Profiling Anti-Neu5Gc IgG i humant serum med en Sialoglycan Microarray Assay
Summary
En sialoglykan-mikroarrayanalys kan användas för att utvärdera anti-Neu5Gc-antikroppar i humansera, vilket gör den till en potentiell diagnostisk analys av höga genomströmningar för cancer och andra kroniska inflammationsmedierade humana sjukdomar.
Abstract
Cellerna är täckta med en kappa av kolhydratkedjor (glykaner) som vanligtvis förändras i cancer och som inkluderar variationer i sialinsyra (Sia) -uttryck. Dessa är syra sockerarter som har en 9-kol ryggraden och det häckar ryggradsglykaner på cellytor. Två av de stora Sia-formerna i däggdjur är N- acetylneuraminsyra (Neu5Ac) och dess hydroxylerade form, N- glykylylururinsyra (Neu5Gc). Människor kan inte producera endogen Neu5Gc på grund av inaktiveringen av genen som kodar för cytidin 5'monofosfat-Neu5Ac (CMP-Neu5Ac) hydroxylas (CMAH). Utländska Neu5Gc förvärvas av mänskliga celler genom kostförbrukningen av rött kött och mejeri och visas sedan på olika glykaner på cellytan, som huvudsakligen ackumuleras på karcinom. Följaktligen har människor cirkulerande anti-Neu5Gc antikroppar som spelar olika roller i cancer och andra kroniska inflammationsmedierade sjukdomar och som blir potentiella diagnostiska och terapeutiska targets. Här beskriver vi en sialoglycan-mikroarrayanalys med hög genomströmning för att utvärdera sådana anti-Neu5Gc-antikroppar i humansera. Neu5Gc-innehållande glykaner och deras matchade kontrollpar (Neu5Ac-innehållande glykaner), var och en med en primär aminkärna, är kovalent kopplade till epoxi-belagda glasskivor. Vi exemplifierar utskrift av 56 bilder i ett 16-brunnsformat med en specifik nanoprinter som kan generera upp till 896 arrayer per utskrift. Varje bild kan användas för att screena 16 olika humana serumprover för utvärdering av anti-Neu5Gc-antikroppsspecificitet, intensitet och mångfald. Protokollet beskriver komplexiteten i detta robusta verktyg och ger en grundläggande riktlinje för dem som syftar till att undersöka svaret på Neu5Gc dietary carbohydrate antigen i olika kliniska prov i ett array format.
Introduction
Sias är sura sockerarter som täcker glykankedjor på cellytglykoproteiner och glykolipider hos ryggradsdjur. Sia-uttryck är modifierat i cancerceller 1 och korrelerar med progression och / eller metastasering 2 , 3 . Två av de stora Sia former i däggdjur är Neu5Ac och dess hydroxylerad form Neu5Gc 2. Människor kan inte syntetisera Neu5Gc på grund av en specifik inaktivering av genen som kodar för CMAH-enzymet. Denna icke-mänskliga Sia inkorporerar metaboliskt i humana celler som "själv", som härrör från dietiska Neu5Gc-rika livsmedel ( t.ex. rött kött) 4 , 5 . Neu5Gc är närvarande i låga halter på cellytorna av mänsklig epitel och endotel, men ackumuleras speciellt i karcinom. Neu5Gc är erkänt som främmande av humant humoral immunsystem 2 , 6 .Den antigena komplexiteten hos Neu5Gc-glykaner kan uppstå vid flera nivåer, innefattande Neu5Gc modifiering, koppling, underliggande glykaner och byggnadsställningar, och deras densitet, som alla reflekteras av komplexiteten av anti-Neu5Gc-antikroppssvar hos människor 6 . Några av dessa antikroppar tjänar som karcinombiomarkörer och potentiella immunoterapeutika 7 . Tillkomsten av den kemoenzymatiska syntesen av olika sialoglykaner 8 banade vägen för en djupare analys av sådana antikroppar, underlättad genom användningen av glykanmikroskopteknik 9 , 10 . Således har glykanmikroarrayer med hjälp av den underlättade förberedelsen och manipuleringen av stora bibliotek av naturliga och syntetiska kolhydrater blivit en kraftfull hög genomströmningsteknik för att undersöka växelverkan av kolhydrater med en myriad av biomolekyler 10 , 11 , </sup> 12 , 13 . I ett arrayformat används minimala mängder material och denna multivalenta visning av biologiskt relevanta glykaner möjliggör undersökning av tusentals bindande interaktioner i ett enda experiment. Viktigt är att denna teknik också kan tillämpas på biomarknadsfunn och att övervaka immunsvar i olika prover 7 , 12 .
Framgångsrik tillverkning av glykan mikroarray kräver att man beaktar tre viktiga aspekter: skrivrobotstypen, glykan-konjugationskemi och detektionsoptik. När det gäller skrivarinstrumentets överväganden finns två tekniker tillgängliga: kontakt- och kontaktfria skrivare. Vid kontaktutskrift doppas 1-48 stiftstiften i en multi-well-källplatta innehållande glykanlösning och spottas på funktionaliserade glasskivor genom att direkt kontakta glasskivans yta. Lösningen mängder deLevererad till glidbanan är en funktion av den långvariga varaktigheten på glidytan. Vanligtvis är proverna först förspotted på ett glasblock (för att nå homogena fläckar) innan de skrivs ut på glidytan. I icke-kontaktskrivare ( t.ex. den piezo-elektroniska skrivaren) skrivs glykanerna ut från en glaskapillär med hjälp av kontrollerade elektriska signaler. Den elektriska signalen kan finskalibreras för att uppnå mer exakt tryckning i förhållande till kontaktutskrift. Plattornas storlek och morfologi är också relativt homogena. En ytterligare fördel är återvinningen av provet tillbaka till källplattan efter utskrift. Ändå är den stora nackdelen med piezoelektroniska skrivare tryckbegränsningen (4 eller 8), vilket resulterar i en mycket lång utskriftstid, vilket kräver särskild uppmärksamhet åt glidstabilitet, temperatur, fuktighet och provavdunstning. Inkjet-skrivaren utan kontakt kräver större provvolymer 14 .
<p clasS = "jove_content"> Till skillnad från de begränsade tillgängliga alternativen för tryckmetoder är glykan-konjugationskemi en mer komplex övervägning, med många alternativ att välja mellan. Utvald immobiliseringskemi måste stå för både de aktiva grupperna på glykanerna och glidytans reaktivitet. Glykanerna som ska immobiliseras på en specifik mikroarray-yta, antingen syntetiskt syntetiserad eller naturligt isolerad, kräver alla en identisk reaktiv grupp. Dessutom måste glykanerna vara rena och homogena. Å andra sidan bör immobiliseringsytan och kemi tillhandahålla reproducerbarhet och tillförlitlig fastsättningstäthet. Multipla immobiliseringsmetoder har utvecklats med antingen kovalent eller icke-kovalent (fysikalisk absorption) bindning 10 , 11 , 12 , 13 . För mycket detaljerad information om tryckt glykan mikroarray teknik för oinitiatD-utredare, hänvisa till dessa utmärkta recensioner 13 , 15 . Viktigt är att den senaste minsta informationen som krävs för ett Glycomics Experiment-initiativ (MIRAGE) beskriver riktlinjer för provberedning 16 och för rapportering av data från glykanmikroarrayanalyser 17 för att förbättra normerna i detta odlingsområde.Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för tillverkning av sialoglykan-mikroarrayer med en specifik kontaktnano-skrivare i ett 16-brunnsformat. Var och en av glykanerna har en primär amin som förmedlar sin kovalenta länk till epoxidaktiverade glasskivor. Vi beskriver också utvecklingen och analysen av en slida med användning av olika humana seraprover, antikroppar och Sia-bindande växtelektiner. Sialoglykan-mikroarrayanalyser involverar flera viktiga steg som innefattar grupptillverkning, bearbetning, utveckling och analys. Array tillverkning kräver planering av arRay-layout, förbereda glykanerna och källplattan, programmera nano-skrivaren och skriva ut bilderna. Därefter bearbetas, utvecklas och analyseras objektglasen ( Figur 1 ).
Protocol
Representative Results
Discussion
En framgångsrik tillverkning av glykan mikroarray kräver noggrann planering och innehåller flera viktiga steg i protokollet. Dessa innefattar: (1) planering av block- och plattlayouterna som definierar alla efterföljande parametrar ( t.ex. avstånd, avstånd, mängd prov och utskrift); (2) städning av stiften och säkerställande av stiftintegritet, vilket är kritiskt för styrning av punkthomogenitet; (3) upprätthåller hög luftfuktighet under tryck, vilket är kritiskt för att undvika provdunstning u…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes delvis av ett forskningsprojekt för karriärutveckling från Israels cancerforskningsfond, ett bidrag från det israeliska nationella nanoteknologinitiativet och Helmsley Charitable Trust för ett fokalt tekniskt område för nanomedicin för personlig terapi (VP-K) och nationell Institut för hälsobidrag R01GM076360 (till XC).
Materials
| Primary-amine containing sialoglycans | Glycohub, Inc., Davis, CA, USA (http://www.glycohub.com/services) | Contact info@glycohubusa.com for compound requests | Printed glycans |
| Monosodium phosphate monohydrate | Sigma | S9638 | Printing buffer component |
| Disodium phosphate heptahydrate | Sigma | S9390 | Printing buffer component |
| Phosphate buffered saline | Hy-Labs | BP-507/500D | Printing buffer/ incubation/washing buffer |
| Tris-base | Sigma | T1503 | Slide blocking reagent |
| Glycerol | Sigma | G-7893 | Printing buffer component |
| Ethanolamine | Thermo-Fisher Scientific | 0700/08 | Slide blocking reagent |
| Ovalbumin (Grade V) | Sigma | A5503 | Slide Blocking protein |
| Tween-20 | Sigma | P7949 | Slide washing detergent |
| Alexa 555-Hydrazide | Thermo-Fisher Scientific | A20501MP | Marker on array |
| ChromPure Human IgG, whole molecule | Jackson Immunoresearch | 009-000-003 | Printing component |
| Biotinylated- SNA | Vector Laboratories | B-1305 | Plant Lectin – binding Sia-alpha2–6-linked |
| Biotinylated-MALII | Vector Laboratories | B-1265 | Plant Lectin – binding Sia-alpha2–3-linked |
| Chicken-anti Neu5Gc IgY | BioLegend | 146903 | Primary detection |
| Cy3-Streptavidin | Jackson Immunoresearch | 016-160-0848 | Biotin binding |
| Cy3-anti Human IgG | Jackson Immunoresearch | 109-165-088 | Secondary detection against human IgG |
| Cy3-anti Chicken IgY | Jackson Immunoresearch | 703-165-155 | Secondary detection against chicken IgY |
| Human sera samples | Israeli Blood Bank | Primary detection | |
| Compressed Nitrogen (Grade 5) | General dusting/drying tool | ||
| Epoxy-coated slides | Corning | 40044 | Slides |
| Epoxy-coated slides | PolyAn | 2D 104-00-221 | Slides. In this type of slides the surface is more hydrophobic (compared to Coring slides) therefore the glycans Print Buffer would need to be supplemented with 0.005% Tween-20 to obtain 100 µm size spots. |
| 384-well microtiter plate | Genetix | 2070 | Printing plate |
| VWR lab marker | VWR | 52877-310 | Slide labeling |
| Staining Tube | ArrayIt | MST | Slide developing tool |
| Staining bath | VWR | 25608-904 | Slide developing tool |
| Slides glass holders | VWR | 631-9321 | Slide developing tool |
| GenePix Scanner | Molecular devices | 4000B | Slide scanner |
| LM-60 NanoPrinter | ArrayIt | LM-60 | Array printer |
| Pins | ArrayIt | 946MP3 | Printing pins |
| ProPlate Module | Grace Bio-Labs | P37004 | Slide developing module |
| Distilled water | Bio-Lab | 2321020500 | Required for arrayer and humidifier |
| Electronic Multi Pippete, 8 Channel , volume range 2-125 μL | Thermo-Fisher Scientific (Matrix) | MA-2131 Impact2 Equalizer 384 | Multi pippete for sample dispansing into 384-well plate |
References
- Padler-Karavani, V. Aiming at the sweet side of cancer: Aberrant glycosylation as possible target for personalized-medicine. Cancer Lett. 352 (1), 102-112 (2014).
- Amon, R., Reuven, E. M., Leviatan Ben-Arye, ., Padler-Karavani, S., V, Glycans in immune recognition and response. Carbohydr Res. 389, 115-122 (2014).
- Häuselmann, I., Borsig, L. Altered tumor-cell glycosylation promotes metastasis. Front Oncol. 4, (2014).
- Tangvoranuntakul, P., et al. Human uptake and incorporation of an immunogenic nonhuman dietary sialic acid. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (21), 12045-12050 (2003).
- Bardor, M., Nguyen, D. H., Diaz, S., Varki, A. Mechanism of uptake and incorporation of the non-human sialic acid N-glycolylneuraminic acid into human cells. J Biol Chem. 280 (6), 4228-4237 (2005).
- Padler-Karavani, V., et al. Diversity in specificity, abundance, and composition of anti-Neu5Gc antibodies in normal humans: potential implications for disease. Glycobiology. 18 (10), 818-830 (2008).
- Padler-Karavani, V., et al. Human xeno-autoantibodies against a non-human sialic acid serve as novel serum biomarkers and immunotherapeutics in cancer. Cancer Res. 71 (9), 3352-3363 (2011).
- Cao, H., Chen, X. General consideration on sialic acid chemistry. Methods Mol Biol. 808, 31-56 (2012).
- Deng, L., Chen, X., Varki, A. Exploration of sialic Acid diversity and biology using sialoglycan microarrays. Biopolymers. 99 (10), 650-665 (2013).
- Liang, C. H., Hsu, C. H., Wu, C. Y. Sialoside Arrays: New Synthetic Strategies and Applications. Top Curr Chem. 367, 125-149 (2015).
- Song, X., Heimburg-Molinaro, J., Smith, D. F., Cummings, R. D. Glycan microarrays of fluorescently-tagged natural glycans. Glycoconj J. 32 (7), 465-473 (2015).
- Muthana, S. M., Gildersleeve, J. C. Glycan microarrays: powerful tools for biomarker discovery. Cancer Biomark. 14 (1), 29-41 (2014).
- Rillahan, C. D., Paulson, J. C. Glycan microarrays for decoding the glycome. Annu Rev Biochem. 80, 797-823 (2011).
- Heimburg-Molinaro, J., Song, X., Smith, D. F., Cummings, R. D. Preparation and analysis of glycan microarrays. Curr Protoc Protein Sci. 12 (10), (2011).
- Park, S., Gildersleeve, J. C., Blixt, O., Shin, I. Carbohydrate microarrays. Chem Soc Rev. 42 (10), 4310-4326 (2013).
- Struwe, W. B., et al. The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: sample preparation guidelines for reliable reporting of glycomics datasets. Glycobiology. 26 (9), 907-910 (2016).
- Liu, Y., et al. The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: improving the standards for reporting glycan microarray-based data. Glycobiology. , (2016).
- Hara, S., Yamaguchi, M., Takemori, Y., Furuhata, K., Ogura, H., Nakamura, M. Determination of mono-O-acetylated N-acetylneuraminic acids in human and rat sera by fluorometric high-performance liquid chromatography. Anal Biochem. 179 (1), 162-166 (1989).
- Padler-Karavani, V., et al. Cross-comparison of protein recognition of sialic acid diversity on two novel sialoglycan microarrays. J Biol Chem. 287 (27), 22593-22608 (2012).
- Padler-Karavani, V., Varki, A. Potential impact of the non-human sialic acid N-glycolylneuraminic acid on transplant rejection risk. Xenotransplantation. 18 (1), 1-5 (2011).
- Samraj, A. N., et al. A red meat-derived glycan promotes inflammation and cancer progression. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (2), 542-547 (2015).
- Pearce, O. M., Läubli, H. Sialic acids in cancer biology and immunity. Glycobiology. 26 (2), 111-128 (2016).
- Alisson-Silva, F., Kawanishi, K., Varki, A. Human risk of diseases associated with red meat intake: Analysis of current theories and proposed role for metabolic incorporation of a non-human sialic acid. Mol Aspects Med. 51, 16-30 (2016).
- Pearce, O. M., et al. Inverse hormesis of cancer growth mediated by narrow ranges of tumor-directed antibodies. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (16), 5998-6003 (2014).
- Pham, T., et al. Evidence for a novel human-specific xeno-auto-antibody response against vascular endothelium. Blood. 114 (25), 5225-5235 (2009).
- Reuven, E. M., et al. Characterization of immunogenic Neu5Gc in bioprosthetic heart valves. Xenotransplantation. 23 (5), 381-392 (2016).
- Ghaderi, D., Taylor, R. E., Padler-Karavani, V., Diaz, S., Varki, A. Implications of the presence of N-glycolylneuraminic acid in recombinant therapeutic glycoproteins. Nat Biotechnol. 28 (8), 863-867 (2010).
