साइलोग्लाइकेन माइक्रोएरे परख के साथ मानव सेरा में एंटी-नेऊ 5 जीसी आईजीजी को प्रोफाइलिंग करना
Summary
एक सियालोग्लिकैन माइक्रोएरे परख मानव-तंत्र में एंटी-नेयू 5 जीसी एंटीबॉडी का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जिससे कैंसर और अन्य पुरानी सूजन-मध्यस्थता वाले मानव रोगों के लिए यह एक संभावित उच्च-थ्रूपुट डायग्नोस्टिक परख बना सकता है।
Abstract
कोशिकाओं में कार्बोहाइड्रेट चेन (ग्लाइकन्स) का एक ढेर लगा हुआ है जो आमतौर पर कैंसर में बदल जाता है और इसमें सैयलिक एसिड (सीआ) अभिव्यक्ति में भिन्नताएं शामिल हैं ये अम्लीय शर्करा है जो 9-कार्बन रीढ़ की हड्डी हैं और कोशिका सतहों पर कैप वर्टेब्रेट ग्लाइकेंस हैं। स्तनधारियों में प्रमुख सेआ रूपों में से दो हैं एन -केटेलेनेरमिनिक एसिड (नेयु 5 एसी) और इसका हाइड्रोक्सिलाटेड फॉर्म, एन- ग्लाइकोलेनेमैनिक एसिड (नेऊ 5 जीसी)। जीन एन्कोडिंग cytidine 5'monophosphate-Neu5Ac (CMP-Neu5Ac) हाइड्रॉक्सीलेज़ (सीएमएएच) के निष्क्रिय होने के कारण मानव अंतर्जात Neu5Gc का उत्पादन नहीं कर सकते। लाल मांस और डेयरी के आहार उपभोग के माध्यम से मानव कोशिकाओं द्वारा विदेशी Neu5Gc का अधिग्रहण किया जाता है और बाद में कोशिका की सतह पर विविध ग्लाइकन्स पर दिखाई देता है, जो ज्यादातर कार्सिनोमा पर जमा होता है। नतीजतन, इंसान ने एंटी Neu5Gc एंटीबॉडी को परिचालित किया है जो कैंसर और अन्य पुरानी सूजन-मध्यस्थता वाली बीमारियों में विविध भूमिका निभाते हैं और जो संभावित नैदानिक और चिकित्सीय रोग बन रहे हैंrgets। यहां, हम मानवीय सेरा में इस तरह के एंटी-नेऊ 5 जीसी एंटीबॉडी का आकलन करने के लिए एक उच्च-थ्रूपुट सिआलाोग्लिक्कैन माइक्रोएरे परख का वर्णन करते हैं। Neu5Gc युक्त ग्लाइकैंस और उनके मिलान किए गए जोड़े नियंत्रण (Neu5Ac युक्त ग्लाइकान), प्रत्येक मुख्य प्राथमिक अमाइन के साथ, ईवॉक्सी-लेपित गिलास स्लाइड से संयोजक रूप से जुड़े हुए हैं। हम एक विशिष्ट नैनो प्रिंटर का उपयोग करके 56 स्लाइड्स के मुद्रण को एक 16-अच्छी तरह प्रारूप में दिखाते हैं, जो प्रिंट प्रति 896 एरे तक पैदा करने में सक्षम है। एंटी Neu5Gc एंटीबॉडी विशिष्टता, तीव्रता और विविधता के मूल्यांकन के लिए प्रत्येक स्लाइड 16 अलग-अलग मानव सीरा नमूनों को स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। प्रोटोकॉल इस मजबूत उपकरण की जटिलता का वर्णन करता है और एक सरणी प्रारूप में विभिन्न नैदानिक नमूनों में Neu5Gc आहार कार्बोहाइड्रेट एंटीजन के प्रति प्रतिक्रिया की जांच करने के उद्देश्य के लिए एक बुनियादी दिशानिर्देश प्रदान करता है।
Introduction
सियास अम्लीय शर्करा हैं जो सेल-स्पेस ग्लाइकोप्रोटीन और वर्मीशैबल्स में ग्लाइकोलीपिड्स पर ग्लाइकन चेन को कवर करते हैं। सीआ अभिव्यक्ति कैंसर कोशिकाओं 1 में संशोधित की गई है और प्रगति और / या मेटास्टेसिस 2 , 3 के साथ संबंध है। स्तनधारियों में प्रमुख सेआ रूपों में से दो हैं Neu5Ac और इसकी हाइड्रोक्सीलाइटेड फॉर्म, Neu5Gc 2 सीएनएएच एंजाइम जीन एन्कोडिंग के विशिष्ट निष्क्रियता के कारण मानव Neu5Gc को संश्लेषित नहीं कर सकते। यह गैर-मानव Sia metabolically मानव कोशिकाओं के रूप में "स्व", आहार Neu5Gc युक्त खाद्य पदार्थ ( जैसे, लाल मांस) 4 , 5 से उत्पन्न होने वाली है। Neu5Gc मानव एपिथेलिया और एंडोथेलिया की कोशिका सतहों पर निम्न स्तर पर मौजूद है, लेकिन यह विशेष रूप से कार्सिनोमा में जम जाता है। Neu5Gc मानव humoral प्रतिरक्षा प्रणाली 2 , 6 द्वारा विदेशी के रूप में मान्यता प्राप्त है।Neu5Gc-ग्लाइकान की प्रतिजनी जटिलता Neu5Gc संशोधन, लिंकेज, अंतर्निहित ग्लाइकान और मचान, और उनके घनत्व सहित कई स्तरों पर उत्पन्न हो सकती है, सभी मनुष्यों 6 में विरोधी Neu5Gc एंटीबॉडी प्रतिक्रिया की जटिलता से परिलक्षित। इनमें से कुछ एंटीबॉडी कार्सिनोमा बायोमार्कर और संभावित इम्युनोथेराप्पटिक्स 7 के रूप में कार्य करते हैं। विभिन्न सियालोग्लाइकेन्स 8 के chemoenzymatic संश्लेषण के आगमन ने ऐसे एंटीबॉडी के अधिक गहराई से विश्लेषण के लिए मार्ग प्रशस्त किया, जो ग्लाइकैन माइक्रोएरे तकनीक 9 , 10 के प्रयोग से सहायता प्रदान की गई थी। इस प्रकार, प्राकृतिक और सिंथेटिक कार्बोहाइड्रेट के बड़े पुस्तकालयों की आसान तैयारी और हेरफेर के साथ, कार्बन डाइऑक्साइड 10 , 11 के असंख्य कार्बोहाइड्रेट्स के इंटरैक्शन की जांच के लिए ग्लाइकन माइक्रोएरे एक शक्तिशाली उच्च-थ्रुपुटन प्रौद्योगिकी बन गए हैं , </sup> 12 , 13 सरणी प्रारूप में, कम मात्रा में सामग्री का उपयोग किया जाता है, और जैविक रूप से संबंधित ग्लाइकेंस के इस बहुविकल्प प्रदर्शन से एक प्रयोग में हजारों बाध्यकारी बातचीत की जांच की अनुमति मिलती है। महत्वपूर्ण बात यह है कि बायोमार्कर की खोज के लिए और विभिन्न नमूने 7 , 12 में प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की निगरानी के लिए भी यह तकनीक लागू की जा सकती है।
सफल glycan माइक्रोएरे निर्माण के लिए तीन महत्वपूर्ण पहलुओं पर विचार करना आवश्यक है: प्रिंटर रोबोट प्रकार, ग्लाइकन संयुग्मन रसायन विज्ञान, और पहचान प्रकाशिकी। मुद्रण उपकरण के विचार के अनुसार, दो तकनीकों उपलब्ध हैं: संपर्क और गैर संपर्क प्रिंटर संपर्क प्रिंटिंग में, 1-48 इस्पात पिन एक मल्टी-प्लस सॉकेट प्लेट में गिलीकन समाधान युक्त डूबा हो जाते हैं और ग्लास स्लाइड सतह से सीधे संपर्क करके फ़ंक्शनल ग्लास स्लाइड पर देखा जाता है। समाधान राशि डीस्लाइड के लिए लाइव स्लाइड की सतह पर सुस्त अवधि का एक फ़ंक्शन होता है। आम तौर पर, नमूने पहले स्लाइड सतह पर मुद्रित होने से पहले एक ग्लास ब्लॉक (एकरूप स्पॉट तक पहुंचने के लिए) पर पूर्व-देखा जाता है। गैर-संपर्क प्रिंटर ( जैसे, पाइज़ो-इलेक्ट्रॉनिक प्रिंटर) में, ग्लाइकेंस नियंत्रित इलेक्ट्रिक सिग्नल का उपयोग कर गिलास केशिका से मुद्रित होते हैं। प्रिंटिंग से संपर्क करने के लिए अधिक सटीक मुद्रण प्राप्त करने के लिए बिजली के संकेत को पतला कैलिब्रेट किया जा सकता है। धब्बे के आकार और आकारिकी अपेक्षाकृत अधिक सजातीय हैं। एक अतिरिक्त लाभ प्रिंटिंग के बाद स्रोत प्लेट में वापस नमूनाकरण के रीसाइक्लिंग है। फिर भी, पाइज़ो-इलेक्ट्रॉनिक प्रिंटर का मुख्य नुकसान प्रिंटिंग टिप सीमा (4 या 8) है, जिसके परिणामस्वरूप बहुत लंबे मुद्रण अवधि होती है, जिससे स्लाइड स्थिरता, तापमान, आर्द्रता और नमूना वाष्पीकरण पर विशेष ध्यान देने की आवश्यकता होती है। गैर-संपर्क इंकजेट प्रिंटर को बड़ा नमूना संस्करण 14 की आवश्यकता है।
<p clasS = "jove_content"> प्रिंटिंग विधियों के लिए सीमित उपलब्ध विकल्पों के विपरीत, ग्लाइकन संयुग्मन रसायन विज्ञान एक अधिक जटिल विचार है, जिसमें से चुनने के कई विकल्प हैं। चयनित स्थलांतरण रसायन विज्ञान को ग्लिकेन्स और स्लाइड की सतह प्रतिक्रियाशील दोनों सक्रिय समूहों के लिए खाता होना चाहिए। ग्लाइकैंस को एक विशिष्ट माइक्रोएरे की सतह पर स्थिर कर दिया जाना चाहिए, या तो कृत्रिम रूप से संश्लेषित या स्वाभाविक रूप से अलग, सभी को एक समान प्रतिक्रियाशील समूह की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, ग्लाइकन्स को शुद्ध और समरूप होना चाहिए। दूसरी ओर, स्थिरीकरण की सतह और रसायन विज्ञान को पुनरुत्पादन और विश्वसनीय लगाव घनत्व प्रदान करना चाहिए। एकाधिक स्थिरीकरण विधियों को सहसंयोजक या गैर-सहसंयोजक (शारीरिक अवशोषण) संलग्नक 10 , 11 , 12 , 13 के साथ विकसित किया गया है। मुद्रित ग्लाइकैन माइक्रोएरे प्रौद्योगिकी पर अत्यधिक विस्तृत जानकारी के लिए अनिश्चितडी जांचकर्ता, इन उत्कृष्ट समीक्षाओं को देखें 13 , 15 महत्वपूर्ण रूप से, एक Glycomics प्रयोग (मिराज) पहल के लिए हाल ही में न्यूनतम जानकारी आवश्यक नमूना तैयार करने के लिए 16 और 17 का विश्लेषण करती है इस बढ़ते क्षेत्र में मानकों में सुधार करने के लिए glycan माइक्रोएरे से डेटा रिपोर्ट करने के लिए दिशा-निर्देशों का वर्णन है।यहां, हम एक 16-अच्छी तरह से प्रारूप में एक विशिष्ट संपर्क नैनो प्रिंटर का उपयोग करने वाले सियालोग्लाइकन माइक्रोएरे के निर्माण के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। प्रत्येक ग्लाइकेंस में एक प्राथमिक अमाइन होता है जो कि ईपीओक्सी-सक्रिय ग्लास स्लाइड्स को उनके सहसंयोजक लिंक में मध्यस्थता करता है। हम विभिन्न मानव सीरा नमूनों, एंटीबॉडी, और सिया-बाध्यकारी संयंत्र लैक्टिन का उपयोग करके एक स्लाइड के विकास और विश्लेषण का भी वर्णन करते हैं। सियालोग्लिक्कैन माइक्रोएरे एशेज में कई प्रमुख कदम शामिल हैं जिनमें सरणी निर्माण, प्रसंस्करण, विकास और विश्लेषण शामिल हैं। एरे का निर्माण AR की योजना बना रहा हैरे लेआउट, ग्लाइकेंस और स्रोत प्लेट तैयार करना, नैनो प्रिंटर को प्रोग्रामिंग करना, और स्लाइड्स प्रिंट करना। इसके बाद, स्लाइड संसाधित, विकसित और विश्लेषण ( चित्रा 1 ) हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
एक सफल ग्लाइकैन माइक्रोएरे के निर्माण के लिए सावधानीपूर्वक योजना की आवश्यकता है और प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम शामिल हैं। इनमें निम्न शामिल हैं: (1) ब्लॉक और प्लेट लेआउट की योजना बना जो कि बाद के सभ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम इज़राइल कैंसर रिसर्च फंड से एक रिसर्च कैरियर डेवलपमेंट अवार्ड, इजरायल नेशनल नैनोटेक्नोलॉजी इनिशिएटिव से अनुदान और निजीकृत थेरोनोस्टिक्स (वीपी-के) के लिए नैनोमेडिसिन पर एक फोकल टेक्नोलॉजी एरिया के लिए हैम्सले चैरिटेबल ट्रस्ट और राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान R01GM076360 (XC करने के लिए) संस्थानों
Materials
| Primary-amine containing sialoglycans | Glycohub, Inc., Davis, CA, USA (http://www.glycohub.com/services) | Contact info@glycohubusa.com for compound requests | Printed glycans |
| Monosodium phosphate monohydrate | Sigma | S9638 | Printing buffer component |
| Disodium phosphate heptahydrate | Sigma | S9390 | Printing buffer component |
| Phosphate buffered saline | Hy-Labs | BP-507/500D | Printing buffer/ incubation/washing buffer |
| Tris-base | Sigma | T1503 | Slide blocking reagent |
| Glycerol | Sigma | G-7893 | Printing buffer component |
| Ethanolamine | Thermo-Fisher Scientific | 0700/08 | Slide blocking reagent |
| Ovalbumin (Grade V) | Sigma | A5503 | Slide Blocking protein |
| Tween-20 | Sigma | P7949 | Slide washing detergent |
| Alexa 555-Hydrazide | Thermo-Fisher Scientific | A20501MP | Marker on array |
| ChromPure Human IgG, whole molecule | Jackson Immunoresearch | 009-000-003 | Printing component |
| Biotinylated- SNA | Vector Laboratories | B-1305 | Plant Lectin – binding Sia-alpha2–6-linked |
| Biotinylated-MALII | Vector Laboratories | B-1265 | Plant Lectin – binding Sia-alpha2–3-linked |
| Chicken-anti Neu5Gc IgY | BioLegend | 146903 | Primary detection |
| Cy3-Streptavidin | Jackson Immunoresearch | 016-160-0848 | Biotin binding |
| Cy3-anti Human IgG | Jackson Immunoresearch | 109-165-088 | Secondary detection against human IgG |
| Cy3-anti Chicken IgY | Jackson Immunoresearch | 703-165-155 | Secondary detection against chicken IgY |
| Human sera samples | Israeli Blood Bank | Primary detection | |
| Compressed Nitrogen (Grade 5) | General dusting/drying tool | ||
| Epoxy-coated slides | Corning | 40044 | Slides |
| Epoxy-coated slides | PolyAn | 2D 104-00-221 | Slides. In this type of slides the surface is more hydrophobic (compared to Coring slides) therefore the glycans Print Buffer would need to be supplemented with 0.005% Tween-20 to obtain 100 µm size spots. |
| 384-well microtiter plate | Genetix | 2070 | Printing plate |
| VWR lab marker | VWR | 52877-310 | Slide labeling |
| Staining Tube | ArrayIt | MST | Slide developing tool |
| Staining bath | VWR | 25608-904 | Slide developing tool |
| Slides glass holders | VWR | 631-9321 | Slide developing tool |
| GenePix Scanner | Molecular devices | 4000B | Slide scanner |
| LM-60 NanoPrinter | ArrayIt | LM-60 | Array printer |
| Pins | ArrayIt | 946MP3 | Printing pins |
| ProPlate Module | Grace Bio-Labs | P37004 | Slide developing module |
| Distilled water | Bio-Lab | 2321020500 | Required for arrayer and humidifier |
| Electronic Multi Pippete, 8 Channel , volume range 2-125 μL | Thermo-Fisher Scientific (Matrix) | MA-2131 Impact2 Equalizer 384 | Multi pippete for sample dispansing into 384-well plate |
References
- Padler-Karavani, V. Aiming at the sweet side of cancer: Aberrant glycosylation as possible target for personalized-medicine. Cancer Lett. 352 (1), 102-112 (2014).
- Amon, R., Reuven, E. M., Leviatan Ben-Arye, ., Padler-Karavani, S., V, Glycans in immune recognition and response. Carbohydr Res. 389, 115-122 (2014).
- Häuselmann, I., Borsig, L. Altered tumor-cell glycosylation promotes metastasis. Front Oncol. 4, (2014).
- Tangvoranuntakul, P., et al. Human uptake and incorporation of an immunogenic nonhuman dietary sialic acid. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (21), 12045-12050 (2003).
- Bardor, M., Nguyen, D. H., Diaz, S., Varki, A. Mechanism of uptake and incorporation of the non-human sialic acid N-glycolylneuraminic acid into human cells. J Biol Chem. 280 (6), 4228-4237 (2005).
- Padler-Karavani, V., et al. Diversity in specificity, abundance, and composition of anti-Neu5Gc antibodies in normal humans: potential implications for disease. Glycobiology. 18 (10), 818-830 (2008).
- Padler-Karavani, V., et al. Human xeno-autoantibodies against a non-human sialic acid serve as novel serum biomarkers and immunotherapeutics in cancer. Cancer Res. 71 (9), 3352-3363 (2011).
- Cao, H., Chen, X. General consideration on sialic acid chemistry. Methods Mol Biol. 808, 31-56 (2012).
- Deng, L., Chen, X., Varki, A. Exploration of sialic Acid diversity and biology using sialoglycan microarrays. Biopolymers. 99 (10), 650-665 (2013).
- Liang, C. H., Hsu, C. H., Wu, C. Y. Sialoside Arrays: New Synthetic Strategies and Applications. Top Curr Chem. 367, 125-149 (2015).
- Song, X., Heimburg-Molinaro, J., Smith, D. F., Cummings, R. D. Glycan microarrays of fluorescently-tagged natural glycans. Glycoconj J. 32 (7), 465-473 (2015).
- Muthana, S. M., Gildersleeve, J. C. Glycan microarrays: powerful tools for biomarker discovery. Cancer Biomark. 14 (1), 29-41 (2014).
- Rillahan, C. D., Paulson, J. C. Glycan microarrays for decoding the glycome. Annu Rev Biochem. 80, 797-823 (2011).
- Heimburg-Molinaro, J., Song, X., Smith, D. F., Cummings, R. D. Preparation and analysis of glycan microarrays. Curr Protoc Protein Sci. 12 (10), (2011).
- Park, S., Gildersleeve, J. C., Blixt, O., Shin, I. Carbohydrate microarrays. Chem Soc Rev. 42 (10), 4310-4326 (2013).
- Struwe, W. B., et al. The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: sample preparation guidelines for reliable reporting of glycomics datasets. Glycobiology. 26 (9), 907-910 (2016).
- Liu, Y., et al. The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: improving the standards for reporting glycan microarray-based data. Glycobiology. , (2016).
- Hara, S., Yamaguchi, M., Takemori, Y., Furuhata, K., Ogura, H., Nakamura, M. Determination of mono-O-acetylated N-acetylneuraminic acids in human and rat sera by fluorometric high-performance liquid chromatography. Anal Biochem. 179 (1), 162-166 (1989).
- Padler-Karavani, V., et al. Cross-comparison of protein recognition of sialic acid diversity on two novel sialoglycan microarrays. J Biol Chem. 287 (27), 22593-22608 (2012).
- Padler-Karavani, V., Varki, A. Potential impact of the non-human sialic acid N-glycolylneuraminic acid on transplant rejection risk. Xenotransplantation. 18 (1), 1-5 (2011).
- Samraj, A. N., et al. A red meat-derived glycan promotes inflammation and cancer progression. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (2), 542-547 (2015).
- Pearce, O. M., Läubli, H. Sialic acids in cancer biology and immunity. Glycobiology. 26 (2), 111-128 (2016).
- Alisson-Silva, F., Kawanishi, K., Varki, A. Human risk of diseases associated with red meat intake: Analysis of current theories and proposed role for metabolic incorporation of a non-human sialic acid. Mol Aspects Med. 51, 16-30 (2016).
- Pearce, O. M., et al. Inverse hormesis of cancer growth mediated by narrow ranges of tumor-directed antibodies. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (16), 5998-6003 (2014).
- Pham, T., et al. Evidence for a novel human-specific xeno-auto-antibody response against vascular endothelium. Blood. 114 (25), 5225-5235 (2009).
- Reuven, E. M., et al. Characterization of immunogenic Neu5Gc in bioprosthetic heart valves. Xenotransplantation. 23 (5), 381-392 (2016).
- Ghaderi, D., Taylor, R. E., Padler-Karavani, V., Diaz, S., Varki, A. Implications of the presence of N-glycolylneuraminic acid in recombinant therapeutic glycoproteins. Nat Biotechnol. 28 (8), 863-867 (2010).
