تقييم التوازن تتميز في الفئران باستخدام التحليل اللوني السائل عالي الأداء وامتصاص الدوبامين سينابتوسومال
Summary
كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء تحليل تمثل أدوات تجريبية للتحقيق التوازن الدوبامين في الفئران بعد تقييم وظيفة نقل الدوبامين ومستويات الدوبامين في نسيج سترياتال، وامتصاص الدوبامين سينابتوسومال على التوالي. نقدم هنا بروتوكولات لقياس محتوى الأنسجة الدوبامين وتقييم الأداء الوظيفي للناقل الدوبامين.
Abstract
الدوبامين (DA) ناقل عصبي مودولاتوري السيطرة على النشاط الحركي ومكافأة العمليات والوظائف المعرفية. ضعف كبيرة تتميز (دايرجيك) يرتبط ارتباطاً قويا بالعديد من الأمراض المرتبطة بالجهاز العصبي المركزي مثل مرض باركنسون، واضطراب نقص الانتباه-العجز-فرط النشاط وإدمان المخدرات1،2 ،،من34. تحديد آليات الأمراض التي تنطوي على خلل دا يتوقف بصورة حاسمة على نماذج حيوانية تحاكي جوانب الأمراض، وهكذا البروتوكولات التي تقييم أجزاء معينة من التوازن دا مهم لتقديم رؤى جديدة وممكن العلاجية أهدافا لهذه الأمراض.
هنا، نحن نقدم اثنين من البروتوكولات التجريبية مفيدة أن عند الجمع بينها وتوفر قراءة وظيفية للنظام دايرجيك في الفئران. يتم الحصول على المعلمات البيوكيميائية والوظيفية على التوازن دا من خلال تقييم مستويات دا والدوبامين وظيفة الناقل (دات)5. عند التحقيق في النظام دا، القدرة على قياس موثوق بها مستويات الذاتية دا من الدماغ الكبار أمر أساسي. ولذلك، نقدم على كيفية أداء كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء ([هبلك]) في أنسجة المخ من الفئران لتحديد مستويات التنمية. ونحن إجراء التجربة على الأنسجة من المخطط الظهرية (دستر) ونواة accumbens (NAc)، ولكن الأسلوب أيضا مناسبة للمناطق الأخرى في المخ معصب دا.
دات ضروري لامتصاص دا إلى المحطة presynaptic، وبالتالي السيطرة على النشاط الزماني والمكاني في صدر جدول أعمال التنمية. معرفة مستويات ووظائف دات في المخطط أهمية كبرى عند تقييم التوازن دا. هنا، نحن نقدم بروتوكول يسمح للاستدلال في نفس الوقت معلومات عن مستويات السطحية ودالة باستخدام مقايسة امتصاص سينابتوسومال6 دا.
توفر الأساليب الحالية جنبا إلى جنب مع البروتوكولات القياسية إيمونوبلوتينج الباحث بالأدوات ذات الصلة لوصف النظام دايرجيك.
Introduction
الدوبامين (DA) ناقل عصبي مودولاتوري حاسمة بالنسبة للسلوك الحركي والمكافأة والوظائف المعرفية1،7،،من89. الاختلالات في التوازن دا متورطة في العديد من الأمراض العصبية مثل الاهتمام-اضطراب فرط النشاط، وإدمان المخدرات والاكتئاب ومرض باركنسون1. يتم تحريرها دا من العصبية presynaptic في المشقوق متشابك، حيث يربط وينشط المستقبلات على غشاء ما قبل وبوستسينابتيك، وبالتالي زيادة نقل الإشارات. مستوى دا في المشبك بعد إطلاق سراح يسيطر دات3،10مكانياً وزمنياً. الناقل تبتلع دا من الفضاء خارج الخلية، وهكذا تحافظ على مستويات دا الفسيولوجية3،11. الأسباب الوراثية إزالة دات في الفئران من هايبردوبامينيرجيك النمط الظاهري تتميز بمستويات مرتفعة من دا متشابك، استنفاد مجمعات دا داخل الخلايا وتغيرات عميقة في دايرجيك بوستسينابتيك يشير إلى10،12.
هنا، تعرض اثنين من بروتوكولات منفصلة، أسلوب واحد لمحتوى الأنسجة التدبير دا وأخرى لتقييم الأداء الوظيفي ل dat. المجمعة مع الإنزيم بيوتينيليشن السطحية ووصف غابرييل et al.13 هذان الأسلوبان يوفر معلومات عن دا المحتوى ووظيفية مستويات دات لإجراء تقييم دقيق للتوازن دا. مع هذه الأساليب يمكن وصف التوازن دا الفئران المحورة وراثيا أو نماذج الأمراض المختلفة ووصف. تم تنفيذ هذه الأدوات والأمثل ويتم استخدام القياسية في مختبراتنا. عملت فحوصات الحالية للتحقيق في الآثار على التوازن دا لتغيير ج–المحطة الطرفية دات14 أو التعبير عن ريكومبيناسي لجنة المساواة العرقية تحت المروج تيروزين hydroxylase (TH) 5.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويصف هذه المخطوطة البروتوكولات التجريبية مفيدة لتحديد التوازن دا في أي نموذج الماوس للاختيار. نحن توفير بروتوكولات مفصلة لقياس مستويات دا في أنسجة المخ من الفئران باستخدام [هبلك]، وامتصاص دا سينابتوسومال لتقييم النقل دا الوظيفية عن طريق دات. وسيتم وضع الإجراءات والبروتوكولات وحدود للتج?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل كان يدعمه التميز برنامج عام 2016 أوكف (عنوان، أ. ر.، K.J.)، ومؤسسة Lundbeck (محمد) مركز مؤسسة Lundbeck بيوميمبرانيس في “لطب النانوي” (عنوان)، الوطني معهد للصحة منح P01 DA 12408 (عنوان)، الدانمرك مجلس للبحوث المستقلة-العلوم الطبية (عنوان).
Materials
| COMT inhibitor | Sigma Aldrich, Germany | RO-41-0960 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| [3H]-Dopamine | Perkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA | NET67-3001MC | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Glass microfiber filters | GF/C Whatman, GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire | 1822-024 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| HiSafe Scintillation fluid | Perkin Elmer | 1200-437 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| MicroBeta2 | Perkin Elmer | For synaptosomal DA uptake protocol | |
| BCA Protein Assay kit | Thermo Scientific Pierce | 23225 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| HEPES | Sigma Life Science | H3375 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Sucrose | Sigma Life Science | S7903 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| NaCl | Sigma Life Science | S3014 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| KCl | Sigma Life Science | P9541 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| CaCl2 | Merck KGaA | 10043-52-4 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| MgSO4 | Sigma Life Science | 63065 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Ascorbic Acid | Sigma Life Science | A0278 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| D-Glucose | Sigma Life Science | G7021 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Pargyline | Sigma Aldrich | P-8013 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Desipramine | Sigma Aldrich | D3900 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Dopamine | Sigma Life Science | H8502 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Cocaine | Sigma Life Science | C5776 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Brain matrix | ASI instruments | RBM2000C | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Cafano mechanical teflon disrupter | Buch & Holm | Discontinued | For synaptosomal DA uptake protocol (homogenization) |
| Antec Decade (Amperometric detector) | Antec, Leiden, The Netherlands | Discontinued: new model DECADE Elite / Lite™ Electrochemical Detector type 175 and 176 | For HPLC protocol |
| Avantec 0.22 μm glass filter | Frisenette ApS, Denmark | 13CP020AS | For HPLC protocol |
| Column: Prodigy 3 μ ODS-3 C18 | Phenomenex, YMC Europe, Chermbeck, Germany | Part Number:00A-3300-E0 | For HPLC protocol |
| LC solution software | Shimadzu | LabSolutions Series Workstation | For HPLC protocol |
| Perchlor acid 0.1M | Fluka Analytical | 35418-500ml | For HPLC protocol (Tissue preparation) |
| EDTA | Sigma | E5134-50g | For HPLC protocol |
| Natriumdihydrogenphosphar | Bie&Berntsen | 1.06346 1000g | For HPLC protocol |
| Sodium 1-octanesulfonate monohydrate | Aldrich | 74885 -10g | For HPLC protocol |
| Acetonitrile, isocratic HPLC grade | Scharlau | AC03402500 | For HPLC protocol |
| Filtre 0.22um | Frisenette ApS, Denmark | Avantec 13CP020AS | For HPLC protocol (Tissue preparation) |
| ortho-Phosphoric acid 85% | Merck | 1.00563. 1000ml | For HPLC protocol |
| Electrode | Antec, Leiden, The Netherlands | AN1161300 | For HPLC protocol (see manual online) |
| Detector program on DECADE II electrochemical detector | Antec, Leiden, The Netherlands | Lite™ Electrochemical Detector type 175 and 176 | For HPLC protocol |
References
- Tritsch, N. X., Sabatini, B. L. Dopaminergic modulation of synaptic transmission in cortex and striatum. Neuron. 76, 33-50 (2012).
- Cartier, E. A., et al. A biochemical and functional protein complex involving dopamine synthesis and transport into synaptic vesicles. J Biol Chem. 285, 1957-1966 (2010).
- Kristensen, A. S., et al. SLC6 neurotransmitter transporters: structure, function, and regulation. Pharmacol Rev. 63, 585-640 (2011).
- Gainetdinov, R. R., Caron, M. G. Monoamine transporters: from genes to behavior. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 43, 261-284 (2003).
- Runegaard, A. H., et al. Preserved dopaminergic homeostasis and dopamine-related behaviour in hemizygous TH-Cre mice. Eur J Neurosci. 45, 121-128 (2017).
- Whittaker, V. P., Michaelson, I. A., Kirkland, R. J. The separation of synaptic vesicles from nerve-ending particles (‘synaptosomes’). Biochem J. 90, 293-303 (1964).
- Hornykiewicz, O. Dopamine (3-hydroxytyramine) and brain function. Pharmacol Rev. 18, 925-964 (1966).
- Schultz, W. Behavioral dopamine signals. Trends Neurosci. 30, 203-210 (2007).
- Beaulieu, J. M., Gainetdinov, R. R. The physiology, signaling, and pharmacology of dopamine receptors. Pharmacol Rev. 63, 182-217 (2011).
- Giros, B., Jaber, M., Jones, S. R., Wightman, R. M., Caron, M. G. Hyperlocomotion and indifference to cocaine and amphetamine in mice lacking the dopamine transporter. Nature. 379, 606-612 (1996).
- Torres, G. E., Amara, S. G. Glutamate and monoamine transporters: new visions of form and function. Curr Opin Neurobiol. 17, 304-312 (2007).
- Jones, S. R., et al. Profound neuronal plasticity in response to inactivation of the dopamine transporter. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 4029-4034 (1998).
- Gabriel, L. R., Wu, S., Melikian, H. E. Brain slice biotinylation: an ex vivo approach to measure region-specific plasma membrane protein trafficking in adult neurons. J Vis Exp. , (2014).
- Rickhag, M., et al. A C-terminal PDZ domain-binding sequence is required for striatal distribution of the dopamine transporter. Nat Commun. 4, 1580 (2013).
- Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes. Nat Protoc. 3, 1718-1728 (2008).
- Whittaker, V. P. Thirty years of synaptosome research. J Neurocytol. 22, 735-742 (1993).
- Schmitz, Y., Benoit-Marand, M., Gonon, F., Sulzer, D. Presynaptic regulation of dopaminergic neurotransmission. J Neurochem. 87, 273-289 (2003).
- Yang, L., Beal, M. F. Determination of neurotransmitter levels in models of Parkinson’s disease by HPLC-ECD. Methods Mol Biol. 793, 401-415 (2011).
- Earles, C., Schenk, J. O. Rotating disk electrode voltammetric measurements of dopamine transporter activity: an analytical evaluation. Anal Biochem. 264, 191-198 (1998).
- Wu, Q., Reith, M. E., Kuhar, M. J., Carroll, F. I., Garris, P. A. Preferential increases in nucleus accumbens dopamine after systemic cocaine administration are caused by unique characteristics of dopamine neurotransmission. J Neurosci. 21, 6338-6347 (2001).
- Schonfuss, D., Reum, T., Olshausen, P., Fischer, T., Morgenstern, R. Modelling constant potential amperometry for investigations of dopaminergic neurotransmission kinetics in vivo. J Neurosci Methods. 112, 163-172 (2001).
- Hoover, B. R., Everett, C. V., Sorkin, A., Zahniser, N. R. Rapid regulation of dopamine transporters by tyrosine kinases in rat neuronal preparations. J Neurochem. 101, 1258-1271 (2007).
- Hansen, F. H., et al. Missense dopamine transporter mutations associate with adult parkinsonism and ADHD. J Clin Invest. 124, 3107-3120 (2014).
- Damier, P., Hirsch, E. C., Agid, Y., Graybiel, A. M. The substantia nigra of the human brain. II. Patterns of loss of dopamine-containing neurons in Parkinson’s disease. Brain. 122 (Pt 8), 1437-1448 (1999).
- Atack, C. V. The determination of dopamine by a modification of the dihydroxyindole fluorimetric assay. Br J Pharmacol. 48, 699-714 (1973).
- Yoshitake, T., et al. High-sensitive liquid chromatographic method for determination of neuronal release of serotonin, noradrenaline and dopamine monitored by microdialysis in the rat prefrontal cortex. J Neurosci Methods. 140, 163-168 (2004).
- Decressac, M., Mattsson, B., Lundblad, M., Weikop, P., Bjorklund, A. Progressive neurodegenerative and behavioural changes induced by AAV-mediated overexpression of alpha-synuclein in midbrain dopamine neurons. Neurobiol Dis. 45, 939-953 (2012).
- Huot, P., Johnston, T. H., Koprich, J. B., Fox, S. H., Brotchie, J. M. L-DOPA pharmacokinetics in the MPTP-lesioned macaque model of Parkinson’s disease. Neuropharmacology. 63, 829-836 (2012).
- Mikkelsen, M., et al. MPTP-induced Parkinsonism in minipigs: A behavioral, biochemical, and histological study. Neurotoxicol Teratol. 21, 169-175 (1999).
- Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Dempsey, C., Fields, V. Comprehensive profiling of dopamine regulation in substantia nigra and ventral tegmental area. J Vis Exp. , (2012).
- Van Dam, D., et al. Regional distribution of biogenic amines, amino acids and cholinergic markers in the CNS of the C57BL/6 strain. Amino Acids. 28, 377-387 (2005).
- Barth, C., Villringer, A., Sacher, J. Sex hormones affect neurotransmitters and shape the adult female brain during hormonal transition periods. Front Neurosci. 9 (37), (2015).
- Corthell, J. T., Stathopoulos, A. M., Watson, C. C., Bertram, R., Trombley, P. Q. Olfactory bulb monoamine concentrations vary with time of day. Neuroscience. 247, 234-241 (2013).
- Zhuang, X., et al. Hyperactivity and impaired response habituation in hyperdopaminergic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 1982-1987 (2001).
- Ungerstedt, U., Pycock, C. Functional correlates of dopamine neurotransmission. Bull Schweiz Akad Med Wiss. 30, 44-55 (1974).
- Wickham, R. J., Park, J., Nunes, E. J., Addy, N. A. Examination of Rapid Dopamine Dynamics with Fast Scan Cyclic Voltammetry During Intra-oral Tastant Administration in Awake Rats. J Vis Exp. , e52468 (2015).
- Phillips, P. E., Robinson, D. L., Stuber, G. D., Carelli, R. M., Wightman, R. M. Real-time measurements of phasic changes in extracellular dopamine concentration in freely moving rats by fast-scan cyclic voltammetry. Methods Mol Med. 79, 443-464 (2003).
- Callaghan, P. D., Irvine, R. J., Daws, L. C. Differences in the in vivo dynamics of neurotransmitter release and serotonin uptake after acute para-methoxyamphetamine and 3,4-methylenedioxymethamphetamine revealed by chronoamperometry. Neurochem Int. 47, 350-361 (2005).
