使用唾液酸多糖微阵列测定在人血清中分析抗Neu5Gc IgG
Summary
可以使用sialoglycan微阵列测定来评估人血清中的抗Neu5Gc抗体，使其成为癌症和其他慢性炎症介导的人类疾病的潜在的高通量诊断测定。
Abstract
细胞覆盖着通常在癌症中被改变并包括唾液酸（Sia）表达变化的碳水化合物链（聚糖）的斗篷。这些是具有9碳骨架并且在细胞表面上覆盖脊椎动物聚糖的酸性糖。哺乳动物中主要的Sia形式中的两种是N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）及其羟基化形式， N-乙酰神经氨酸（Neu5Gc）。由于编码胞苷5'-单磷酸-Neu5Ac（CMP-Neu5Ac）羟化酶（CMAH）的基因失活，人类不能产生内源性Neu5Gc。外源Neu5Gc由人类细胞通过红肉和乳制品的饮食消耗而获得，随后出现在细胞表面的多种聚糖上，主要集中在癌上。因此，人类具有循环的抗Neu5Gc抗体，其在癌症和其他慢性炎症介导的疾病中起着不同的作用，并且正在成为潜在的诊断和治疗rgets。在这里，我们描述了一种高通量sialoglycan微阵列测定法来评估人血清中的这种抗Neu5Gc抗体。含有Neu5Gc的聚糖及其配对的对照（含Neu5Ac的聚糖），每个具有核心伯胺，共价连接到环氧树脂涂布的玻璃片上。我们举例说明了使用特定的纳米打印机，可以以16孔格式打印56张幻灯片，每台打印机最多可生成896个阵列。每张幻灯片可用于筛选16种不同的人血清样品，以评估抗Neu5Gc抗体的特异性，强度和多样性。该协议描述了这种强大的工具的复杂性，并提供了一个基本准则，旨在探讨在阵列格式的不同临床样品中对Neu5Gc膳食碳水化合物抗原的反应。
Introduction
Sias是覆盖细胞表面糖蛋白上的聚糖链和脊椎动物中糖脂的酸性糖。 SIA表达在癌细胞1改性，并与进展和/或转移2,3相关。哺乳动物中主要的Sia形式的两种是Neu5Ac及其羟基化形式Neu5Gc 2 。由于编码CMAH酶的基因的特异性失活，人类不能合成Neu5Gc。这种非人的新航代谢合并到人体细胞的“自我”，从富含膳食中Neu5Gc的食物（ 如红肉）始发4,5。 Neu5Gc在人上皮细胞和内皮细胞表面的低水平存在，但特别积累在癌中。 Neu5Gc被人体液免疫系统2认为是外来的， 6 。Neu5Gc-聚糖的抗原性复杂性可能出现在多个水平，包括Neu5Gc修饰，连锁，底层聚糖和支架及其密度，都反映在人类6抗体Neu5Gc抗体的复杂性6 。一些抗体作为癌生物标志物和潜在的免疫治疗7。不同sialoglycans 8的酶法合成的到来铺平了道路这样的抗体的更深入的分析，通过使用聚糖微阵列技术9,10容易。因此，具有天然和合成碳水化合物的大文库的制备容易和操纵，聚糖微阵列已经成为一个强大的高通量技术用于研究与生物分子10，11的无数的碳水化合物的相互作用， </sup> 12，13。以阵列形式，使用最少量的材料，并且生物相关聚糖的这种多重显示允许在单个实验中调查数千个结合相互作用。重要的是，这种技术也可以应用于生物标志物发现以及各种样品7中，12监测免疫应答。
成功的聚糖微阵列制造需要考虑三个重要方面：打印机器人类型，聚糖共轭化学和检测光学。关于印刷仪器的考虑，有两种技术可供选择：联系和非接触式打印机。在接触印刷中，将1-48个钢针浸入含有聚糖溶液的多孔源板中，并通过直接接触玻璃载片表面而在功能化玻璃载片上点样。溶液量活动到幻灯片是滑动表面上持续时间的函数。通常，样品首先在玻璃块上预先点样（达到同质点），然后再将其印刷在载玻片上。在非接触式打印机（ 例如，压电式打印机）中，使用受控电信号从玻璃毛细管印刷聚糖。可以对电信号进行精细校准，以实现相对于接触印刷的更精确的印刷。斑点的大小和形态也相对更均匀。另外的优点是在打印后将样品回收到源极板。然而，压电式打印机的主要缺点是打印头限制（4或8），导致打印时间非常长，需要特别注意滑动稳定性，温度，湿度和样品蒸发。非接触喷墨打印机需要更大的样品体积14 。
<p class =“jove_content”>与印刷方法的有限可用选项相反，聚糖缀合化学是一个更复杂的考虑因素，有许多选择可供选择。选择的固定化学必须考虑聚糖上的活性基团和载玻片表面的反应性。要固定在特定微阵列表面上的合成或天然分离的聚糖都需要相同的反应性基团。此外，聚糖需要是纯的和均一的。另一方面，固定化表面和化学应提供重复性和可靠的附着密度。多种固定化方法已经开发了共价或非共价的（物理吸收）附件10，11，12，13。关于印刷聚糖微阵列技术的非常详细的信息ð调查，把这些优秀回顾13，15。重要的是，最近提供的一个糖尿病实验最低限度信息（MIRAGE）计划描述了样品制备的准则16，并报告了聚糖微阵列分析17的数据，以提高这一增长领域的标准。在这里，我们描述了使用16孔格式的特定接触式纳米打印机制造sialoglycan微阵列的详细协议。每个聚糖具有介导它们与环氧基活化玻璃载片的共价键的伯胺。我们还描述了使用各种人血清样品，抗体和Sia结合植物凝集素的一个载玻片的开发和分析。 Sialoglycan微阵列测定涉及几个主要步骤，包括阵列制造，加工，开发和分析。阵列制造需要规划射线布局，制备聚糖和源极板，编程纳米打印机和打印幻灯片。随后，对载玻片进行处理，显影和分析（ 图1 ）。
Protocol
Representative Results
Discussion
成功的聚糖微阵列制造需要仔细的规划，并包括协议中的几个重要步骤。这些包括：（1）规划定义所有后续参数（ 例如距离，间距，样品量和打印）的块和板布局; （2）清洁引脚并确保引脚的完整性，这对于控制点均匀性至关重要; （3）在印刷过程中保持高湿度，在长时间打印运行期间避免样品蒸发至关重要，这可能损害光斑均匀性; （4）选择正确的对齐和分析参数，这可以影响结果（ <…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作部分得到以色列癌症研究基金研究职业发展奖的支持，以色列国家纳米技术计划和赫尔姆斯利慈善信托基金会为个人化支持纳米医学（VP-K）和国家卫生署授予R01GM076360（至XC）。
Materials
| Primary-amine containing sialoglycans | Glycohub, Inc., Davis, CA, USA (http://www.glycohub.com/services) | Contact info@glycohubusa.com for compound requests | Printed glycans |
| Monosodium phosphate monohydrate | Sigma | S9638 | Printing buffer component |
| Disodium phosphate heptahydrate | Sigma | S9390 | Printing buffer component |
| Phosphate buffered saline | Hy-Labs | BP-507/500D | Printing buffer/ incubation/washing buffer |
| Tris-base | Sigma | T1503 | Slide blocking reagent |
| Glycerol | Sigma | G-7893 | Printing buffer component |
| Ethanolamine | Thermo-Fisher Scientific | 0700/08 | Slide blocking reagent |
| Ovalbumin (Grade V) | Sigma | A5503 | Slide Blocking protein |
| Tween-20 | Sigma | P7949 | Slide washing detergent |
| Alexa 555-Hydrazide | Thermo-Fisher Scientific | A20501MP | Marker on array |
| ChromPure Human IgG, whole molecule | Jackson Immunoresearch | 009-000-003 | Printing component |
| Biotinylated- SNA | Vector Laboratories | B-1305 | Plant Lectin – binding Sia-alpha2–6-linked |
| Biotinylated-MALII | Vector Laboratories | B-1265 | Plant Lectin – binding Sia-alpha2–3-linked |
| Chicken-anti Neu5Gc IgY | BioLegend | 146903 | Primary detection |
| Cy3-Streptavidin | Jackson Immunoresearch | 016-160-0848 | Biotin binding |
| Cy3-anti Human IgG | Jackson Immunoresearch | 109-165-088 | Secondary detection against human IgG |
| Cy3-anti Chicken IgY | Jackson Immunoresearch | 703-165-155 | Secondary detection against chicken IgY |
| Human sera samples | Israeli Blood Bank | Primary detection | |
| Compressed Nitrogen (Grade 5) | General dusting/drying tool | ||
| Epoxy-coated slides | Corning | 40044 | Slides |
| Epoxy-coated slides | PolyAn | 2D 104-00-221 | Slides. In this type of slides the surface is more hydrophobic (compared to Coring slides) therefore the glycans Print Buffer would need to be supplemented with 0.005% Tween-20 to obtain 100 µm size spots. |
| 384-well microtiter plate | Genetix | 2070 | Printing plate |
| VWR lab marker | VWR | 52877-310 | Slide labeling |
| Staining Tube | ArrayIt | MST | Slide developing tool |
| Staining bath | VWR | 25608-904 | Slide developing tool |
| Slides glass holders | VWR | 631-9321 | Slide developing tool |
| GenePix Scanner | Molecular devices | 4000B | Slide scanner |
| LM-60 NanoPrinter | ArrayIt | LM-60 | Array printer |
| Pins | ArrayIt | 946MP3 | Printing pins |
| ProPlate Module | Grace Bio-Labs | P37004 | Slide developing module |
| Distilled water | Bio-Lab | 2321020500 | Required for arrayer and humidifier |
| Electronic Multi Pippete, 8 Channel , volume range 2-125 μL | Thermo-Fisher Scientific (Matrix) | MA-2131 Impact2 Equalizer 384 | Multi pippete for sample dispansing into 384-well plate |
References
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