCL | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 83266 | |
| HCL | Fisher Scientific | SA54-4 | |
| Drybath | Thermo Fischer | ||
| Voretx | Thermo Fischer | ||
| Centrifgue | Eppendorf | Centrifuge 5810R | |
| Plate Reader | Molecular Device | SPECTRAMAX PLUS Microplate Spectrophotometer | |
| Incubator | Thermo Fisher | Model No. 5250- 37 Degree, 6250-30 degrees | |
| Shaker Incubator | New Brunswick | ||
| Water Bath | Thermo Fisher | IsoTemp 205 | |
| Puncher | |||
| 50 ml Falocn | BD Falcon | ||
| Beaker | Nalgene | ||
| Flask | Nalgene | ||
| Petriplates (150mm) | Greiner bio-one |
References
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