شعور العديد من البروتينات في الخلية والحث على انحناء غشاء. يصف لنا طريقة لسحب الأنابيب النانوية الأغشية من الحويصلات الدهنية دراسة التفاعل بين البروتينات أو أي جزيء انحناء نشطة مع الأغشية منحنى في المختبر.
إعادة تشكيل غشاء الخلية جزء لا يتجزأ من العديد من الظواهر الخلوية، مثل الالتقام، الاتجار، وتشكيل فيلوبوديا، و ما إلى ذلك. إقران العديد من البروتينات المختلفة الأغشية منحنى بسبب قدرتهم على الشعور أو الحث على غشاء انحناء. وتشمل هذه العمليات عادة، العديد من البروتينات يجعلها معقدة للغاية لدراسة كمياً في الخلية. يصف لنا وضع بروتوكول لإعادة تشكيل غشاء منحنى في المختبر، محاكاة بنية خلوية منحنى مثل الرقبة اندوسيتيك. حويصلة أونيلاميلار عملاقة (جوف) كنموذج لغشاء الخلية، الضغط الداخلي والتوتر السطحي الذي يتم التحكم بتطلع ميكروبيبيتي. تطبيق قوة سحب نقطة على جيوف استخدام الملقط البصري يخلق نانو انحناء عالية متصلة بغشاء مسطح. تقليديا، استخدمت هذا الأسلوب لقياس الخواص الميكانيكية الأساسية للأغشية الدهنية، مثل الانحناء الصلابة. في السنوات الأخيرة، قد اتسع لدراسة كيفية تفاعل البروتينات مع انحناء الأغشية وطريقة تأثيرها على الشكل والميكانيكا الأغشية. نظام الجمع بين ميكرومانيبوليشن و microinjection وملاقط بصرية، والفحص المجهري [كنفوكل] يسمح قياس انحناء الغشاء والغشاء التوتر والكثافة السطحية للبروتينات، وفي نفس الوقت. من هذه القياسات، يمكن الاستدلال على العديد من الخصائص الميكانيكية والمورفولوجية الهامة نظام غشاء البروتين. وبالإضافة إلى ذلك، نحن وضع بروتوكول لإنشاء جوفس حضور تركيز الملح الفسيولوجي، وطريقة لقياس الكثافة السطحية للبروتينات في الغشاء من شدة الأسفار المسماة البروتينات والدهون.
ويرافق العديد من العمليات الخلوية، مثل الالتقام، الاتجار، وتشكيل فيلوبوديا، والعدوى، إلخ، تغييرا جذريا في شكل أغشية الخلية1،2. في الخلية، يشارك عدد من البروتينات في هذه العمليات بملزمة للغشاء وتغيير شكلها. أبرز الأمثلة من أعضاء الأسرة البروتين بن/أمفيفيسين/رفس (بار)، والتي تحتوي على سمة من سمات منحنى عضويا بار المجال3،،من45،،من67. بشكل عام، أنها تتفاعل مع الغشاء بالتقيد بالمجال بار على السطح، وفي كثير من الحالات، لوالب amphipathic إدراج أيضا شالوولي بيلايير. يحدد الشكل والحجم، والمسؤول عن المجال بار جنبا إلى جنب مع عدد لوالب أمفيباثيك: (1) باتجاه انحناء غشاء (أيما إذا كانت ستؤدي إينفاجينيشنز أو نتوءات)، و (2) ضخامة الغشاء انحناء5،8. الملاحظة، هنا انحناء إيجابية يعرف الجانب المحدب الغشاء المنحنى، أي، الإنتفاخ تجاه الجسيمات المتفاعلة، والسلبية خلاف ذلك. وعلاوة على ذلك، كشفت الدراسات الكمية لبار البروتينات أن تأثيرها على الغشاء الذي يعتمد على مجموعة من البارامترات الفيزيائية: سطح الكثافة من البروتينات والتوتر الغشاء شكل غشاء (شقة مقابل أنبوبي مقابل كروية الشكل)7. اعتماداً على هذه المعلمات بار البروتينات يمكن أن: (1) العمل كأجهزة استشعار لانحناء غشاء، (2) ثني الأغشية، أو (3) الحث على انفصال الغشاء7.
نظراً لضخامة عدد من العناصر المشتركة في إعادة تشكيل غشاء في الخلية، دراسة الجوانب الكمية من الظواهر، مثل الالتقام، في فيفو صعبة للغاية. في المختبر إعادة تشكيل لأدنى مكونات محاكاة أغشية منحنى في الخلية يوفر وسيلة لفهم كيف التقويس غشاء بروتينات تعمل آليا. توضح هذه المقالة بروتوكول إعادة تشكيل غشاء أنبوب نانوي في المختبر باستخدام ميكرومانيبوليشن، والفحص المجهري [كنفوكل]، وملاقط بصرية. يمكن استخدام النهج للدراسة، بطريقة كمية، كيفية تفاعل البروتينات، والدهون، أو الجزيئات الصغيرة مع أغشية منحنية. دهن جوفس تستخدم كنماذج لغشاء الخلية، انحناء التي تكاد لا تذكر مقارنة بحجم الجزيئات المتفاعلة غشاء التقويس. أنهم مستعدون باستخدام أسلوب اليكتروفورميشن9 التي تتشكل الحويصلات بترطيب فيلما دهن وتورم في جوفس تحت تيار المتردد (AC)10. ركائز الأكثر شيوعاً التي تزرع جوفس أما لوحات شبه موصلة المغلفة مع الإنديوم أكسيد القصدير (إيتو) أو أسلاك البلاتين (Pt-أسلاك)11. في هذا العمل، تزرع جوفس في Pt-الأسلاك كما تبين هذا الأسلوب في العمل أفضل بكثير من البديل في صنع جوفس حضور أملاح في المخزن المؤقت12. على الرغم من أن يتم وصف البروتوكول اليكتروفورميشن هنا بتفصيل كاف لإنتاجه، نشير للقارئ إلى المواد السابقة التي قد وصف أساليب مماثلة وأخرى من صنع جوفس في التفصيل13،14. في أيدينا، اليكتروفورميشن في Pt-الأسلاك بنجاح حقق جوفس من مزيج الدهون الاصطناعية أو من الدهن الطبيعية مقتطفات في المخزن مؤقت الذي يحتوي على ~ 100 ملم كلوريد الصوديوم. وعلاوة على ذلك، كان أيضا من الممكن لتغليف البروتينات داخل جوفس أثناء النمو. دائرة اليكتروفورميشن مثال لهو مبين في الشكل 1 (أ)؛ وهي تتألف من طوله ~ 10 سم Pt-سلكين إدراج حامل من تترافلوروايثيلين (PTFE) التي يمكن أن تكون مختومة في كلا الجانبين مع الزجاج كوفيرسليبس ~ 1-2 سم عن بعضها البعض (الشكل 1A).
رقم 1: الإعداد التجريبية. (أ) اليكتروفورميشن جيوف الدائرة مع إرفاقه Pt-أسلاك الموصلات الكهربائية. (ب) اليسار: النظام التجريبي عرض المجهر، الدائرة التجريبية أعلاه الهدف وهما ميكروبيبيتيس (اليمين واليسار) يعلق على ميكرومانيبولاتورس وإدراجها في قاعة تجريبية لسحب الأنبوب والبروتين حقن. حق: عرض عن قرب للدائرة التجريبية المركبة أعلاه هدف عرض النصائح من التطلع وميكروبيبيتيس حقن إدراج. (ج) ألف حقنه مزودة بموزع رقيقة إدراجها في ميكروبيبيتي على ظهره لهذه الغاية. الأسفل عرض عن قرب للموزع داخل ميكروبيبيتي مع الخط المنقط الأزرق تبين ميكروبيبيتي. ويستخدم هذا النظام لملء في ميكروبيبيتي مع الكازين تخميل سطح الزجاج، وأيضا أن تسد مع الزيوت المعدنية عند الحاجة. (د) نظام يستخدم لنضح كميات ميليلتر من الحل البروتين. متصل الإبرة حقنه والأنابيب التي يتم توصيلها إلى ميكروبيبيتي حقن. نصيحة ميكروبيبيتي بعناية منغمسين في حل البروتين ويستنشق ذلك لملء هذه المعلومة ميكروبيبيتي. ميكروبيبيتي ثم العودة مليئة الزيوت المعدنية باستخدام النظام هو مبين في لوحة جيم الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
أنبوب نانوي غشاء، تمتد في دائرة نصف قطرها من 7 شمال البحر الأبيض المتوسط إلى عدة مئات شمال البحر الأبيض المتوسط، يمكن أن يتم سحبها من جيوف بقوة خارجية. هذا الأسلوب في البداية صمم لقياس خصائص مرونة أغشية الخلية وحويصلات، مثل صلابة الانحناء15،16. في الأعمال الأخيرة، مددت الطريقة لدراسة تفاعل البروتينات مع الأغشية منحنية بالبروتينات القرب من أنبوب نانوي سحبت7،17ميكروينجيكتينج. وقد وضعت أساليب أخرى لدراسة البروتينات الغشاء التقويس. في أسلوب واحد، هي المحتضنة البروتينات الدهنية بطريقة مختلفة الحجم المربوطة إلى سطح تخميلها ب. [كنفوكل] مجهرية يستخدم لقياس ملزمة البروتين كدالة للقطر الحويصلية، التي يمكن أن تشير إلى18،الفرز التي يسببها انحناء19. في أسلوب آخر، يتم حقن البروتينات بالقرب جيوف يستنشق الدقيقة لقياس قدرتها على حمل الأنابيب20،21عفويا. الطريقة الموصوفة في هذا البروتوكول مناسبة فريدة لدراسة البروتينات الغشاء التقويس المشاركة في الالتقام، حيث تواجه معظم البروتينات عادة الأنابيب النانوية غشاء بريفورميد الاتصال invagination الغشاء المحتوية على بضائع مع الكامنة وراء غشاء البلازما المسطحة. وعلاوة على ذلك، في هذا الأسلوب، خلافا في المقايسة مع الدهنية الصغيرة المربوطة، أنبوب نانوي الغشاء بشكل مستمر متصل بالغشاء؛ ولذلك، من توازن الميكانيكية مع جيوف، وضع المتوقع في فيفو. ومن ثم يطبق الفيزياء الغشاء الأساسية ويمكننا أن نستنتج عدد كبير الخواص الميكانيكية من لدينا قياسات22،،من2324.
لتنفيذ كامل لهذا الأسلوب، يشمل المعدات اللازمة مجهر [كنفوكل]، وملاقط بصرية، وواحد أو اثنين من ميكروبيبيتيس متصل بخزان لمياه (الشكل 1B). من خلال الجمع بين الثلاثة، فمن الممكن في الوقت نفسه قياس التوتر الغشاء، انحناء غشاء، الكثافة السطحية للبروتينات، وأنبوب القوة25. ضروري تطلع ميكروبيبيتي وأنها هي التي شيدت بسهولة عن طريق إدراج ميكروبيبيتي زجاج إلى حامل متصل بخزان مياه، والتي، عن طريق الضغط الهيدروليكي، يتحكم الضغط تطلع26. يتم التحكم في ميكروبيبيتي وصاحب ميكرومانيبولاتور، ومن الناحية المثالية، في اتجاه واحد قبل بيزو المشغل الميكانيكي لحركة الدقة. لسحب أنبوب نانوي، ميكرواسبيراتيد جيوف عالق بإيجاز إلى الحجم ميكرون حبة ثم سحبها بعيداً إنشاء أنبوب نانوي. في هذا التنفيذ، هو عقد حبة بملاقط بصرية، التي يمكن بناؤها باتباع بروتوكول منشورة27. من الممكن الاستغناء عن ملاقط بصرية وسحب الأنابيب النانوية بطرق مختلفة، على الرغم من أن حساب قياسات دقيقة القوة. إذا أنها صعبة جداً لبناء إعلام بصري أو إذا قياسات القوة ضرورية لا، كما هو الحال إذا كان أحد يريد ببساطة للتحقق من تفضيل البروتينات للأغشية المنحنى، ويمكن سحب أنبوب استخدام حبة ويستنشق في تلميح ميكروبيبيتي الثانية28. من الممكن أيضا سحب الأنابيب باستخدام قوة الجاذبية29 أو30،31التدفق. وعلاوة على ذلك، الفحص المجهري [كنفوكل] ليست ضرورية أما؛ ومع ذلك، ومن المفضل حتى لقياس الكثافة السطحية للبروتينات. كما أنه يتيح قياس نصف قطر أنبوب نانوي من الأسفار كثافة الدهون في الأنبوب، وبالتالي صرف النظر عن التوتر وقوة الغشاء. استنتاج نصف قطر الأنبوب من الأسفار مهم بشكل خاص إذا كانت العلاقة بين هذه الكميات ينحرف عن معادلات راسخة بسبب الوجود بروتينات الغشاء انضمت25. الأهم من ذلك، واحدة لا يمكن الاستغناء عن كل من فخ بصري والفحص المجهري [كنفوكل]، كما أنه لا يمكن قياس انحناء الأنبوب.
وقد استخدمت الأسلوب كما هو موضح في هذا البروتوكول للدراسة التي يسببها انحناء فرز مختلف البروتينات الغشاء المحيطي في الأنابيب النانوية، الذين معظمهم من شريط الأسرة25،،من3233،34 . وتبين أيضا أن القناة على شكل كونيكالي البوتاسيوم transmembrane كفاب أثري في منحنى الأنابيب النانوية بنفس الطريقة كما بار البروتينات35. عن طريق تحسين طريقة لتغليف البروتينات داخل جوفس، تفاعل البروتينات مع انحناء سلبي التحقيق مؤخرا ك جيدا36. وعلاوة على ذلك، تم استخدام هذا الأسلوب لتوضيح تشكيل البروتين السقالات25،37 ودراسة إليه انفصال الغشاء بأي خط التوتر38، البروتين دينامين39، أو بواسطة شريط البروتينات40،41. بالإضافة إلى البروتينات، والجزيئات الصغيرة أو الأيونات يمكن أن يستحث أيضا انحناء. باستخدام هذا الأسلوب، قد أظهرت أيونات الكالسيوم للحث على انحناء إيجابية تحت ظروف خالية من الملح42. من المثير للاهتمام، فإنه أيضا قد ثبت أن الدهون يمكن الخضوع لانحناء الفرز، على الرغم من أن فقط للمؤلفات التي بالقرب نقطة ديميكسينج43،44. وخلاصة القول، الطريقة التي يمكن استخدامها من قبل الباحثين المهتمين بالتحقيق في كيفية أما مكونات الغشاء لا يتجزأ (مثلالدهون أو البروتينات transmembrane) أو محيطيا ملزمة جزيئات (سواء داخل أو خارج جوفس) تتفاعل مع الأغشية] منحنى، من وجهتي نظر الميكانيكية والكمية. من المعتزم أيضا للراغبين في قياس الخواص الميكانيكية للغشاء نفسه22،،من2345.
طريقة سحب أنابيب من جوفس يعطي معلومات غنية عن نظام بروتين غشائي، كما أنها ليست سوى وسيلة لقياس الخواص الميكانيكية الأساسية للغشاء، ولكنه يساعد على تسليط الضوء على اقتران بين البروتينات والأغشية انحناء. كما ورد في المقدمة، توجد تقنيات أخرى لقياس آثار البروتينات الغشاء التقويس، تفرخ البر?…
The authors have nothing to disclose.
يشكر المؤلفون سوري بينوا، داميان كوفيلير، ناسوي بيير، فرانسوا كويمينيور، وتومبس جيل لمساهماتهم الأساسية بإنشاء الأسلوب أنبوب نانوي في المجموعة. مجموعة P.B. ينتمي إلى الكونسورتيوم يزار سيلتيس سيلتيسفيبيو لابيكس (ANR-11-LABX0038)، وباريس العلوم والآداب (ANR-10-معرض أيدكس-0001-02). واو-جيم “تساي” مولت التطريز زمالة طويلة الأجل (التف 1527-2014) والإجراءات ماري كوري (H2020-مسكاً-لو-2014، المشروع غشاء-ezrin-أكتين). م. س. وهو “زميل جونيور المجتمع سيمونز ل” الزملاء.
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DOPC) | Avanti | 850375 | Example lipid used in data for Figure 3 |
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] [DSPE-PEG(2000)-biotin] | Avanti | 880129 | biotinylated lipid |
BODIPY-TR-C5-ceramide | Molecular Probes (ThermoFisher) | D7540 | fluorescent lipid |
BODIPY- FLC5-hexadecanoyl phosphatidylcholine (HPC*) | Molecular Probes (ThermoFisher) | fluorescent lipid for protein density calibration | |
egg L-α-phosphatidylcholine (eggPC) | Avanti | 840051 | used for calibrating the tube radius constant |
β-casein from bovine milk (>99%) | Sigma Aldrich | C6905 | used for passivating the micropipette and the experimental chamber |
Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
D(+) glucose | Sigma Aldrich | G7021 | |
NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | |
Tris | Sigma Aldrich | 10708976001 | |
osmometer | Loser | n/a | |
Pt-wires, 0.5 mm diameter, 99.99% pure | Goodfellow USA | PT005139 | used for GUV electroformation |
function generator | n/a | used to create current for GUV electroformation | |
putty sealant | Vitrex (from CML France) | CRIT 140013 | used to seal the electroformation chamber |
bath sonicator | n/a | useful to clean the electroformation chamber, but not crucial | |
Nikon TE2000 inverted microscope, eC1 confocal system (Nikon), with two laser lines (λ = 488 nm and 543 nm); optical tweezers induced by a 5 W ytterbium fiber continuous wave laser (λ > 1070 nm; IPG GmBH Germany) | an example of a confocal microscopy system equipped with optical tweezers | ||
micromanipulators | n/a | ||
borosilicate capillaries (with internal and external radii of 0.78 mm and 1 mm, respectively) | Harvard apparatus | 30-0036 | |
micropipette puller | Sutter Instrument | P-2100 | |
microforge | Narishige | MF-800 | |
piezoelectric actuator | Physik Instrumente | n/a | |
polystyrene streptavidin coated beads (diameter 3.2 µm) | Spherotech | SVP-30-5 |