Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles

Coline Pr&#233;vost; Feng-Ching Tsai; Patricia Bassereau; Mijo Simunovic

doi:10.3791/56086

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Biology

खींच झिल्ली नैनोट्यूब से विशाल Unilamellar बुलबुले

Published: December 07, 2017

doi:

10.3791/56086

Coline Prévost*^1,2,3, Feng-Ching Tsai*^1,4, Patricia Bassereau⁴, Mijo Simunovic⁵

¹Laboratoire Physico Chimie Curie, Institut Curie,PSL Research University, CNRS UMR168, ²Department of Genetics and Complex Diseases, T. H. Chan School of Public Health,Harvard Medical School, ³Department of Cell Biology,Harvard Medical School, ⁴Sorbonne Universités,UPMC University Paris 06, ⁵Center for Studies in Physics and Biology,The Rockefeller University

Summary

कोशिका भाव में कई प्रोटीन और झिल्ली वक्रता प्रेरित । हम एक विधि का वर्णन करने के लिए लिपिड बुलबुले से झिल्ली नैनोट्यूब खींचने के लिए प्रोटीन या किसी भी वक्रता में घुमावदार झिल्ली के साथ सक्रिय अणु की बातचीत का अध्ययन इन विट्रो।

Abstract

कोशिका झिल्ली का आकार कई सेलुलर घटनाएं, जैसे endocytosis, तस्करी, filopodia के गठन के एक अभिंन अंग है, आदि। कई अलग प्रोटीन क्योंकि उनके भावना या झिल्ली वक्रता को प्रेरित करने की क्षमता के घुमावदार झिल्ली के साथ संबद्ध । आमतौर पर, इन प्रक्रियाओं उंहें भी सेल में मात्रात्मक अध्ययन करने के लिए जटिल बनाने प्रोटीन की एक भीड़ शामिल है । हम इन विट्रो मेंएक घुमावदार झिल्ली का पुनर्गठन, एक घुमावदार सेलुलर संरचना, जैसे endocytic गर्दन नकल उतार के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन । एक विशालकाय unilamellar पुटिका (गुव) एक कोशिका झिल्ली, जिसका आंतरिक दबाव और सतह तनाव micropipette आकांक्षा के साथ नियंत्रित कर रहे है के एक मॉडल के रूप में प्रयोग किया जाता है । ऑप्टिकल चिमटी का उपयोग कर गुव पर एक बिंदु खींच बल लगाने उच्च वक्रता एक समतल झिल्ली से जुड़ा के एक नैनोट्यूब बनाता है । इस विधि परंपरागत रूप से इस तरह के झुकने कठोरता के रूप में लिपिड झिल्ली के मौलिक यांत्रिक गुणों को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है । हाल के वर्षों में, यह अध्ययन कैसे प्रोटीन झिल्ली वक्रता और जिस तरह से वे आकार और झिल्ली के यांत्रिकी को प्रभावित करने के साथ बातचीत का विस्तार किया गया है । एक micromanipulation, microinjection, ऑप्टिकल चिमटी, और फोकल माइक्रोस्कोपी के संयोजन प्रणाली झिल्ली वक्रता, झिल्ली तनाव, और प्रोटीन की सतह घनत्व, समवर्ती की माप की अनुमति देता है । इन मापनों से प्रोटीन-झिल्ली प्रणाली के कई महत्वपूर्ण यांत्रिक और रूपात्मक गुण अनुमानित किए जा सकते हैं. इसके अलावा, हम शारीरिक नमक एकाग्रता की उपस्थिति में GUVs बनाने का एक प्रोटोकॉल बाहर करना, और लेबल प्रोटीन और लिपिड के प्रतिदीप्ति तीव्रता से झिल्ली पर प्रोटीन की सतह घनत्व को बढ़ाता है की एक विधि ।

Introduction

कई सेलुलर प्रक्रियाओं, जैसे endocytosis, तस्करी, filopodia के गठन, संक्रमण, आदि, कोशिका झिल्ली¹^,²के आकार में एक नाटकीय परिवर्तन के साथ कर रहे हैं । कोशिका में, प्रोटीन की एक संख्या झिल्ली के लिए बाध्य और उनके आकार में फेरबदल करके इन प्रक्रियाओं में भाग लेते हैं । सबसे उल्लेखनीय उदाहरण बिन/Amphiphysin/Rvs (बार) प्रोटीन परिवार के सदस्य हैं, एक विशेषता आंतरिक रूप से घुमावदार बार डोमेन³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷। आमतौर पर, वे सतह के लिए बार डोमेन का पालन करके झिल्ली के साथ बातचीत और, कई मामलों में, यह भी उथले bilayer में amphipathic helices डालने । आकार, आकार, और amphipathic helices की संख्या के साथ बार डोमेन के प्रभारी निर्धारित करता है: (1) झिल्ली वक्रता की दिशा (यानी, चाहे वे invaginations या दखलंदाजी प्रेरित करेंगे), और (2) झिल्ली की भयावहता वक्री^५^,^८. नोट की, यहां सकारात्मक वक्रता घुमावदार झिल्ली के उत्तल पक्ष के रूप में परिभाषित किया गया है, यानी, बातचीत कण की ओर उभार, और अंयथा नकारात्मक । इसके अलावा, बार प्रोटीन के मात्रात्मक अध्ययन से पता चला कि झिल्ली पर उनके प्रभाव शारीरिक मापदंडों का एक सेट पर निर्भर करता है: प्रोटीन की सतह घनत्व, झिल्ली तनाव, और झिल्ली आकार (फ्लैट बनाम ट्यूबलर बनाम गोलाकार आकृति)⁷। इन मापदंडों पर निर्भर करता है बार प्रोटीन कर सकते हैं: (1) झिल्ली वक्रता के सेंसर के रूप में अधिनियम, (2) मोड़ झिल्ली, या (3) scission⁷प्रेरित ।

कोशिका में आकार देने वाली झिल्ली में शामिल घटकों की सरासर संख्या के कारण, इस तरह के endocytosis के रूप में घटना के मात्रात्मक पहलुओं का अध्ययन, vivo में बेहद चुनौतीपूर्ण है. इन विट्रो में न्यूनतम घटकों के पुनर्गठन के सेल में घुमावदार झिल्ली नकल उतारने के लिए कैसे झिल्ली-curving प्रोटीन संचालित की एक यंत्रवत समझ हासिल करने के लिए साधन प्रदान करता है । यह आलेख micromanipulation, फोकल माइक्रोस्कोपी और ऑप्टिकल चिमटी का उपयोग करके इन विट्रो में एक झिल्ली नैनोट्यूब का पुनर्गठन करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है । दृष्टिकोण का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, एक मात्रात्मक तरीके से, कैसे प्रोटीन, लिपिड, या छोटे अणुओं घुमावदार झिल्ली के साथ बातचीत. लिपिड GUVs एक कोशिका झिल्ली के मॉडल के रूप में उपयोग किया जाता है, जिसका वक्रता झिल्ली-curving अणुओं के आदान-प्रदान के आकार की तुलना में नगण्य है । वे electroformation विधि⁹ जिसमें बुलबुले एक लिपिड फिल्म जलयोजन द्वारा गठित कर रहे है और यह GUVs में एक बारी वर्तमान (एसी)¹⁰के तहत सूजन का उपयोग कर तैयार कर रहे हैं । सबसे आम सब्सट्रेट जिस पर GUVs हो रहे हैं या तो अर्द्ध प्रवाहकीय इंडियम टिन ऑक्साइड (इतो) या प्लैटिनम तारों (पीटी-तारों)¹¹के साथ लेपित प्लेटें हैं । इस काम में, GUVs पीटी तारों पर बड़े हो रहे है के रूप में इस पद्धति के लिए अधिक बफर में लवण की उपस्थिति में GUVs बनाने में विकल्प से बेहतर काम दिखाया गया है¹²। हालांकि electroformation प्रोटोकॉल यहां पर्याप्त विस्तार में वर्णित करने के लिए इसे पुन: पेश है, हम पिछले लेख जिसमें समान और GUVs बनाने के अंय तरीकों को विस्तार से वर्णन किया गया है¹³^,¹⁴के लिए पाठक का उल्लेख । हमारे हाथ में, पीटी-तारों पर electroformation सफलतापूर्वक सिंथेटिक लिपिड के मिश्रण से या प्राकृतिक लिपिड अर्क से एक बफर युक्त में GUVs प्राप्त किया गया है ~ १०० mM NaCl. इसके अलावा, यह भी विकास के दौरान GUVs अंदर प्रोटीन encapsulate संभव था । एक उदाहरण electroformation कक्ष चित्र 1aमें दिखाया गया है; यह शामिल है दो ~ 10 सेमी लंबी पीटी-तारों polytetrafluoroethylene (PTFE) है कि ग्लास coverslips ~ 1-2 सेमी के अलावा(चित्र 1a) के साथ दोनों पक्षों पर सील किया जा सकता से बने धारक में डाला ।

चित्र 1: प्रायोगिक सेटअप. (क) पीटी-तारों से जुड़ी विद्युत connectors के साथ गुव electroformation चैम्बर. (ख) बाएं: प्रयोगात्मक प्रणाली माइक्रोस्कोप दिखा रहा है, उद्देश्य और दो micropipettes ऊपर प्रयोगात्मक चैंबर (बाएं और दाएं) micromanipulators से जुड़ी और ट्यूब पुलिंग और प्रोटीन के लिए प्रयोगात्मक चैंबर में डाला इंजेक्शन. ठीक है: आकांक्षा और इंजेक्शन micropipettes के सुझावों को दर्शाते हुए वस्तुस्थिति के ऊपर मुहिम चलाने वाले प्रयोगात्मक चैंबर का एक क्लोज-अप देखने को मिले । (ग) एक पतली मशीन के साथ सुसज्जित सिरिंज अपनी पीठ के अंत में एक micropipette में डाला । नीचे एक बंद-micropipette के अंदर मशीन के नीले बिंदीदार रेखा के साथ micropipette रूपरेखा को देखने के ऊपर है । इस प्रणाली के लिए कैसिइन के साथ micropipette भरने के लिए कांच की सतह passivate और भी खनिज तेल के साथ वापस भरने की जरूरत है जब प्रयोग किया जाता है । (D) प्रोटीन सॉल्यूशन की µ l मात्राओं को महाप्राण करने के लिए एक प्रणाली का प्रयोग किया जाता है । सुई एक सिरिंज से जुड़ा है और टयूबिंग जो इंजेक्शन micropipette से जुड़ा है करने के लिए । micropipette टिप ध्यान से प्रोटीन समाधान और aspirated में डूबे तो micropipette टिप को भरने के लिए है । micropipette तो वापस खनिज तेल से भरा पैनल सी में दिखाया प्रणाली का उपयोग कर रहा है कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

एक झिल्ली नैनोट्यूब, 7 एनएम से कई सौ एनएम के लिए त्रिज्या में लेकर, एक बाहरी बल द्वारा एक गुव से खींचा जा सकता है । इस विधि शुरू में ऐसे झुकने कठोरता¹⁵^,¹⁶के रूप में कोशिका झिल्ली और बुलबुले, के लोचदार गुणों को मापने के लिए डिज़ाइन किया गया था । सबसे हाल ही में काम करता है, विधि खींचा नैनोट्यूब⁷^,¹⁷के पास प्रोटीन microinjecting द्वारा घुमावदार झिल्ली के साथ प्रोटीन की बातचीत का अध्ययन करने के लिए बढ़ाया गया था । झिल्ली-curving प्रोटीन के अध्ययन के लिए अन्य तरीकों को विकसित किया गया है । एक विधि में, प्रोटीन अलग आकार liposomes एक passivated सतह के लिए सीमित के साथ मशीन हैं । फोकल माइक्रोस्कोपी liposome व्यास के एक समारोह के रूप में प्रोटीन बाइंडिंग को मापने के लिए प्रयोग किया जाता है, जो वक्री प्रेरित¹⁸^,¹⁹छँटाई संकेत कर सकते हैं । एक अंय विधि में, प्रोटीन एक सूक्ष्म aspirated गुव के पास इंजेक्शन के लिए उनके सहज नलिकाओं²⁰^,²¹प्रेरित करने की क्षमता को मापने के लिए कर रहे हैं । इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधि विशिष्ट endocytosis में शामिल झिल्ली-curving प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए अनुकूल है, जहां आम तौर पर सबसे अधिक प्रोटीन के साथ माल युक्त झिल्ली invagination जोड़ने नैनोट्यूब के अनुरूप झिल्ली मुठभेड़ अंतर्निहित फ्लैट प्लाज्मा झिल्ली । इसके अलावा, इस विधि में, सीमित छोटे liposomes के साथ परख में विपरीत, झिल्ली नैनोट्यूब लगातार झिल्ली से जुड़ा हुआ है; इसलिए, यह गुव, एक स्थिति vivo मेंकी उंमीद के साथ यांत्रिक संतुलन में है । इसलिए, मौलिक झिल्ली भौतिकी लागू होता है और हम हमारे माप²²^,²³^,²⁴से यांत्रिक गुणों के ढेर सारे अनुमान कर सकते हैं ।

इस विधि के एक पूर्ण कार्यांवयन के लिए, आवश्यक उपकरण एक फोकल माइक्रोस्कोप, ऑप्टिकल चिमटी, और एक या दो micropipettes एक पानी की टंकी (चित्र 1b) से जुड़ा शामिल है । सभी तीन के संयोजन से, यह एक साथ झिल्ली तनाव, झिल्ली वक्रता, प्रोटीन की सतह घनत्व, और ट्यूब बल²⁵को मापने के लिए संभव है । Micropipette आकांक्षा आवश्यक है और यह आसानी से एक पानी की टंकी से जुड़े एक धारक में एक गिलास Micropipette डालने के द्वारा निर्माण किया है, जो, हीड्रास्टाटिक दबाव के माध्यम से, आकांक्षा दबाव²⁶नियंत्रित करता है । micropipette और धारक एक micromanipulator द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं और, आदर्श रूप में, एक पीजो द्वारा एक दिशा में सटीक आंदोलन के लिए गति देनेवाला. एक नैनोट्यूब खींचने के लिए, microaspirated गुव संक्षेप में एक माइक्रोन के लिए अटक-मनका आकार तो दूर एक नैनोट्यूब बनाने खींच लिया है । इस कार्यान्वयन में, मनका ऑप्टिकल चिमटी द्वारा आयोजित किया जाता है, जो एक प्रकाशित प्रोटोकॉल का पालन करके बनाया जा सकता है²⁷. यह ऑप्टिकल चिमटी का वितरण और विभिन्न तरीकों से नैनोट्यूब खींचने के लिए संभव है, सटीक बल माप की कीमत पर हालांकि. यदि यह भी एक ऑप्टिकल जाल का निर्माण या यदि बल माप आवश्यक नहीं हैं, जैसे कि अगर एक बस घुमावदार झिल्ली के लिए प्रोटीन की वरीयता की जांच करना चाहता है चुनौतीपूर्ण है, एक ट्यूब एक दूसरी micropipette की नोक पर एक मनका aspirated का उपयोग कर निकाला जा सकता है²⁸। यह भी गुरुत्वाकर्षण बल²⁹ या प्रवाह³⁰^,³¹का उपयोग कर ट्यूबों खींचने के लिए संभव है । इसके अलावा, फोकल माइक्रोस्कोपी आवश्यक भी नहीं है; हालांकि, यह प्रोटीन की सतह घनत्व को मापने के लिए तो पसंद है । यह भी ट्यूब में लिपिड के प्रतिदीप्ति तीव्रता से नैनोट्यूब त्रिज्या को मापने की अनुमति देता है, इस प्रकार झिल्ली बल और तनाव के स्वतंत्र रूप से. प्रतिदीप्ति से ट्यूब त्रिज्या को ठीक करना विशेष रूप से महत्वपूर्ण है यदि इन मात्राओं के बीच संबंध झिल्ली-पालन प्रोटीन की उपस्थिति के कारण अच्छी तरह से स्थापित समीकरणों से विचलित²⁵। महत्वपूर्ण बात, एक दोनों ऑप्टिकल जाल और फोकल माइक्रोस्कोपी के वितरण नहीं कर सकते, क्योंकि यह ट्यूब वक्रता को मापने के लिए संभव नहीं होगा ।

विधि के रूप में इस प्रोटोकॉल में वर्णित वक्रता अध्ययन नैनोट्यूब पर विभिंन परिधीय झिल्ली प्रोटीन की छंटाई प्रेरित किया गया है, ज्यादातर बार परिवार²⁵^,^३२^,^३३^,^३४. यह भी दिखाया गया है कि शंकु के आकार का transmembrane पोटेशियम चैनल KvAP पट्टी प्रोटीन के रूप में एक ही रास्ते में घुमावदार नैनोट्यूब पर समृद्ध है^३५. GUVs के अंदर प्रोटीन encapsulate करने के लिए विधि का अनुकूलन करके, नकारात्मक वक्रता के साथ प्रोटीन की बातचीत हाल ही में अच्छी तरह से^३६की जांच की गई है । इसके अलावा, इस विधि के लिए प्रोटीन पाड़²⁵^,^३७ के गठन स्पष्ट और या तो लाइन तनाव^३८, प्रोटीन dynamin^३९, या पट्टी से झिल्ली scission के तंत्र का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है प्रोटीन्स^४०^,^४१. प्रोटीन के अलावा, छोटे अणुओं या आयनों भी वक्रता पैदा कर सकता है । इस विधि का प्रयोग, कैल्शियम आयनों के लिए नमक से सकारात्मक वक्रता प्रेरित दिखाया गया है^४२। दिलचस्प है, यह भी दिखाया गया है कि लिपिड वक्रता छँटाई से गुजरना कर सकते हैं, हालांकि केवल रचनाओं है कि एक मिश्रण बिंदु के पास हैं के लिए^४३^,^४४. संक्षेप में, विधि कैसे या तो अभिंन झिल्ली घटकों (जैसे, लिपिड या transmembrane प्रोटीन) या बाह्य रूप से बाध्यकारी अणुओं (या तो अंदर या बाहर GUVs) के साथ बातचीत की जांच में रुचि शोधकर्ताओं द्वारा इस्तेमाल किया जा सकता बेलनाकार घुमावदार झिल्ली, देखने के यांत्रिक और मात्रात्मक बिंदुओं से । यह भी झिल्ली ही²²^,²³^,^४५के यांत्रिक गुणों को मापने में रुचि रखने वालों के लिए करना है ।

Protocol

1. पीटी-तारों पर Electroformation द्वारा GUVs की तैयारी electroformation चैंबर को साफ ( परिचय और चित्र 1aदेखें) और एक कार्बनिक विलायक जैसे इथेनॉल या एसीटोन के साथ पीटी तारों को दूर करने के लिए लिपिड और पानी के ?…

Representative Results

ट्यूब-पुलिंग प्रयोग झिल्ली के बारे में महत्वपूर्ण यांत्रिक जानकारी दे सकता है । प्रोटीन या अन्य अणुओं के अभाव में है कि झिल्ली वक्रता के साथ जोड़ी, झिल्ली बल और ट्यूब त्रिज्या Canham-Helfrich Hamiltonian स?…

Discussion

GUVs से ट्यूबों खींचने की विधि झिल्ली प्रोटीन प्रणाली पर समृद्ध जानकारी देता है, क्योंकि यह न केवल करने के लिए झिल्ली के बुनियादी यांत्रिक गुणों को मापने का मतलब है, लेकिन यह प्रोटीन और झिल्ली के बीच युग्?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

लेखकों Benoit Sorre, डेमियन Cuvelier, पियरे Nassoy, फ़्रांस्वा Quemeneur, और गिल Toombes उनके आवश्यक योगदान के लिए समूह में नैनोट्यूब विधि स्थापित करने के लिए धंयवाद । पीईबी समूह CNRS कंसोर्टियम CellTiss के अंतर्गत आता है, Labex CelTisPhyBio (ANR-11-LABX0038) के लिए, और पेरिस विज्ञान एट Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02) । एफ.-सी. Tsai EMBO दीर्घकालिक फैलोशिप (ALTF 1527-2014) और मैरी क्यूरी क्रिया (H2020-MSCA-अगर-२०१४, परियोजना झिल्ली-ezrin-actin) द्वारा वित्त पोषित किया गया । M.S. यारों के शमौन सोसायटी के जूनियर फेलो हैं ।

Materials

1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DOPC)	Avanti	850375	Example lipid used in data for Figure 3
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] [DSPE-PEG(2000)-biotin]	Avanti	880129	biotinylated lipid
BODIPY-TR-C5-ceramide	Molecular Probes (ThermoFisher)	D7540	fluorescent lipid
BODIPY- FLC5-hexadecanoyl phosphatidylcholine (HPC*)	Molecular Probes (ThermoFisher)		fluorescent lipid for protein density calibration
egg L-α-phosphatidylcholine (eggPC)	Avanti	840051	used for calibrating the tube radius constant
β-casein from bovine milk (>99%)	Sigma Aldrich	C6905	used for passivating the micropipette and the experimental chamber
Sucrose	Sigma Aldrich	S7903
D(+) glucose	Sigma Aldrich	G7021
NaCl	Sigma Aldrich	S7653
Tris	Sigma Aldrich	10708976001
osmometer	Loser	n/a
Pt-wires, 0.5 mm diameter, 99.99% pure	Goodfellow USA	PT005139	used for GUV electroformation
function generator		n/a	used to create current for GUV electroformation
putty sealant	Vitrex (from CML France)	CRIT 140013	used to seal the electroformation chamber
bath sonicator		n/a	useful to clean the electroformation chamber, but not crucial
Nikon TE2000 inverted microscope, eC1 confocal system (Nikon), with two laser lines (λ = 488 nm and 543 nm); optical tweezers induced by a 5 W ytterbium fiber continuous wave laser (λ > 1070 nm; IPG GmBH Germany)			an example of a confocal microscopy system equipped with optical tweezers
micromanipulators		n/a
borosilicate capillaries (with internal and external radii of 0.78 mm and 1 mm, respectively)	Harvard apparatus	30-0036
micropipette puller	Sutter Instrument	P-2100
microforge	Narishige	MF-800
piezoelectric actuator	Physik Instrumente	n/a
polystyrene streptavidin coated beads (diameter 3.2 µm)	Spherotech	SVP-30-5

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Prévost, C., Tsai, F., Bassereau, P., Simunovic, M. Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles. J. Vis. Exp. (130), e56086, doi:10.3791/56086 (2017).