Synaptosomal डोपामाइन तेज और उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी विश्लेषण striatal ऊतक में डोपामाइन ट्रांसपोर्टर और डोपामाइन के स्तर के समारोह का आकलन करके चूहों में डोपामाइन homeostasis की जांच करने के लिए प्रयोगात्मक उपकरणों का प्रतिनिधित्व करते हैं, क्रमश. यहाँ हम डोपामाइन ऊतक सामग्री को मापने और डोपामाइन ट्रांसपोर्टर की कार्यक्षमता का आकलन करने के लिए प्रोटोकॉल मौजूद.
डोपामाइन (डीए) एक modulatory न्यूरोट्रांसमीटर मोटर गतिविधि को नियंत्रित करने, इनाम प्रक्रियाओं और संज्ञानात्मक समारोह है. dopaminergic की हानि (DAergic) neurotransmission दृढ़ता से कई केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के साथ जुड़ा हुआ है-पार्किंसंस रोग, ध्यान घाटे-सक्रियता विकार और मादक पदार्थों की लत के रूप में जुड़े रोगों1,2 ,3,4. Delineating रोग दा असंतुलन को शामिल तंत्र गंभीर रूप से बीमारियों के पहलुओं की नकल करने के लिए पशु मॉडलों पर निर्भर है, और इस प्रकार प्रोटोकॉल है कि डीए homeostasis के विशिष्ट भागों का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण है उपंयास अंतर्दृष्टि और संभव चिकित्सकीय प्रदान इन रोगों के लिए लक्ष्य ।
यहां, हम दो उपयोगी प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल है कि जब संयुक्त एक कार्यात्मक पढ़ने के चूहों में DAergic प्रणाली के बाहर प्रदान प्रस्तुत करते हैं । दा homeostasis पर जैव रासायनिक और कार्यात्मक मापदंडों दा स्तर और डोपामाइन ट्रांसपोर्टर (DAT) की कार्यक्षमता5के आकलन के माध्यम से प्राप्त कर रहे हैं । जब डीए प्रणाली की जांच करने की क्षमता को मज़बूती से वयस्क मस्तिष्क से दा के अंतर्जात स्तर को मापने के लिए आवश्यक है । इसलिए, हम वर्तमान कैसे चूहों से मस्तिष्क ऊतक पर उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) प्रदर्शन करने के लिए दा के स्तर का निर्धारण करने के लिए । हम पृष्ठीय striatum (dStr) और नाभिक accumbens (एनएसी) से ऊतक पर प्रयोग करते हैं, लेकिन विधि भी अन्य दा-innervated मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए उपयुक्त है.
DAT presynaptic टर्मिनल में डीए की reuptake के लिए आवश्यक है, जिससे जारी डा के लौकिक और स्थानिक गतिविधि को नियंत्रित । striatum में DAT के स्तर और कार्यशीलता को जानने के प्रमुख महत्व का है जब डीए homeostasis का आकलन । यहां, हम एक प्रोटोकॉल है कि एक साथ सतह के स्तर और एक synaptosomal6 डीए का उपयोग परख का प्रयोग समारोह के बारे में जानकारी निकालना की अनुमति देता है प्रदान करते हैं ।
वर्तमान मानक immunoblotting प्रोटोकॉल के साथ संयुक्त तरीके प्रासंगिक उपकरण के साथ शोधकर्ता प्रदान करने के लिए DAergic प्रणाली की विशेषता ।
डोपामाइन (डीए) मोटर व्यवहार, इनाम और संज्ञानात्मक समारोह1,7,8,9के लिए एक modulatory न्यूरोट्रांसमीटर महत्वपूर्ण है । डीए homeostasis में असंतुलन कई neuropsychiatric रोगों में फंसाया जाता है जैसे ध्यान घाटे सक्रियता विकार, मादक पदार्थों की लत, अवसाद और पार्किंसंस रोग1। दा presynaptic ंयूरॉन से synaptic फांक में जारी है, जहां यह बांधता है और पूर्व और postsynaptic झिल्ली पर रिसेप्टर्स सक्रिय करता है, जिससे आगे संकेत संदेश । रिहाई के बाद synapse में डीए का स्तर स्थानिक और अस्थाई DAT द्वारा नियंत्रित है3,10। ट्रांसपोर्टर sequesters extracellular अंतरिक्ष से डा, और इस प्रकार शारीरिक दा स्तर3,11बनाए । चूहों में DAT के आनुवंशिक हटाने एक hyperdopaminergic phenotype ऊंचा synaptic दा स्तर, intracellular दा पूल और postsynaptic DAergic संकेत में गहन परिवर्तन की कमी की विशेषता का कारण बनता है10,12.
यहां, दो अलग प्रोटोकॉल प्रस्तुत कर रहे हैं, एक विधि दा ऊतक सामग्री को मापने के लिए और एक और DAT की कार्यक्षमता का आकलन करने के लिए । सतह biotinylation गेब्रियल एट अल द्वारा वर्णित परख के साथ संयुक्त ।13 इन दो विधियों दा पर जानकारी प्रदान दा homeostasis के एक गहन आकलन के लिए DAT की सामग्री और कार्यात्मक स्तर । इन तरीकों के साथ दा homeostasis विभिन्न ट्रांसजेनिक चूहों या रोग मॉडल की विशेषता और वर्णन किया जा सकता है. इन उपकरणों को लागू किया गया है और अनुकूलित और हमारी प्रयोगशालाओं में मानक का उपयोग कर रहे हैं । वर्तमान परख सी DAT14 या tyrosine hydroxylase (गु) प्रमोटर 5के तहत Cre recombinase व्यक्त की सी टर्मिनल में फेरबदल के डीए homeostasis पर परिणाम की जांच करने के लिए कार्य किया है ।
डेनिश पशु प्रयोग निरीक्षणालय के दिशानिर्देश (अनुमति संख्या: 2017-15-0201-01160) का पालन किया गया था और एक स्थानीय पशु कल्याण की देखरेख में एक पूरी तरह से AAALAC मान्यता प्राप्त सुविधा में प्रदर्शन किया प्रयोगों समि?…
यह पांडुलिपि पसंद के किसी भी माउस मॉडल में चित्रित दा homeostasis के लिए उपयोगी प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का वर्णन है । हम DAT के माध्यम से कार्यात्मक डीए परिवहन का आकलन करने के लिए HPLC और synaptosomal दा के साथ का उपयोग कर चूह…
The authors have nothing to disclose.
यह काम उत्कृष्टता के UCPH २०१६ कार्यक्रम (U.G., A.R., K.J.), Lundbeck फाउंडेशन (यूननट) Lundbeck में Nanomedicine फाउंडेशन केंद्र (U.G.), राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान संस्थान P01 डीए १२४०८ (U.G.), के डेनमार्क द्वारा समर्थित किया गया काउंसिल फॉर इंडिपेंडेंट रिसर्च-मेडिकल साइंसेज (U.G.) ।
COMT inhibitor | Sigma Aldrich, Germany | RO-41-0960 | For synaptosomal DA uptake protocol |
[3H]-Dopamine | Perkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA | NET67-3001MC | For synaptosomal DA uptake protocol |
Glass microfiber filters | GF/C Whatman, GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire | 1822-024 | For synaptosomal DA uptake protocol |
HiSafe Scintillation fluid | Perkin Elmer | 1200-437 | For synaptosomal DA uptake protocol |
MicroBeta2 | Perkin Elmer | For synaptosomal DA uptake protocol | |
BCA Protein Assay kit | Thermo Scientific Pierce | 23225 | For synaptosomal DA uptake protocol |
HEPES | Sigma Life Science | H3375 | For synaptosomal DA uptake protocol |
Sucrose | Sigma Life Science | S7903 | For synaptosomal DA uptake protocol |
NaCl | Sigma Life Science | S3014 | For synaptosomal DA uptake protocol |
KCl | Sigma Life Science | P9541 | For synaptosomal DA uptake protocol |
CaCl2 | Merck KGaA | 10043-52-4 | For synaptosomal DA uptake protocol |
MgSO4 | Sigma Life Science | 63065 | For synaptosomal DA uptake protocol |
Ascorbic Acid | Sigma Life Science | A0278 | For synaptosomal DA uptake protocol |
D-Glucose | Sigma Life Science | G7021 | For synaptosomal DA uptake protocol |
Pargyline | Sigma Aldrich | P-8013 | For synaptosomal DA uptake protocol |
Desipramine | Sigma Aldrich | D3900 | For synaptosomal DA uptake protocol |
Dopamine | Sigma Life Science | H8502 | For synaptosomal DA uptake protocol |
Cocaine | Sigma Life Science | C5776 | For synaptosomal DA uptake protocol |
Brain matrix | ASI instruments | RBM2000C | For synaptosomal DA uptake protocol |
Cafano mechanical teflon disrupter | Buch & Holm | Discontinued | For synaptosomal DA uptake protocol (homogenization) |
Antec Decade (Amperometric detector) | Antec, Leiden, The Netherlands | Discontinued: new model DECADE Elite / Lite™ Electrochemical Detector type 175 and 176 | For HPLC protocol |
Avantec 0.22 μm glass filter | Frisenette ApS, Denmark | 13CP020AS | For HPLC protocol |
Column: Prodigy 3 μ ODS-3 C18 | Phenomenex, YMC Europe, Chermbeck, Germany | Part Number:00A-3300-E0 | For HPLC protocol |
LC solution software | Shimadzu | LabSolutions Series Workstation | For HPLC protocol |
Perchlor acid 0.1M | Fluka Analytical | 35418-500ml | For HPLC protocol (Tissue preparation) |
EDTA | Sigma | E5134-50g | For HPLC protocol |
Natriumdihydrogenphosphar | Bie&Berntsen | 1.06346 1000g | For HPLC protocol |
Sodium 1-octanesulfonate monohydrate | Aldrich | 74885 -10g | For HPLC protocol |
Acetonitrile, isocratic HPLC grade | Scharlau | AC03402500 | For HPLC protocol |
Filtre 0.22um | Frisenette ApS, Denmark | Avantec 13CP020AS | For HPLC protocol (Tissue preparation) |
ortho-Phosphoric acid 85% | Merck | 1.00563. 1000ml | For HPLC protocol |
Electrode | Antec, Leiden, The Netherlands | AN1161300 | For HPLC protocol (see manual online) |
Detector program on DECADE II electrochemical detector | Antec, Leiden, The Netherlands | Lite™ Electrochemical Detector type 175 and 176 | For HPLC protocol |