Anti-Neu5Gc IgG'yi İnsan Sera'sında Sialoglikan Mikroarray Testi ile Görüntüleme
Summary
İnsan serasındaki anti-Neu5Gc antikorlarını değerlendirmek için bir siyaloglikan mikroarray testi kullanılabilir, böylece kanser ve diğer kronik enflamasyon aracılı insan hastalıkları için yüksek verimli bir tanı testi haline getirilir.
Abstract
Hücreler, kanserde yaygın şekilde değişen ve sialik asit (Sia) ifadesinde değişiklikler içeren karbonhidrat zincirleri (glikanlar) paketi ile kaplıdır. Bunlar, 9-karbon omurgasına sahip olan ve hücre yüzeylerinde omurgalı glıkanları kaplayan asidik şekerlerdir. Memelilerin başlıca Sia formlarından ikisi N- asetilnöraminik asit (Neu5Ac) ve onun hidroksillenmiş formu, N- glikolilneuraminik asit (Neu5Gc) 'dir. İnsanlar, sitidin 5'monofosfat-Neu5Ac (CMP-Neu5Ac) hidroksilaz (CMAH) kodlayan genin inaktivasyonu nedeniyle endojen Neu5Gc üretemez. Yabancı Neu5Gc, kırmızı et ve sütten besin tüketimi yoluyla insan hücreleri tarafından edinilir ve ardından çoğunlukla karsinomalar üzerine biriken hücre yüzeyindeki çeşitli glıkanlarda görülür. Sonuç olarak, insanlar kanser ve diğer kronik enflamasyon aracılı hastalıklarda çeşitli rol oynayan ve potansiyel tanı ve terapötik ta olan dolaşımdaki anti-Neu5Gc antikorlarına sahiptirler.rgets. Burada, bu tür anti-Neu5Gc antikorlarını insan serumunda değerlendirmek için yüksek verimli bir sialoglikan mikroarray deneyi tarif ederiz. Neu5Gc içeren glikanlar ve bunların her biri bir çekirdek primer amin içeren eşleştirilmiş kontrol çiftleri (Neu5Ac içeren glikanlar), epoksi kaplı cam slaytlara kovalent olarak bağlanır. Baskı başına 896 diziye kadar çıkabilen özel bir nano-yazıcı kullanarak 16 slayt formatında 56 slaytın baskısını örnekledik. Her slayt, anti-Neu5Gc antikor özgüllüğünün, yoğunluğunun ve çeşitliliğinin değerlendirilmesi için 16 farklı insan serum örneğini taramak için kullanılabilir. Protokol, bu sağlam aracın karmaşıklığını tanımlar ve bir dizi formatında farklı klinik örneklerde Neu5Gc diyet karbonhidrat antijenine cevabı araştırmayı amaçlayanların temel bir kılavuz sağlar.
Introduction
Sias, hücre yüzeyi glikoproteinleri üzerindeki glıkan zincirlerini ve omurgalılardaki glikolipitleri kapsayan asidik şekerlerdir. Sia kanser hücrelerinde 1 değiştirilebilir ve ilerlemesi ve / veya metastaz 2, 3 ile bağıntılı olduğu ortaya konmaktadır. Memelilerdeki başlıca Sia formlarından ikisi Neu5Ac ve onun hidroksillenmiş formu Neu5Gc 2'dir . İnsanlar CMAH enzimini kodlayan genin belirli bir inaktivasyonu nedeniyle Neu5Gc'yi sentezleyemez. Bu insan dışı Sia metabolik diyet Neu5Gc zengin besinler (örneğin kırmızı et) den "kendini," menşeli 4, 5 gibi insan hücrelerine sahiptir. Neu5Gc, insan epitelinin ve endotelin hücre yüzeylerinde düşük seviyelerde bulunur, ancak özellikle karsinomalarda birikir. Neu5Gc, insan humoral bağışıklık sistemi 2 , 6 tarafından yabancı olarak tanınır.Neu5Gc-glıkanların antijenik karmaşıklığı, insanlardaki anti-Neu5Gc antikor cevabının karmaşıklığı tarafından yansıtılan, Neu5Gc modifikasyonu, bağlanma, altta yatan glıkanlar ve iskeleler ve bunların yoğunluğu da dahil olmak üzere çoklu seviyelerde ortaya çıkabilir 6 . Bu antikorlardan bazıları karsinom biyolojik belirteçleri ve potansiyel immünoterapötikler 7 olarak kullanılır . Farklı sialoglikanlar 8'in kemoenzimatik sentezinin ortaya çıkışı, bu tür antikorların daha derinlemesine analizine yol açtı, bu da glıkan mikroarray teknolojisi 9 , 10 kullanılarak kolaylaştırıldı. Bu nedenle, doğal ve sentetik karbonhidratların büyük kütüphanelerinin kolaylaştırılmış hazırlanması ve manipülasyonu ile, glıkan mikrodizileri karbonhidratların sayısız biyomoleküllerle olan etkileşimlerini araştırmak için güçlü, yüksek verimli bir teknoloji haline geldi 10 , 11 , </sup12 , 13 . Bir dizi formatında, az miktarda malzeme kullanılır ve biyolojik olarak ilgili glıkanların bu çok-değerli gösterimi, tek bir deneyde binlerce bağlanma etkileşiminin araştırılmasını sağlar. Önemli olan, bu teknoloji aynı zamanda biyomarkır bulguları ve çeşitli numunelerde 7 , 12 bağışıklık yanıtlarını izlemek için de uygulanabilir.
Başarılı glıkan mikrodizi imalatı, üç önemli hususu göz önüne alır: yazıcı robot tipi, glikan konjugasyon kimyası ve tespit optiği. Baskı aleti konusuna gelince, iki teknik mevcuttur: temaslı ve temassız yazıcılar. Temas baskıda, 1-48 çelik pim, glikan solüsyonu içeren çok iyi kaynak plakasına daldırılır ve cam sürgü yüzeyine doğrudan temas ederek işlevselleştirilmiş cam slaytlar üzerinde lekelenir. Çözelti miktarı deSlayta gömülmüş olan, slayt yüzeyinde kalıcı sürenin bir fonksiyonudur. Genellikle, numuneler önce kaygan yüzey üzerine basılmadan önce bir cam blok üzerine (homojen noktalere ulaşmak için) önceden lekelenir. Temassız yazıcılarda ( örn., Piezo elektronik yazıcı), glikanlar, kontrollü elektrik sinyalleri kullanılarak bir cam kılcalından basılır. Kontak baskıya kıyasla daha hassas baskı elde etmek için elektrik sinyali hassas bir şekilde kalibre edilebilir. Noktaların boyutu ve morfolojisi de nispeten daha homojen. Ek bir avantaj, numunenin baskıdan sonra kaynak plakasına geri döndürülmesidir. Bununla birlikte, piezo elektronik yazıcıların en büyük dezavantajı baskı ucu sınırlaması (4 veya 8) olup, kayma kararlılığı, sıcaklık, nem ve numunenin buharlaşmasına özel dikkat gerektiren çok uzun bir yazdırma süresi sağlar. Temassız inkjet yazıcı 14 daha büyük numune hacimleri gerektirir.
<p clasS = "jove_content"> Yazdırma yöntemleri için mevcut sınırlı seçeneklerin aksine, glikan konjugasyon kimyası, daha pek çok seçeneğe sahip daha karmaşık bir sorundur. Seçilen immobilizasyon kimyası, hem glikanlardaki aktif grupları hem de slayt yüzeyinin reaktivitesini açıklamak zorundadır. Belirli bir mikrodizinin yüzeyinde, sentetik olarak sentezlenen veya doğal olarak izole edilen glikanlar, hepsi aynı reaktif grubu gerektirir. Buna ek olarak, glikanlar saf ve homojen olmalı. Öte yandan, immobilizasyon yüzeyi ve kimyası tekrarlanabilirlik ve güvenilir bağlanma yoğunluğu sağlamalıdır. Çoklu immobilizasyon yöntemleri, kovalent veya kovalent olmayan (fiziksel absorpsiyon) ataşman 10 , 11 , 12 , 13 ile geliştirilmiştir . Baskın glikan mikroarray teknolojisi ile ilgili son derece detaylı bilgi almak içinD araştırmacı, bu mükemmel değerlendirmeleri 13 , 15 bakın . Önemlisi, bir Glikomik Deney (MIRAGE) inisiyatifi için gereken son Minimum Bilgi, numune hazırlama 16 için ve bu büyüyen alanda standartları iyileştirmek için glıkan mikrodizi analizleri 17'den veri raporlama talimatlarını açıklar.Burada, 16 yuvalı bir formatta belirli bir kontaklı nano-yazıcı kullanarak sialoglikan mikrodizilerinin imalatı için ayrıntılı bir protokolü açıklıyoruz. Glikanlardan her biri, epoksi ile aktive edilen cam slaytlarına kovalent bağlantısına aracılık eden bir birincil amin içerirler. Ayrıca çeşitli insan sera örneklerini, antikorları ve Sia bağlayıcı bitki lektinlerini kullanarak bir slaytın gelişimini ve analizini açıklıyoruz. Siyaloglikan mikroarray tahlilleri, dizi imalatı, işlenmesi, geliştirilmesi ve analizi içeren birkaç ana aşamayı içerir. Dizi üretiminde armanın planlanması gerekirRay düzeni, glikanlar ve kaynak plakası hazırlanması, nano yazıcının programlanması ve slaytların basılması. Daha sonra, slaytlar işlenir, geliştirilir ve analiz edilir ( Şekil 1 ).
Protocol
Representative Results
Discussion
Başarılı bir glikan mikroarray üretimi dikkatli planlama gerektirir ve protokolde birkaç önemli adımı içerir. Bunlar arasında şunlar bulunur: (1) sonraki tüm parametreleri tanımlayan blok ve plaka düzenlerini planlama ( ör. Mesafeler, aralık, numune miktarı ve baskı); (2) piksellerin temizlenmesi ve nokta homojenliğini kontrol etmek için kritik olan pin bütünlüğünün sağlanması; (3) baskı esnasında yüksek nem oranının korunması, spot homojenliğinden ödün verebilecek uzun bas?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma kısmen İsrail Kanser Araştırma Fonu'ndan Ar-Ge Kariyer Geliştirme Ödülü, İsrail Ulusal Nanoteknoloji Girişimi ve Helmsley Bağışlı Güven'den Kişiselleştirilmiş Teröristler için Nano Dedektifler (VP-K) için bir Odaklı Teknoloji Alanından hibe tarafından desteklendi ve Ulusal Sağlık yardımı enstitüleri R01GM076360 (XC'ye).
Materials
| Primary-amine containing sialoglycans | Glycohub, Inc., Davis, CA, USA (http://www.glycohub.com/services) | Contact info@glycohubusa.com for compound requests | Printed glycans |
| Monosodium phosphate monohydrate | Sigma | S9638 | Printing buffer component |
| Disodium phosphate heptahydrate | Sigma | S9390 | Printing buffer component |
| Phosphate buffered saline | Hy-Labs | BP-507/500D | Printing buffer/ incubation/washing buffer |
| Tris-base | Sigma | T1503 | Slide blocking reagent |
| Glycerol | Sigma | G-7893 | Printing buffer component |
| Ethanolamine | Thermo-Fisher Scientific | 0700/08 | Slide blocking reagent |
| Ovalbumin (Grade V) | Sigma | A5503 | Slide Blocking protein |
| Tween-20 | Sigma | P7949 | Slide washing detergent |
| Alexa 555-Hydrazide | Thermo-Fisher Scientific | A20501MP | Marker on array |
| ChromPure Human IgG, whole molecule | Jackson Immunoresearch | 009-000-003 | Printing component |
| Biotinylated- SNA | Vector Laboratories | B-1305 | Plant Lectin – binding Sia-alpha2–6-linked |
| Biotinylated-MALII | Vector Laboratories | B-1265 | Plant Lectin – binding Sia-alpha2–3-linked |
| Chicken-anti Neu5Gc IgY | BioLegend | 146903 | Primary detection |
| Cy3-Streptavidin | Jackson Immunoresearch | 016-160-0848 | Biotin binding |
| Cy3-anti Human IgG | Jackson Immunoresearch | 109-165-088 | Secondary detection against human IgG |
| Cy3-anti Chicken IgY | Jackson Immunoresearch | 703-165-155 | Secondary detection against chicken IgY |
| Human sera samples | Israeli Blood Bank | Primary detection | |
| Compressed Nitrogen (Grade 5) | General dusting/drying tool | ||
| Epoxy-coated slides | Corning | 40044 | Slides |
| Epoxy-coated slides | PolyAn | 2D 104-00-221 | Slides. In this type of slides the surface is more hydrophobic (compared to Coring slides) therefore the glycans Print Buffer would need to be supplemented with 0.005% Tween-20 to obtain 100 µm size spots. |
| 384-well microtiter plate | Genetix | 2070 | Printing plate |
| VWR lab marker | VWR | 52877-310 | Slide labeling |
| Staining Tube | ArrayIt | MST | Slide developing tool |
| Staining bath | VWR | 25608-904 | Slide developing tool |
| Slides glass holders | VWR | 631-9321 | Slide developing tool |
| GenePix Scanner | Molecular devices | 4000B | Slide scanner |
| LM-60 NanoPrinter | ArrayIt | LM-60 | Array printer |
| Pins | ArrayIt | 946MP3 | Printing pins |
| ProPlate Module | Grace Bio-Labs | P37004 | Slide developing module |
| Distilled water | Bio-Lab | 2321020500 | Required for arrayer and humidifier |
| Electronic Multi Pippete, 8 Channel , volume range 2-125 μL | Thermo-Fisher Scientific (Matrix) | MA-2131 Impact2 Equalizer 384 | Multi pippete for sample dispansing into 384-well plate |
References
- Padler-Karavani, V. Aiming at the sweet side of cancer: Aberrant glycosylation as possible target for personalized-medicine. Cancer Lett. 352 (1), 102-112 (2014).
- Amon, R., Reuven, E. M., Leviatan Ben-Arye, ., Padler-Karavani, S., V, Glycans in immune recognition and response. Carbohydr Res. 389, 115-122 (2014).
- Häuselmann, I., Borsig, L. Altered tumor-cell glycosylation promotes metastasis. Front Oncol. 4, (2014).
- Tangvoranuntakul, P., et al. Human uptake and incorporation of an immunogenic nonhuman dietary sialic acid. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (21), 12045-12050 (2003).
- Bardor, M., Nguyen, D. H., Diaz, S., Varki, A. Mechanism of uptake and incorporation of the non-human sialic acid N-glycolylneuraminic acid into human cells. J Biol Chem. 280 (6), 4228-4237 (2005).
- Padler-Karavani, V., et al. Diversity in specificity, abundance, and composition of anti-Neu5Gc antibodies in normal humans: potential implications for disease. Glycobiology. 18 (10), 818-830 (2008).
- Padler-Karavani, V., et al. Human xeno-autoantibodies against a non-human sialic acid serve as novel serum biomarkers and immunotherapeutics in cancer. Cancer Res. 71 (9), 3352-3363 (2011).
- Cao, H., Chen, X. General consideration on sialic acid chemistry. Methods Mol Biol. 808, 31-56 (2012).
- Deng, L., Chen, X., Varki, A. Exploration of sialic Acid diversity and biology using sialoglycan microarrays. Biopolymers. 99 (10), 650-665 (2013).
- Liang, C. H., Hsu, C. H., Wu, C. Y. Sialoside Arrays: New Synthetic Strategies and Applications. Top Curr Chem. 367, 125-149 (2015).
- Song, X., Heimburg-Molinaro, J., Smith, D. F., Cummings, R. D. Glycan microarrays of fluorescently-tagged natural glycans. Glycoconj J. 32 (7), 465-473 (2015).
- Muthana, S. M., Gildersleeve, J. C. Glycan microarrays: powerful tools for biomarker discovery. Cancer Biomark. 14 (1), 29-41 (2014).
- Rillahan, C. D., Paulson, J. C. Glycan microarrays for decoding the glycome. Annu Rev Biochem. 80, 797-823 (2011).
- Heimburg-Molinaro, J., Song, X., Smith, D. F., Cummings, R. D. Preparation and analysis of glycan microarrays. Curr Protoc Protein Sci. 12 (10), (2011).
- Park, S., Gildersleeve, J. C., Blixt, O., Shin, I. Carbohydrate microarrays. Chem Soc Rev. 42 (10), 4310-4326 (2013).
- Struwe, W. B., et al. The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: sample preparation guidelines for reliable reporting of glycomics datasets. Glycobiology. 26 (9), 907-910 (2016).
- Liu, Y., et al. The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: improving the standards for reporting glycan microarray-based data. Glycobiology. , (2016).
- Hara, S., Yamaguchi, M., Takemori, Y., Furuhata, K., Ogura, H., Nakamura, M. Determination of mono-O-acetylated N-acetylneuraminic acids in human and rat sera by fluorometric high-performance liquid chromatography. Anal Biochem. 179 (1), 162-166 (1989).
- Padler-Karavani, V., et al. Cross-comparison of protein recognition of sialic acid diversity on two novel sialoglycan microarrays. J Biol Chem. 287 (27), 22593-22608 (2012).
- Padler-Karavani, V., Varki, A. Potential impact of the non-human sialic acid N-glycolylneuraminic acid on transplant rejection risk. Xenotransplantation. 18 (1), 1-5 (2011).
- Samraj, A. N., et al. A red meat-derived glycan promotes inflammation and cancer progression. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (2), 542-547 (2015).
- Pearce, O. M., Läubli, H. Sialic acids in cancer biology and immunity. Glycobiology. 26 (2), 111-128 (2016).
- Alisson-Silva, F., Kawanishi, K., Varki, A. Human risk of diseases associated with red meat intake: Analysis of current theories and proposed role for metabolic incorporation of a non-human sialic acid. Mol Aspects Med. 51, 16-30 (2016).
- Pearce, O. M., et al. Inverse hormesis of cancer growth mediated by narrow ranges of tumor-directed antibodies. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (16), 5998-6003 (2014).
- Pham, T., et al. Evidence for a novel human-specific xeno-auto-antibody response against vascular endothelium. Blood. 114 (25), 5225-5235 (2009).
- Reuven, E. M., et al. Characterization of immunogenic Neu5Gc in bioprosthetic heart valves. Xenotransplantation. 23 (5), 381-392 (2016).
- Ghaderi, D., Taylor, R. E., Padler-Karavani, V., Diaz, S., Varki, A. Implications of the presence of N-glycolylneuraminic acid in recombinant therapeutic glycoproteins. Nat Biotechnol. 28 (8), 863-867 (2010).
