Membran-Nanoröhrchen ziehen aus riesigen Unilamellar Vesikel

Summary

Viele Proteine in der Zelle spüren und Krümmung der Membran zu induzieren. Wir beschreiben eine Methode zur Membran Nanoröhrchen aus Lipid Vesicles, die Interaktion von Proteinen oder jede Krümmung-aktive Molekül mit gebogenen Membranen in VitroStudie ziehen.

Abstract

Die Umgestaltung der Zellmembran ist ein integraler Bestandteil der viele zelluläre Phänomene, z. B. Endozytose, Menschenhandel, die Bildung von Filopodien, etc.. Viele verschiedene Proteine assoziieren mit gebogenen Membranen aufgrund ihrer Fähigkeit, Sinn oder Membran Krümmung zu induzieren. Diese Prozesse beinhalten in der Regel eine Vielzahl von Proteinen macht sie zu komplex, um quantitativ in der Zelle zu studieren. Wir beschreiben ein Protokoll, um eine gebogene Membran in Vitro, rekonstruieren imitiert eine gebogene Zellstruktur, wie der endocytic Hals. Ein giant Unilamellar Vesicle (GUV) dient als ein Modell der Zellmembran, dessen Innendruck und Oberflächenspannung mit Mikropipette Aspiration gesteuert werden. Anwendung einer Zugkraft von Punkt auf der optischen Pinzette GUV erstellt ein Nanotube starken Kurven auf eine flache Membran verbunden. Diese Methode ist traditionell verwendet, um die grundlegenden mechanischen Eigenschaften der Lipidmembranen, wie biegen Steifigkeit zu messen. In den letzten Jahren wurde es erweitert um Interaktion von Proteinen mit Membran-Krümmung und die Art und Weise, die Sie die Form und die Mechanik der Membranen beeinflussen, zu studieren. Ein System verbindet Mikromanipulation, Mikroinjektion, optische Pinzette und konfokalen Mikroskopie ermöglicht Messung der Krümmung der Membran Membran Spannung und die Flächendichte von Proteinen, gleichzeitig. Aus diesen Messungen können viele wichtige mechanische und morphologische Eigenschaften von Protein-Membran-System abgeleitet werden. Darüber hinaus legen wir ein Protokoll GUVs im Beisein von physiologischen Salzkonzentration und eine Methode zur Quantifizierung der Flächendichte von Proteinen auf der Membran von Fluoreszenz-Intensität von markierte Proteine und Lipide zu schaffen.

Introduction

Viele zelluläre Prozesse, wie z. B. Endozytose, Menschenhandel, die Bildung von Filopodien, Infektion, etc., werden durch eine dramatische Veränderung in der Form von Zellmembranen^1,2begleitet. In der Zelle beteiligen sich eine Reihe von Proteinen in diesen Prozessen durch Bindung an die Membran und verändern ihre Form. Die bemerkenswertesten Beispiele sind Mitglieder der Bin/gekrümmte/Rvs (BAR)-Proteinfamilie, enthält ein Merkmal intrinsisch geschwungene BAR Domäne^3,4,5,6,7. In der Regel interagieren sie mit der Membran durch die Einhaltung der BAR-Domäne an die Oberfläche und in vielen Fällen auch flach amphipathische Helices in der Bilayer einfügen. Form, Größe und Ladung des Geschäftsfeldes BAR zusammen mit der Anzahl der amphipathische Helices bestimmt: (1) die Richtung der Krümmung der Membran (d. h., ob sie Invaginations oder Vorsprünge induziert werden), und (2) das Ausmaß der Membran Krümmung^5,8. Der Hinweis hier positive Krümmung der konvexen Seite die gebogene Membran, d.h., die Ausbuchtung in Richtung der wechselwirkenden Teilchen, und negative sonst bezeichnet. Darüber hinaus quantitative Studien der BAR Proteine ergaben, dass ihre Wirkung auf die Membran hängt von einer Reihe von physikalischen Parametern: Dichte von Proteinen, Membran-Spannung und Membran-Form (flach im Vergleich zu röhrenförmigen im Vergleich zu sphärischen Oberfläche Form)⁷. Abhängig von diesen Parametern BAR Proteine können: (1) dienen als Sensoren der Membran Krümmung, (2) beugen Membranen oder (3) induzieren Membran Spaltung⁷.

Aufgrund der Vielzahl der Beteiligten bei der Neugestaltung der Membran in die Zelle, studieren die quantitativen Aspekte der Phänomene, wie z. B. Endozytose Komponenten, ist in Vivo extrem schwierig. In-vitro- Rekonstitution der minimalen Komponenten imitiert gekrümmte Membranen in der Zelle ermöglicht ein mechanistischen Verständnis wie Membran-geschwungene Proteine zu betreiben. Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll um eine Membran Nanoröhrchen in Vitro mit Mikromanipulation, konfokale Mikroskopie und optische Pinzette wieder zusammenzusetzen. Der Ansatz kann verwendet werden, in einer quantitativen Weise zu untersuchen, wie Proteine, Lipide oder kleine Moleküle mit gebogenen Membranen interagieren. Lipid GUVs dienen als Modelle für eine Zellmembran, deren Krümmung im Vergleich zur Größe der interagierenden Membran-geschwungene Moleküle vernachlässigbar. Sie sind bereit, mit der Electroformation Methode⁹ in dem die Bläschen gebildet werden, durch ein Lipid-Film feuchtigkeitsspendende und Schwellung es in GUVs unter einem Wechselstrom (AC)¹⁰. Am häufigsten verwendeten Substrate auf die GUVs angebaut werden sind entweder halbleitenden Platten beschichtet mit Indium-Zinn-Oxid (ITO) oder Platin (Pt-Drähte)¹¹Drähte. In dieser Arbeit werden GUVs auf Pt-Drähte angebaut, wie diese Methode viel besser als die Alternative bei der Herstellung GUVs in Anwesenheit von Salzen in den Puffer¹²Arbeiten gezeigt hat. Obwohl das Electroformation-Protokoll ausreichend detailliert, es zu reproduzieren hier beschrieben ist, verweisen wir den Leser auf früheren Artikeln, in denen ähnliche und andere Verfahren zur Herstellung von GUVs im Detail^13,14beschrieben wurden. In unseren Händen hat Electroformation auf Pt-Drähte erfolgreich GUVs aus einer Mischung von synthetischen Lipiden oder natürliche Lipid Extrakte in einem Puffer mit ~ 100 mM NaCl erbracht. Darüber hinaus war es auch möglich, Proteine innen GUVs während des Wachstums zu Kapseln. Abbildung 1Azeigt eine Beispiel-Electroformation-Kammer; Es besteht aus zwei ca. 10 cm lange Pt-Drähte eingefügt in eine Halterung hergestellt aus Polytetrafluorethylen (PTFE), die auf beiden Seiten mit Glasdeckgläser versiegelt werden kann ~ 1-2 cm auseinander (Abb. 1A).

Abbildung 1: Versuchsaufbau. (A) die GUV Electroformation Kammer mit elektrischen Anschlüssen an Pt-Drähte befestigt. (B) links: das experimentelle System das Mikroskop zeigt, die experimentelle Kammer über das Ziel und zwei Mikropipetten (links und rechts) die Mikromanipulatoren zugeordnet und eingefügt in die experimentelle Kammer für das Rohr zu ziehen und Protein Injektion. Rechts: eine Nahansicht der experimentellen Kammer über dem Ziel zeigen die Spitzen der Aspiration und die Injektion Mikropipetten eingefügt montiert. (C) eine Spritze ist ausgestattet mit einem dünnen Dispenser in einer Mikropipette an seinem hinteren Ende eingefügt. Der Boden ist eine Nahansicht des Spenders in die Mikropipette mit der blau gepunkteten Linie umreißt die Mikropipette. Dieses System wird verwendet, um die Mikropipette mit Kasein auf die Glasoberfläche passiviert und füllen mit Mineralöl bei Bedarf wieder zu füllen. (D) ein System zur µL Mengen der Proteinlösung Aspirieren. Die Nadel ist verbunden, um eine Spritze und Schläuche, die mit der Injektion Mikropipette verbunden ist. Die Mikropipette Spitze sorgfältig eingetaucht in die Proteinlösung und abgesaugt, also um die Mikropipette Spitze gefüllt. Die Mikropipette wird dann wieder gefüllt mit Mineralöl mit dem System gezeigt im Bedienfeld “C. Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

Ein Membran-Nanoröhrchen, im Umkreis von 7 nm bis mehrere hundert nm, kann aus einer GUV durch eine externe Kraft gezogen werden. Diese Methode wurde ursprünglich entwickelt, um die elastischen Eigenschaften von Zellmembranen und Vesikel, wie z. B. die Biege Steifigkeit^15,16messen. In jüngsten Arbeiten wurde die Methode erweitert, um die Wechselwirkung von Proteinen mit gebogenen Membranen zu studieren, von den Proteinen in der Nähe der gezogenen Nanotube^7,17microinjecting. Andere Methoden haben für das Studium geschwungenen Membran Proteine entwickelt worden. In einer Methode sind Proteine mit unterschiedlich großen Liposomen angebunden an eine passivierte Oberfläche inkubiert. Konfokale Mikroskopie wird verwendet, um die Proteinbindung als Funktion der Liposomen Durchmesser messen die Krümmung-induzierte Sortierung^18,19angeben können. In einer anderen Methode werden Proteine in der Nähe einer Mikro-aspirierten GUV, Messen Sie ihre Fähigkeit, spontan Tubuli^20,21induzieren injiziert. In diesem Protokoll beschriebene Methode eignet sich eindeutig studieren geschwungenen Membran Proteine beteiligt Endozytose, begegnen die meisten Proteine in der Regel vorgeformte Membran Nanoröhren verbinden die Fracht-haltigen Membran Einstülpen mit der zugrunde liegenden flachen Plasmamembran. Darüber hinaus ist bei dieser Methode wird im Gegensatz zu in der Probe mit gefesselte kleine Liposomen Membran Nanotube kontinuierlich an die Membran verbunden; Daher ist es im mechanischen Gleichgewicht mit der GUV, eine Situation erwartet in Vivo. Daher grundlegende Membran Physik gilt, und wir können eine Vielzahl von mechanischen Eigenschaften ableiten, aus unseren Messungen^22,23,24.

Für eine vollständige Implementierung dieser Methode beinhaltet die notwendige Ausrüstung ein confocal Mikroskop, optische Pinzette und ein oder zwei Mikropipetten mit einem Wassertank (Abbildung 1 b) verbunden. Durch die Kombination aller drei, ist es möglich, gleichzeitig messen Membran Spannung, Membran Krümmung, Flächendichte von Proteinen, und Kraft²⁵Rohr. Mikropipette Aspiration ist wichtig und es ist einfach aufgebaut, indem man ein Glas Mikropipette in eine Halterung mit einem Wassertank, der über hydrostatischen Druck die Aspiration Druck^{26 steuert}verbunden. Die Mikropipette und der Halter sind mit einem Mikromanipulator und idealerweise in eine Richtung ein Piezo-Aktor für präzise Bewegung gesteuert. Ein Nanoröhrchen zu ziehen, ist Microaspirated GUV kurz auf ein Mikron mittelständische Korn dann zog Weg schaffen ein Nanotube aufgeklebt. In dieser Implementierung ist die Perle von optischen Pinzette gehalten, konstruiert werden kann, indem Sie die folgenden veröffentlichten Protokoll²⁷. Es ist möglich, auf unterschiedliche Weise der optischen Pinzette und Pull-Nanoröhren verzichten zwar auf Kosten der genaue Kraftmessungen. Wenn es zu schwierig, eine optische Falle zu bauen oder Kraftmessungen sind nicht zwingend notwendig, wie will man einfach nur die Vorliebe von Proteinen für gekrümmte Membranen überprüfen kann ein Rohr mit einer Perle an der Spitze einer zweiten Mikropipette²⁸aspiriert gezogen werden. Es ist auch möglich, ziehen Röhrchen mit Gravitationskraft²⁹ oder^30,31zu fließen. Darüber hinaus ist auch konfokalen Mikroskopie nicht wesentlich; Es ist jedoch so bevorzugt die Flächendichte von Proteinen zu messen. Es ermöglicht auch die Messung des Nanotube-Radius von Fluoreszenzintensität von Lipiden in der Röhre, also unabhängig von der Membran Kraft und Spannung. Ableitens Rohr-Radius von Fluoreszenz ist besonders wichtig, wenn die Beziehung zwischen diesen Größen von etablierten Gleichungen aufgrund des Vorhandenseins der Membran eingehalten Proteine²⁵abweicht. Wichtig ist, kann nicht einer optischen Falle sowohl der konfokalen Mikroskopie zu verzichten, da es nicht möglich, die Krümmung des Rohres zu messen.

Die Methode wie beschrieben in diesem Protokoll wurde verwendet, um zu studieren, die Krümmung-induzierte Sortierung von verschiedenen peripheren Membranproteinen auf Nanoröhren, vor allem diejenigen aus der BAR Familie^25,32,33,34 . Es wurde auch gezeigt, dass die konisch geformten transmembranen Kaliumkanal KvAP auf bereichert ist als BAR-Proteine³⁵Nanoröhren in gleicher Weise gebogen. Durch die Optimierung der Methode um Proteine innen GUVs Kapseln, ist die Interaktion von Proteinen mit negativer Krümmung vor kurzem als gut³⁶untersucht worden. Darüber hinaus wurde diese Methode, die Bildung von Protein Gerüste^25,37 aufzuklären und den Mechanismus der Spaltung der Membran durch entweder Linie Spannung³⁸, Protein Dynamin³⁹, oder BAR zu studieren verwendet Proteine-^40,–⁴¹. Neben Proteinen können kleine Moleküle oder Ionen auch Krümmung auslösen. Mit dieser Methode wurden Calcium-Ionen induzieren positive Krümmung unter salzfreie Bedingungen⁴²gezeigt. Interessanterweise hat auch gezeigt, dass die Lipide Krümmung sortieren, obwohl nur für Kompositionen unterziehen können, die in der Nähe ein demixing Punkt^43,44. Zusammenfassend lässt sich sagen die Methode kann verwendet werden, von Forschern interessiert untersucht wie entweder fester Membran-Komponenten (z. B., Lipide oder transmembranen Proteine) oder peripher Moleküle binden (entweder innen oder außen GUVs) interagieren mit zylindrisch gebogenen Membranen aus mechanischen und quantitativen Gesichtspunkten. Es richtet sich auch an Interessenten, die bei der Messung der mechanischen Eigenschaften der Membran selbst^22,23,45.

Protocol

1. Vorbereitung des GUVs von Electroformation auf Pt-Drähte Reinigen Sie die Electroformation Kammer (siehe Einführung und Abbildung 1A) und die Pt-Drähte mit einem organischen Lösungsmittel wie Ethanol oder Aceton, die Lipide Weg zu waschen und mit Wasser abzuwaschen die Salze.Hinweis: Wir empfehlen gründlich abwischen entfernt die Rückstände mit einem Ethanol-getränkten Tuch dann in Aceton, Ethanol, dann Wasser, jeweils für 5 min beschallen. <l…

Representative Results

Das Rohr ziehen Experiment kann wichtige mechanische Informationen über die Membran geben. Bei fehlender Proteine oder andere Moleküle, die paar mit Krümmung der Membran, die Membran zu erzwingen und Rohr-Radius kann mit Membran Spannung bezogen werden, durch die Anwendung der Canham Helfrich Hamiltonian zog Gleichung zu einem Schlauch aus GUV50,51 <img alt="Equation…

Discussion

Die Methode des Ziehens Röhren aus GUVs gibt umfassende Informationen über das Membranprotein System, wie es nicht nur die Mittel ist, um die grundlegenden mechanischen Eigenschaften der Membran zu messen, aber es hilft, die Aufschluss über die Kopplung zwischen Proteinen und Membran Krümmung. Wie in der Einleitung erwähnt, andere Techniken existieren, um die Wirkungen der Membran-geschwungene Proteine messen durch Inkubation der Proteine mit Sub-Mikrometer-Liposomen angebunden an eine passivierte Oberfläche<sup cl…

Materials

1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DOPC)	Avanti	850375	Example lipid used in data for Figure 3
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] [DSPE-PEG(2000)-biotin]	Avanti	880129	biotinylated lipid
BODIPY-TR-C5-ceramide	Molecular Probes (ThermoFisher)	D7540	fluorescent lipid
BODIPY- FLC5-hexadecanoyl phosphatidylcholine (HPC*)	Molecular Probes (ThermoFisher)		fluorescent lipid for protein density calibration
egg L-α-phosphatidylcholine (eggPC)	Avanti	840051	used for calibrating the tube radius constant
β-casein from bovine milk (>99%)	Sigma Aldrich	C6905	used for passivating the micropipette and the experimental chamber
Sucrose	Sigma Aldrich	S7903
D(+) glucose	Sigma Aldrich	G7021
NaCl	Sigma Aldrich	S7653
Tris	Sigma Aldrich	10708976001
osmometer	Loser	n/a
Pt-wires, 0.5 mm diameter, 99.99% pure	Goodfellow USA	PT005139	used for GUV electroformation
function generator		n/a	used to create current for GUV electroformation
putty sealant	Vitrex (from CML France)	CRIT 140013	used to seal the electroformation chamber
bath sonicator		n/a	useful to clean the electroformation chamber, but not crucial
Nikon TE2000 inverted microscope, eC1 confocal system (Nikon), with two laser lines (λ = 488 nm and 543 nm); optical tweezers induced by a 5 W ytterbium fiber continuous wave laser (λ > 1070 nm; IPG GmBH Germany)			an example of a confocal microscopy system equipped with optical tweezers
micromanipulators		n/a
borosilicate capillaries (with internal and external radii of 0.78 mm and 1 mm, respectively)	Harvard apparatus	30-0036
micropipette puller	Sutter Instrument	P-2100
microforge	Narishige	MF-800
piezoelectric actuator	Physik Instrumente	n/a
polystyrene streptavidin coated beads (diameter 3.2 µm)	Spherotech	SVP-30-5