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Neuroscience

고성능 액체 크로마토그래피 분석 및 Synaptosomal 도파민 통풍 관의 사용에 의해 쥐에서 Dopaminergic 항상성의 평가

Published: September 21, 2017
doi:
10.3791/56093
, , , ,
1Molecular Neuropharmacology and Genetics Laboratory, Lundbeck Foundation Center for Biomembranes in Nanomedicine, Department of Neuroscience and Pharmacology, Faculty of Health and Medical Sciences,University of Copenhagen, 2Laboratory of Neuropsychiatry, Psychiatric Center Copenhagen and Department of Neuroscience and Pharmacology,University of Copenhagen

Summary

Synaptosomal 도파민 통풍 관 및 고성능 액체 크로마토그래피 분석 대표 실험 도구 마우스에서 도파민 항상성 도파민 운송업 자의 기능과 striatal 조직에서 도파민의 수준을 평가 하 여 조사를 각각. 여기 선물이 도파민 조직 콘텐츠를 측정 하 고 도파민 운송업 자의 기능을 평가 하는 프로토콜.

Abstract

도파민 (DA) 모터 활동, 보상 프로세스 및 인지 기능 modulatory 신경 전달 물질 이다. (DAergic) dopaminergic neurotransmission의 장애는 파 킨 슨 병, 주의 결핍 과잉 행동 장애, 약물 중독1,2 등 여러 중앙 신경 관련 질병에 강하게 연관 ,,34. 다 불균형과 관련 된 질병 메커니즘을 묘사 동물 모델 모방은 질병의 측면을 비판적으로 의존 이며 따라서 다 항상성의 특정 부분을 평가 하는 프로토콜 소설 통찰력 및 가능한 치료를 제공 하는 것이 중요 이 질병의 대상

여기, 선물이 두 유용한 실험 프로토콜을 결합 하는 때 쥐에 DAergic 시스템의 기능 읽기 제공. 생 화 학적 및 기능 매개 변수 다 항상성에 다 수준 및 도파민 운송업 자 (DAT) 기능5의 평가 통해 얻을 수 있습니다. 다 시스템을 조사할 때 안정적으로 성인 두뇌에서 다의 내 생 레벨을 측정 하는 능력은 필수적입니다. 따라서,에 우리가 현재 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 수행 하는 방법을 뇌 조직 검사의 수준을 결정 하는 마우스에서 우리 지가 (dStr) 및 핵 accumbens (NAc), 조직에는 실험을 수행 하지만 방법은 다른 다 innervated 뇌 영역에 대 한 적합도.

출시 검사의 시간적 및 공간적 활동 제어할 DAT 연 접 맨끝에 다의 재흡수를 위해 근본적 이다 레벨과가에서 DAT의 기능을 알면 다 항상성 평가할 때 주요 중요성의 이다. 여기, 우리는 동시에 표면 수준 및 synaptosomal6 다 이해 분석 결과 사용 하 여 함수에 대 한 정보를 추론할 수 있는 프로토콜을 제공 합니다.

표준 immunoblotting 프로토콜와 결합 하는 현재 메서드 DAergic 시스템 특성 관련 도구와 연구원을 제공 합니다.

Introduction

도파민 (DA) modulatory 모터 행동, 보상 및 인지 기능1,7,,89에 대 한 중요 한 신경 이다. 다 항상성 불균형 주의-결핍 과잉 행동 장애, 약물 중독, 우울증과 파 킨 슨 병1등 여러 가지 정신병 질병에 연루 된다. 다 연 접 신경에서 시 냅 스 갈라진 틈, 어디 그것에 바인딩하고 사전 및 postsynaptic 막에 수용 체를 활성화에 신호를 전달 하는 그로 인하여 더 발표입니다. 출시 후 시 냅 스에 다의 수준은 공간적으로 일시적으로 제어 DAT3,10. 전송 sequesters 세포 외 공간에서 다 하 고 따라서 생리 다 레벨3,11을 격려. 쥐에 있는 DAT의 유전 제거는 hyperdopaminergic 형 수준에 의해 상승 된 시 냅 스 다, 특징 고갈의 세포내 다 풀 심오한 postsynaptic DAergic10,12신호 발생 합니다.

여기, 두 개의 별도 프로토콜 제시, 측정 다 조직 콘텐츠 및 가브리엘 외.13 에 의해 설명 된 표면 biotinylation 분석 결과 함께 결합 된 DAT.의 기능을 평가 하기 위해 또 다른 한 가지 방법은이 두 가지 방법 다에 정보를 제공 콘텐츠 및 기능 수준 DAT의 다 항상성의 철저 한 평가 대 한. 이러한 방법으로 다양 한 유전자 변형 쥐 또는 질병 모델의 다 항상성 특징 고 설명 될 수 있습니다. 이러한 도구 구현 및 최적화 된 우리의 실험실에서 표준 사용. 현재 분석 실험의 DAT14 의 C-터미널 변경 또는 티로신 hydroxylase (TH) 발기인 5아래 Cre recombinase 표현 다 항상성에 결과 조사 하 봉사 했다.

Protocol

덴마크 동물 실험 검사자의 지침 (허가 번호: 2017-15-0201-01160) 그 뒤를 이었다는 로컬 동물 복지의 감독 하에 완전히 AAALAC 공인 시설에서 실험 수행 위원회. 1. synaptosomal 도파민 글귀 (방법 1) 참고:이 프로토콜 두 두뇌의 병렬 평가 하지만에서 4 개의 두뇌를 가진 synaptosomal 다 이해 실험 수행을 성공적으로 사용 될 수 있습니다 병렬. 준비</strong…

Representative Results

현재 다 글귀 프로토콜 (그림 1) DAT의 쥐에서 synaptosomes의 기능을 평가 하는 데 필요한 모든 단계를 포함 합니다. 다 이해 방법 (그림 2)의 대표적인 데이터 조정 되지 않은 데이터 (그림 2B)와 함께 포화 곡선을 묘사 하 고 데이터 (그림 2A)을 조정. 채도 커브는 야생 타입 마우스에서 통?…

Discussion

이 원고는 선택의 어떤 마우스 모델에서 다 항상성 윤곽을 그리 다 유용한 실험 프로토콜을 설명 합니다. DAT. 통해 다 전송 기능을 평가 하기 위해 HPLC 및 synaptosomal 다 이해를 사용 하 여 쥐에서 뇌 조직에서 다의 측정 수준에 대 한 자세한 프로토콜 제공 절차, 프로토콜 및 HPLC 실험 synaptosomal 다 이해 분석 결과 대 한 제한 아래 정교 합니다.

Synaptosomal 통풍 관 프로토콜 표면 bioti…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 UCPH 2016 프로그램의 우수성 (U.G., 아칸소, 대리)에 의해 지원 되었다, Lundbeck 재단 (M.R.) Lundbeck 재단 센터 Biomembranes에서 Nanomedicine (U.G.), 국립 연구소의 건강 보조금 P01 DA 12408 (U.G.), 덴마크 독립적인 연구-의료 과학 (U.G.)를 위한 위원회.

Materials

COMT inhibitor Sigma Aldrich, Germany RO-41-0960 For synaptosomal DA uptake protocol
[3H]-Dopamine Perkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA NET67-3001MC For synaptosomal DA uptake protocol
Glass microfiber filters GF/C Whatman, GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire 1822-024 For synaptosomal DA uptake protocol
HiSafe Scintillation fluid Perkin Elmer 1200-437 For synaptosomal DA uptake protocol
MicroBeta2 Perkin Elmer For synaptosomal DA uptake protocol
BCA Protein Assay kit Thermo Scientific Pierce 23225 For synaptosomal DA uptake protocol
HEPES Sigma Life Science H3375 For synaptosomal DA uptake protocol
Sucrose Sigma Life Science S7903 For synaptosomal DA uptake protocol
NaCl Sigma Life Science S3014 For synaptosomal DA uptake protocol
KCl Sigma Life Science P9541 For synaptosomal DA uptake protocol
CaCl2 Merck KGaA 10043-52-4 For synaptosomal DA uptake protocol
MgSO4 Sigma Life Science 63065 For synaptosomal DA uptake protocol
Ascorbic Acid Sigma Life Science A0278 For synaptosomal DA uptake protocol
D-Glucose Sigma Life Science G7021 For synaptosomal DA uptake protocol
Pargyline Sigma Aldrich P-8013 For synaptosomal DA uptake protocol
Desipramine Sigma Aldrich D3900 For synaptosomal DA uptake protocol
Dopamine Sigma Life Science H8502 For synaptosomal DA uptake protocol
Cocaine Sigma Life Science C5776 For synaptosomal DA uptake protocol
Brain matrix ASI instruments RBM2000C For synaptosomal DA uptake protocol
Cafano mechanical teflon disrupter Buch & Holm Discontinued For synaptosomal DA uptake protocol (homogenization)
Antec Decade (Amperometric detector) Antec, Leiden, The Netherlands Discontinued: new model DECADE Elite / Lite™ Electrochemical Detector type 175 and 176 For HPLC protocol
Avantec 0.22 μm glass filter Frisenette ApS, Denmark 13CP020AS For HPLC protocol
Column: Prodigy 3 μ ODS-3 C18 Phenomenex, YMC Europe, Chermbeck, Germany Part Number:00A-3300-E0 For HPLC protocol
LC solution software Shimadzu LabSolutions Series Workstation For HPLC protocol
Perchlor acid 0.1M Fluka Analytical 35418-500ml For HPLC protocol (Tissue preparation)
EDTA Sigma E5134-50g For HPLC protocol
Natriumdihydrogenphosphar Bie&Berntsen 1.06346 1000g For HPLC protocol
Sodium 1-octanesulfonate monohydrate Aldrich 74885 -10g For HPLC protocol
Acetonitrile, isocratic HPLC grade Scharlau AC03402500 For HPLC protocol
Filtre 0.22um Frisenette ApS, Denmark Avantec 13CP020AS For HPLC protocol (Tissue preparation)
ortho-Phosphoric acid 85% Merck 1.00563. 1000ml For HPLC protocol
Electrode Antec, Leiden, The Netherlands AN1161300 For HPLC protocol (see manual online)
Detector program on DECADE II electrochemical detector Antec, Leiden, The Netherlands Lite™ Electrochemical Detector type 175 and 176 For HPLC protocol
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References

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Keywords: DopamineDopamine TransporterHPLCSynaptosomal Dopamine UptakeDopamine HomeostasisIn Vivo ManipulationBrain DissectionSynaptosome PreparationDopamine Uptake Assay
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Jensen, K. L., Runegaard, A. H., Weikop, P., Gether, U., Rickhag, M. Assessment of Dopaminergic Homeostasis in Mice by Use of High-performance Liquid Chromatography Analysis and Synaptosomal Dopamine Uptake. J. Vis. Exp. (127), e56093, doi:10.3791/56093 (2017).
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