O Canal de Excretory c. elegans como modelo para intracelular Lumen morfogênese e Vivo na biogênese de membrana polarizada em uma única célula: rotulagem por GFP-fusões, tela de interação de RNAi e Imaging

Summary

O canal excretor de c. elegans é um exclusivo modelo de célula única para a análise visual na vivo de biogênese de membrana de novo polarizada. Este protocolo descreve uma combinação de padrão genético/RNAi e abordagens, adaptávelas para a identificação e caracterização de moléculas dirigindo tubulogenesis unicelulares e apical da membrana e lúmen biogênese de imagem.

Abstract

Os quatro canais excretores de c. elegans são tubos estreitos estendidos através do comprimento do animal, de uma única célula, com quase igualmente longe estendido endotubes intracelular que construir e estabilizar o lúmen com uma membrana e submembraneous citoesqueleto de caráter apical. Excretor célula expande seu comprimento aproximadamente 2.000 vezes para gerar esses canais, fazendo com que este modelo exclusivo para a avaliação na vivo de biogênese de membrana de novo polarizada, morfogênese lúmen intracelular e unicelulares tubulogenesis. O protocolo apresentado aqui mostra como combinar o padrão de rotulagem, ganho e perda-de-função genética ou RNA de interferência (RNAi)-e abordagens microscópicas usar este modelo para dissecar visualmente e funcionalmente analisar esses processos em um nível molecular. Como um exemplo de uma abordagem de rotulagem, protocolo descreve a geração de animais transgénicos com proteínas da fusão fluorescente para análise ao vivo de tubulogenesis. Como um exemplo de uma abordagem genética, destaca pontos-chave de uma tela de interação baseada em RNAi visual projetado para modificar um fenótipo de ganho-de-função canal cístico. Os métodos específicos descritos são como: etiqueta e visualizar os canais expressando proteínas fluorescentes; construir uma biblioteca de alvo RNAi e strategize RNAi triagem para a análise molecular da morfogênese de canal; visualmente, avaliar as modificações dos fenótipos de canal; Pontuação deles dissecando a microscopia de fluorescência; caracterizar componentes subcelulares canal com resolução mais alta pela microscopia confocal; e quantificar parâmetros visuais. A abordagem é útil para o investigador que está interessado em aproveitar o canal excretor de c. elegans para identificar e caracterizar os genes envolvidos nos processos filogeneticamente conservados de lúmen intracelular e unicelulares morfogênese de tubo.

Introduction

Todos os órgãos internos são compostos de tubos, cruciais para suas muitas funções diferentes, tais como o transporte e a troca de gases, líquidos e nutrientes e a excreção de resíduos metabólicos. Seu caráter polarizado, com distintas membranas apicais e lumenal, é adaptado para essas funções específicas, e defeitos na biogênese dos seus sistemas de endo - e membrana plasmática são uma causa frequente de doença humana^1,2. A maioria dos tubos da vasculatura e dos órgãos internos é pluricelulares e forma um lúmen intercellularly; no entanto, tubos unicelulares, que formam o lúmen intracelular, podem, por exemplo, representar tanto quanto 30 – 50% dos leitos de capilares humano². As membranas polarizadas de multi - e tubos unicelulares são similares na composição, embora seus microdomains podem variar com base na função específica do tubo (por exemplo, canalículos canal excretor contra microvilli intestinal em Caenorhabditis elegans; Veja que acompanham o papel de c. elegans tubulogenesis intestinal)³. Os princípios da biogênese de membrana polarizada e tubulogenesis são conservados entre metazoários, e uma máquina molecular semelhante direciona-los^1,2,4.

O sistema excretor de c. elegans consiste de cinco células: a célula excretor (CE), célula de duto (DC), pore celular (PC) e duas células da glândula. Ablação do CE, DC ou PC faz com que o acúmulo de líquido na cavidade do corpo e os animais morrem em um início de fase larval⁵. Curiosamente, estes três tubos unicelulares criar seus lúmens de três maneiras diferentes: por célula esvaziamento (CE); envolvimento de célula juntamente com formação de junção autocellular (PC); e pelo envolvimento da célula, juntamente com autofusion (DC); diferentes mecanismos da morfogênese lúmen que são todas conservadas filogeneticamente^6,7. O CE, localizado na lateral esquerda do bulbo posterior da faringe, envia duas extensões laterais do que os quatro canais ramificam-se para estender-se anteriormente e posteriormente (ambos do lado direito e esquerdo) para a ponta do nariz do worm e cauda , respectivamente (Figura 1)^5,6,8. O CE estende-se desde aproximadamente 1 µm a 2 x 1.000 µm, tornando-se a célula maior no animal. Em um nível subcelular, o canal excretor é um tubo simples, gerado a partir de uma membrana basal, dirigida para a Trochozoa e um túnel por uma membrana lumenal (endotube). A membrana lumenal canal conecta-se à membrana lumenal adesiva em sua junção só intercelular; os canais são outra forma junctionless ao longo de seu comprimento (Figura 1). A membrana lumenal canal excretor e sua submembraneous citoesqueleto são apicais, definido por sua composição molecular que se assemelha a composição da membrana apical e submembraneous citoesqueleto de tubos multicelulares, tais como o intestino, e de outros epitélios (por exemplo, plana). Organelas citoplasmáticas, incluindo CDDP vesicular e outro (por exemplo, Golgi) endomembranes são distribuídos ao longo do comprimento do canal. Além disso, várias vesículas canaliculares - ligado à membrana lumenal, e/ou interligados ou isolada - são rosqueadas através do canal citoplasma^7,8,9,10 . Esta conexão de plasma-membrana/canaliculares dinâmico mais expande sistema de membrana do canal e contribui para ambos lúmen morfogênese e osmoregulação¹⁰. O canal excretor assim consiste quase inteiramente de endo - e membranas de plasma, proporcionando um excelente modelo para a análise de biogênese de membrana polarizada e o Regulamento do endo-a interface da membrana plasmática. A dramática expansão da membrana apical durante a morfogênese do canal - neste sistema de célula única coincidente com extensão de lúmen – também permite analisar os problemas arquitectónicos decorrentes da necessidade de estabilizar e centralizar uma membrana lumenal intracelular . Este protocolo centra-se na análise da morfogênese estrutural do tubo canal e do lúmen e a dinâmica da membrana intracelular necessária para este processo, em vez dos sinais que dirigem o movimento da célula que geram a posição da CE na sistema excretor e construir suas intrincadas conexões com outros elementos celulares (revistos em⁶).

Uma vantagem adicional do sistema de célula única canal c. elegans para a análise da membrana polarizada e biogênese intracelular lúmen é sua capacidade de separar, no tempo do desenvolvimento, a geração de diferentes componentes de suas membranas e entroncamentos. A CE é nascida no momento do encerramento ventral e resolve ventro-lateral da faringe durante meados embriogênese^5,6,8, durante o qual a extensão de tempo canal lateral e ramificação ocorrerem. Isto é seguido pela extensão do canal ântero-posterior durante a embriogênese atrasado, um processo que continua para o estágio larval de L1 (Figura 1). Em uma larva recém-eclodidos, a ponta do canal posterior atinge aproximadamente no meio do worm, totalmente estendendo-se até a cauda no final da fase L1, após o que o canal se alonga juntamente com o worm⁸. Crescimento do canal ativo a uma velocidade superior do crescimento do animal assim termina a primeira fase larval, no entanto, ainda mais o crescimento ocorre em paralelo com o crescimento do animal inteiro durante os estágios larvas adicionais (L2 – 4). Essa configuração fornece a oportunidade de analisar as diferentes etapas da biogênese de membrana de novo polarizada independente da divisão de células polarizada ou migração. Além disso, permite a separação deste processo da Assembleia dos cruzamentos (que ocorrem no embrião antes do início do lúmen); sua exigência exata na polarização de membrana é ainda uma questão em aberto no campo de polaridade. Finalmente, excepcionalmente separa apical de expansão de membrana basal, o último processo precede o anterior nos canais excretores¹⁰. O modelo de canal excretor de c. elegans , portanto, é um complemento particularmente informativo para o modelo intestinal que compartilha um número dessas vantagens para a análise de biogênese de membrana polarizada, mas executa-lo em uma configuração multicelular (ver o livro acompanhando sobre a tubulogenesis intestinal³).

Embora o selvagem-tipo canais são túbulos ultrafinos neste pequeno verme, seus lúmens podem ser visualized diretamente pela óptica Nomarski neste animal transparente. Na verdade, morfologias mutante canal cístico podem ser caracterizadas em animais sem rótulo usando baixa ampliação dissecando microscopia, que tem sido usada com grande efeito nas telas de genéticas para a frente para identificar genes envolvidos na tubulogenesis¹¹. Melhor visualização da morfologia dos canais e distinção de suas membranas polarizadas, componentes do citoesqueleto, diferentes organelas intracelulares e outras estruturas subcelulares, no entanto, exige a rotulagem e superior de energia fluorescente microscopia confocal e dissecação. Embora a estrutura de fina dos canais coloca uma série de dificuldades para a rotulagem e microscopia, membranas e componentes subcelulares podem ser distinguidos através das moléculas específicas exclusivas para cada compartimento, e animais podem ser montados com segurança para microscopia, por se certas precauções para evitar a introdução de artefatos (ver protocolo e discussão). Rotulagem pode ser feito por imuno-histoquímica em amostras fixas, ou através da geração de vermes transgênicos expressando proteínas da fusão fluorescente sob o controle de suas próprias ou excretoras promotores de canal específico para a imagem latente na vivo . Este protocolo descreve a última técnica de rotulagem (tubulogenesis intestinal para anticorpo que mancha³ver o papel de acompanhamento).

A habilidade de combinar estudos de perda ou ganho-de-função na vivo com na vivo de imagem análise na célula única nível ao longo do desenvolvimento faz o canal excretor de c. elegans um modelo particularmente forte para o molecular e análise celular de tubulogenesis unicelulares. Avanço ou retrocesso telas genéticas podem ser executadas iniciando com um animal transgénico selvagem-tipo ou etiquetado para identificar fenótipos de morfogênese de canal (por exemplo, cistos) e seus defeitos genéticos subjacentes. Alternativamente, tais telas podem começar com um fenótipo mutante (por exemplo, um canal cístico) e identificar supressores ou potenciadores deste fenótipo para identificar genes que interagem funcionalmente com o gene causando o fenótipo mutante. O defeito genético causando o fenótipo mutante pode induzir uma perda (por exemplo, através do apagamento do gene) ou um ganho (por exemplo, através de uma mutação de ativação ou através da introdução de cópias do gene em excesso) da função investigada. Encaminhar mutagênese ou RNAi sistemática telas são sem preconceitos em função dos genes e permitirem a identificação imparcial de genes envolvidos na função de interesse. Tendo em conta a disponibilidade de todo o genoma de RNAi alimentação bibliotecas, quase cada gene pode ser facilmente derrubado por RNAi em c. elegans, tal que qualquer único gene de interesse ou qualquer grupo de genes (por exemplo, em telas de alvo) pode também ser rapidamente analisado por seu efeito em uma abordagem genética reversa. Para demonstrar uma possível combinação de abordagens, aqui descrevemos uma tela de interação alvo RNAi, começando com um mutante de ganho-de-função cística canal excretor, rotulado com proteína de canal citoplasmática verde fluorescente (GFP). O fenótipo mutante foi gerado pela superexpressão de erm-1, um altamente conservadas c. elegans ortholog da família de vinculador de membrana-actina Ezrin-Radixin-Moesin (ERM), que tem sido implicados na morfogênese do lúmen e membrana organização em muitas espécies¹². C. elegans ERM-1 localiza-se às membranas lumenal dos órgãos internos, tais como o canal excretor e intestino e é necessário para a formação do lúmen em ambos¹³. MTC-1 superexpressão recrutas excesso actina e vesículas para a membrana lumenal canal, aumentando o fluxo no lúmen e gerando um curto canal cístico e uma membrana lumenal frisada com actina espessada subpêlo⁹. O protocolo descreve como gerar cepas transgênicas com canal excretor-expressa rotulado fusão proteínas (ou outras proteínas); como executar alvo RNAi telas começando com essas estirpes, para identificar os modificadores de um fenótipo de canal; e como analisar visualmente os resultados de tais telas por dissecação e confocal a microscopia de fluorescência, incluindo maneiras simples de quantificar fenótipos tubulogenesis informativo. Alternativa de rotulagem técnicas e detalhes de RNAi, ajustado para os genes tubulogenesis frequentemente letal, encontram-se no livro de acompanhamento sobre tubulogenesis intestinal³. Todos os métodos podem ser usados em várias combinações para a investigação de outras perguntas no canal tubulogenesis.

Protocol

1. rotulagem do c. elegans Excretory Canal por proteínas fluorescentes fusão ¹⁴

Nota: consulte o documento que acompanha na intestinal tubulogenesis ³ para a rotulagem pelo anticorpo em situ coloração procedimentos adaptáveis ao canal excretor. Consulte a tabela 1 para obter exemplos de moléculas provados útil para a visualização de c. elegans canal excretor endo - e membranas de plasma, a tabela 2 para obter exemplos de promotores dirigindo a expressão para o canal excretor, e Tabela 3 para recursos mais abrangentes coleções de marcadores e promotores, incluindo referências a discutir a seleção de diferentes fluorophores.

1. Construção de plasmídeos de marcador fluorescente específico do tecido por enzima de restrição com base clonagem ¹⁵
   Nota: consulte a discussão de técnicas alternativas de construção proteínas de fusão fluorescente.
   1. Identificar a sequência do promotor (para fusões transcricionais) ou inteiro do gene de interesse com seu promotor (para fusões translacionais) WormBase ⁴⁴.
      Nota: para os promotores, cerca de 1 – 3 quilobase (kb) é suficiente para a maioria dos genes de c. elegans. Proteínas da fusão traducional também podem ser construídas pela colocação de um gene de interesse no âmbito de um promotor específico canal excretor (ver quadro 2).
   2. Design para diante e reversos primers para amplificação do promotor (para fusões transcricionais) e/ou um gene completo com promotor (para fusões de translação). Adicionar a enzima de restrição linkers no 5 ’ e 3 ’ extremidades dos primers.
      Nota: Escolha as enzimas de restrição que estão presentes no vetor do plasmídeo (por exemplo, pPD95.79) ¹⁶. Para fusões de translação, a 3 ’ vinculador deve ser projetada para que após a digestão da enzima de restrição e ligadura com o vetor, o quadro de códon de inserção será contínuo com os códons do fluoróforo, por exemplo, as boas práticas agrícolas. Um pode precisar adicionar bases mais 1 ou 2 para a enzima de restrição típica linkers ¹⁴; Tome cuidado para não criar um codão stop.
   3. Polimerase realizar reação em cadeia (PCR) para amplificar o promotor ou o gene completo usando minhocas vivas ou DNA genômico do selvagem-tipo ou cDNA como modelo ¹⁵.
      Nota: Ao usar minhocas como modelo, primeiro lyse vermes em lysis buffer (buffer PCR mais Proteinase K) ¹⁷. Vermes de fase mista podem ser utilizados como modelo. Sedentos de vermes podem ser usados para evitar a contaminação com DNA bacteriano.
   4. Executar agarose (1%) gel de electroforese em produtos do PCR para identificar o tamanho correcto do produto amplificado.
      Nota: Se tamanho de banda está correto, prosseguir com o próximo passo. Se várias bandas são geradas, melhorar as condições de amplificação para produzir a única banda. Se isso não funcionar, cortar a banda correta do gel e purificar DNA por métodos padrão ¹⁵ e então prosseguir com a próxima etapa.
   5. Executar digest de restrição sobre o produto do PCR e o plasmídeo vetor que contém o fluoróforo (por exemplo, pPD95.79) em tubos separados por métodos padrão ¹⁵.
   6. Separar os DNAs digeridos pela electroforese do gel e eluir o produto do PCR e vector de bandas de DNA em tubos separados.
   7. Purificar os DNAs de gel de fatias por métodos padrão de ¹⁵. Medir a concentração de DNA por Espectrofotômetro.
   8. Ligate o produto do PCR e DNA do vetor por métodos padrão e transformar os DNAs recombinantes em células competentes por métodos padrão ¹⁵.
   9. Espalhar 10 μL, 50 μL e 100 μL de células transformadas em três pratos individuais do caldo Luria (LB) suplementados com 50 ampicilina μg/mL.
      Nota: Espalhe quantidades diferentes de células em placas diferentes para um espectro de eficiências de transformação. Por exemplo, chapeamento demasiado densamente pode não permitir o isolamento das colônias se transformação é eficiente.
   10. Incubar as placas a 37 ° C durante a noite. Na manhã seguinte, retire as placas da incubadora.
       Nota: Se as colônias são muito pequenas, incubar durante várias horas mais.
   11. Preparar plasmídeo DNAs das colônias única por métodos padrão de ¹⁵. Misturar o ADN do molde e os primers e enviar para o sequenciamento (normalmente realizado em um centro de serviço do núcleo).
   12. Ler as sequências e verificar a integridade da construção de fusão.
       Nota: crítica: confirmar o quadro de códon correta entre o gene inserido e gene marcador fluorescente para fusões de tradução. Idealmente, sequenciar o gene inteiro para confirmar que nenhuma mutação foi introduzida durante os procedimentos de PCR e ligadura.
   13. Gerar mais Plasmídeo (usando passo 1.1.11) para injeção para etapa 1.2.
2. Geração de animais transgênicos por microinjeção de DNA para a transformação do germline ¹⁸
   Nota: consulte a discussão de técnicas alternativas para a introdução de transgenes. Os procedimentos descritos podem ser usados para gerar animais transgénicos que carregam uma proteína de fusão de fluorescência ou qualquer outra proteína de interesse. Por exemplo, uma proteína exógena pode ser recém introduzidos (por exemplo, um ortholog heterólogo) ou uma proteína endógena pode ser reintroduzida (por exemplo, seu correspondente germline mutante para resgate) ou overexpressed para gerar um fenótipo (por exemplo, injeção MTC - 1 foi usado para gerar o fenótipo do canal cístico superexpressão que serve como o destino para a modificação por tela de interação de RNAi descrita abaixo). DNA de construção
   1. Mix (1 – 50 ng/μL) com marcador plasmídeo (tipicamente 100 ng/μL), por exemplo, o marcador dominante rol-6 (su1006) (ver 1.2.3 para opções de marcador).
      Nota: crítica: concentração de DNA injetado deve ser determinada empiricamente para evitar a introdução de fenótipos artefactual (cistos, defeitos de extensão, letalidade) quando expressar genes nos canais excretores que são particularmente sensível à expressão de transgenes. Pode, por exemplo, fazer várias misturas de plasmídeos em concentrações de 10 ng/μL 1 ng / µ l, 50 ng/μL e 100 ng / µ l com 100 ng/μL rol-6(su1006) para testar uma gama de concentrações para a geração de uma cepa viável com o expressão desejada ou fenótipo (altas concentrações são susceptíveis de ser não-especificamente tóxico para morfogênese de canal e pode ser letais).
   2. Filtrar a mistura de DNA num filtro de tubo centrifugador do 0.22-μm (micrômetro) poros tamanho spin-x.
      Nota: Não deixe a tampa do tubo aberto para evitar a poeira que pode bloquear as agulhas de microinjeção.
   3. Microinjeção plasmídeo recombinante na gônada do selvagem-tipo ou mutantes vermes por métodos padrão para a transformação do germline (ver referência ¹⁸ para obter detalhes de procedimento).
      Nota: Plasmídeos de marcador padrão são, por exemplo: rol-6(su1006), dpy-20, unc-119, pha-1. Transgenes dominantes como rol-6(su1006) são introduzidos em minhocas do tipo selvagem, Considerando que transgenes resgatando são introduzidos em seus respectivos mutantes. Plasmídeos de marcador são co injetados para fácil manutenção das linhas transgénicas desde transgenes extracromossômico são aleatoriamente perdidos durante a divisão celular (ver 1.2.8). Quando injetar genes que codificam para fusões fluoróforo, também pode utilizar o fluoróforo, GFP, em si como marcador. rol-6 induz worms para rolar em torno de si mesmos que muitas vezes é vantajoso para a avaliação dos fenótipos morfogênese.
   4. Transferência injectada vermes em Escherichia coli semeado placas nematódeo crescimento médio (NGM) (por exemplo, 5 vermes/placa) (ver referência ¹⁹ para padrão c. elegans cultura e manutenção de procedimentos e Tabela de materiais).
   5. Incubar as placas e deixar descendência desenvolver-se a 20 ° C por cerca de 3 m.
   6. Examinar a progênie F1 sob o microscópio dissecação para Rol (rolamento) vermes (ou qualquer outra injeção específico marcador, por exemplo, GFP) e escolher rolos tpratos individuais o.
   7. Escolher placas com rolamento animais F2 e confirmar a presença de fluorescência sob um microscópio de fluorescência a dissecação (geralmente todos os animais de rolo são GFP positiva).
      Observação: Rolos de F2 indicam a geração bem sucedida de uma linha de transgénica. As linhas individuais podem ser diferentes, por exemplo, no que se refere a taxa de transmissão do transgene. Portanto, é útil manter e armazenar várias linhas.
   8. Manter as linhas transgénicas enriquecendo novas placas para animais marcador positivo.
      Nota: O DNA injetado é incorporado o germline como uma matriz extracromossômico. Taxas de transmissão para matrizes extracromossômico são variáveis, mas geralmente em torno de ~ 50%. Para não perder a pressão, portanto, é fundamental para enriquecer manualmente as linhas com marcadores dominantes (por exemplo, as linhas não garantidas por seleção negativa).
   9. Congelar linhas transgénicas por técnicas padrão de congelamento para armazenamento de longo prazo a-80 ° C ¹⁹.
      Nota: Transgenes em matrizes extracromossômico também pode ser integrado no germline por irradiação UV em uma etapa adicional para produzir linhas homogênea ¹⁸. Por exemplo, MTC-1 foi integrado o germline por irradiação UV para obter a tensão de ERM-1 + [+] fgIs2[erm-1p::erm-1;rol-6p::rol-6(su1006)] onde cada animal carrega o transgene, um requisito para a sua utilização na base de RNAi tela de interação descrita abaixo. Esta estirpe foi rotulada adicionalmente pelo canal excretor citoplasmática GFP através de cruzamento em uma cepa contendo um vha - 1p:: GFP transgene (gerado pelos mesmos procedimentos acima descritos; consulte referência ²⁰ para basic genética procedimentos como Cruzes) e é referido como ERM-1 [+ +]; VHA - 1p:: tensão GFP abaixo.

2. Construção de uma biblioteca de RNAi direcionados e Design de uma tela de interação de RNAi para modificar um fenótipo de Canal

Nota: uma tela de alvo RNAi-based interação genética é descrita que usa um fenótipo de canal cístico superexpressão de busca por genes de morfogênese interagindo canal excretor. A estirpe de ERM-1 + [+] (consulte a etapa 1.2.9) serve como exemplo ⁹. Esta abordagem apresenta apenas uma das muitas possíveis abordagens para a análise genética da morfogênese de lúmen canal excretor (ver introdução e discussão para outras abordagens genéticas). Consulte o documento que acompanha em tubulogenesis intestinal ³ e referências ^{17 , 21 , 22} para segundo plano na RNAi, detalhes de RNAi procedimentos, modulação da força de RNAi (ajustada para os genes tubulogenesis muitas vezes letais) e discussão dos problemas técnicos ligados a RNAi. Ver referência ¹⁹ para a cultura padrão worm e tabela de materiais e manutenção.

1. Moléculas interagindo de busca para ERM-1 (ou outro gene de interesse) em bancos de dados e artigos publicados.
   Nota: Potencial ERM-1 interactianos incluiria todas as moléculas que foram mostradas experimentalmente funcionalmente, geneticamente ou fisicamente interagir com proteínas ERM em qualquer espécie e/ou foram previstas para fazê-lo por qualquer no silico, alta taxa de transferência ou biologia de sistemas abordagem (ver tabela 3 para obter exemplos de bancos de dados e recursos).
2. Gerar uma lista de todos os genes e encontrar c. elegans homologs quando necessário.
   Nota: Considerar expandir a lista de genes identificados para classes de gene, que leva em consideração a função do gene de interesse e amplia a rede para identificar os interactianos (por exemplo, para o vinculador de membrana-actina ERM-1, selecione todas as regras e as moléculas de actina-relacionados).
3. Identificar o correspondente RNAi bacteriano clones em comercialmente disponível todo o genoma bacteriano RNAi bibliotecas para todos os genes de alimentação (por exemplo, Ahringer genômica c. elegans RNAi biblioteca ²¹ de alimentação; Tabela de materiais)
4. Gerar uma planilha para todos os genes e sua correspondente placa de RNAi e número bem.
5. Pegam e raia ~ 50 RNAi clones em placas LB/ampicilina/tetraciclina (escolha do antibiótico é determinada pela construção da biblioteca) por dia e continuar até o alvo RNAi biblioteca é gerada.
   Nota: Dependendo do tamanho da biblioteca e fluxo de trabalho projetado, omitir a geração de uma biblioteca completa e prosseguir diretamente com análise de lote. As placas podem ser armazenadas a 4 ° C, para não mais do que cerca de 2 semanas (se necessário, re-raia nas chapas de novas depois disso). Por outro lado, um pode gerar maiores bibliotecas congeladas em formatos de 96 poços ou 384-bem replicar para armazenamento a longo prazo a -80 ° C.
6. Incubar as placas a 37 ° C durante a noite. Na manhã seguinte, remover placas da incubadora e loja a 4 ° C.
7. Escolher RNAi bactérias de uma placa por um palito estéril, mistura de bactérias com 600 μL LB/ampicilina (50 ng/μL) caldo de carne em microtubo de 1,5 mL, incubar os tubos a 37 ° C, agitar durante 6 h.
   Nota: Inocular RNAi bactérias no caldo, esfregando o pick (ponta de palito de dente ou micropipeta) ao longo do lado do microtubo.
8. Semente 70 μL cultivadas bactérias em cada poço de chapas de RNAi 6-poços em duplicado ou triplicada de moda. Incubar as placas de RNAi a 22 ° C durante a noite.
   Nota: Placas de RNAi são geradas por procedimentos padrão (Tabela de materiais e referências ^{3 , 17 , 21}) e aqui são usadas em um tecido de 6-poços formato da placa de cultura para uma abordagem de taxa de transferência maior que ainda permite a avaliação microscópica da morfogênese de canal em animais vivos nas placas.
9. Próxima manhã, pegar 3 L4 palco ERM-1 [+ +]; VHA - 1p:: GFP vermes em cada poço das placas de RNAi.
   1. Para evitar a contaminação com bactérias OP50 (ver referência ¹⁹) que interferem com RNAi primeiro propagar os vermes em um prato NGM sem bactérias e deixar os animais a rastejar por cerca de 10 min. Use somente animais saudáveis não de fome.
10. Incubar as placas a 22 ° C para 3-d permitir que os animais produzir descendência.
11. Fenótipos de canal Examine em progênie F1 sob o microscópio de fluorescência dissecação.

3. Na Vivo Imagem do Canal c. elegans Excretory por microscopia de fluorescência dissecando e marcando de fenótipos Tubulogenesis

1. Prepare uma folha de Pontuação do fenótipo (exemplo mostrado na tabela 4 e Figura 5 ).
2. Coloque a placa de ágar com vermes diretamente sob o dissectin de fluorescênciamicroscópio de g, tampa aberta do prato para avaliação, use menor ampliação concentrar-se.
   Nota: Este protocolo descreve o uso de um escopo com 1.5 X e 10 X objetivos e uma faixa de zoom de 3.5 a 45 (Tabela de materiais).
3. Avaliar animais pelo cada um focando bem separadamente, começando com 1 bem e trabalhar abaixo da placa.
   Nota: Sempre começam com a avaliação dos controles. Por exemplo, um mock (vetor vazio) controle (RNAi HT115 bactérias (ver referências ^{17 , 21}) sem ou com uma inserção de gene relacionado) negativo e adequado positivo controla, por exemplo, em Esta tela de interação, MTC-1 RNAi (suprime o fenótipo de ERM-1 + [+]) e sma-1 / spectrin RNAi (aumenta o fenótipo de canal de ERM-1 + [+]).
4. Primeiro, examinar gerais fenótipos visíveis sob a luz brilhante (por exemplo: Let/letal, Clr/limpar, Emb/embrionário letal, Ste/estéril, Unc/descoordenada, Dpy/atarracado, etc.), quantificar o fenótipo pela contagem do número total de animais e número dos animais com o fenótipo, gravar os números (ver quadro 4).
   Nota: Para knockdowns de genes que causam defeitos que possam afectar a avaliação dos fenótipos de canal (por exemplo, Emb, Ste), considerem repetir o experimento com condicional, post embrionário RNAi (veja que acompanha o papel para procedimentos ³ ).
5. Em segundo lugar, examinar os fenótipos de canal excretor sob luz fluorescente, marcar fenótipos quantificáveis (por exemplo, comprimento de canal, largura do lúmen, cistos), gravar os números e descrever fenótipos em uma folha de Pontuação (ver quadro 4, < classe forte = "xfig" > Figura 5).
   Nota: Maior ampliação com faixa de zoom é necessária para avaliar mais fenótipos canal sutil. Mover para a frente e para trás entre baixa e alta ampliação para avaliar cuidadosamente o canal ’ s comprimento e largura e qualquer outro fenótipo de morfogênese de canal. Para a quantificação ou semi quantificação dos fenótipos simples, conta 100 animais (por exemplo, L4s neste alvo RNAi ecrã; fenótipos: canal comprimento de 1/4, 1/2, 3/4 e a completa extensão dos canais posteriores e diâmetro do lúmen dos canais posteriores, pequeno cistos (< 1/3 da largura do animal), cistos grandes (> 1/3 da largura do animal); Ver quadro 4).
6. Adquirir imagens dos fenótipos predominantes de pelo menos 3 diferentes animais por um microscópio montado câmera digital dispositivo de carga acoplada (CCD) e software de imagem correspondente (ver Tabela de materiais)
   1. para adquirir imagens, Primeiro ligue a câmera, liga o computador ligado, duplo clique no ícone de software de captura de imagem, focar uma área da placa de worm manualmente baixa ampliação e abrir o obturador da câmera.
   2. Clique no “ visualização ao vivo ” ícone do software de captura de imagem na tela do computador para visualizar os vermes na tela do computador, ajustar o foco manualmente para claramente Visualizar os vermes na tela, em seguida, clique o “ estalar ” ícone, então Clique o “ salvar ” ícone.
      Nota: Animais moverá mais rápido sob luz fluorescente, portanto, manter uma mão no rato do computador pronto enquanto se move a placa para a área de interesse com a outra mão. Clique prontamente o “ estalar ” ícone para adquirir a imagem. É geralmente possível adquirir uma boa imagem com várias tentativas.
   3. Salvar as imagens adquiridas com um nome de arquivo apropriado (incluir nome de estirpe, clone RNAi e data).
      Nota: Mais rápido em movimento selvagem-tipo vermes com canais finos e longos são mais difíceis de imagem do que mutantes. Os mutantes com canais císticas e/ou outros fenótipos são prováveis que se movem lentamente, facilitando assim a imagem. Plasmídeos de marcador como Rol podem ser útil para tratamento de imagens mantendo animais “ no local ” ao invés de movendo-se para a frente e pode também fornecer uma melhor visão sobre o fenótipo com o animal rolando em torno de si.

4. Imagem do Canal c. elegans Excretory em alta resolução por Laser microscopia Confocal de varredura

1. de animais vivos de montagem
   1. Coloque uma pequena quantidade de graxa ou vaselina na ponta de um cotonete ou a ponta da dedo do índice e espalhar a graxa para gerar um círculo ultrafino com um diâmetro de ~ 6 – 8 mm no meio de uma lâmina de vidro limpa.
   2. Lugar 6 μL solução 5% lidocaína (anestésica) para dentro do círculo por uma micropipeta.
      Nota: Uma solução de lidocaína pode ser feita dissolvendo-se pó de lidocaína na água. Dilua a 5% com M9 reserva ¹⁹ (Tabela de materiais). É fundamental para a análise do canal excretor para evitar as soluções imobilização comuns (tais como azida de sódio) que causa cistos a ruptura e que induzir fenótipos canal.
   3. Escolher vários animais de uma placa de RNAi e colocá-los para a solução de lidocaína por imersão o worm picareta ¹⁹ na solução.
      Nota: De preferência escolha animais de palco específico que facilitarão a montagem mesmo pela espessura uniforme. Animais podem pré-seleccionar sobre o microscópio de fluorescência dissecação.
   4. Colocar uma lamínula 22 x 22 mm a lâmina de vidro; deixa-lo suavemente-se no círculo graxa.
      Nota: Não aplique qualquer pressão física na lamela que pode danificar a morfologia do canal, especialmente em mutantes ou worms de RNAi tratado com canal e possivelmente outros fenótipos. É importante, portanto, para evitar um círculo de graxa espessa; Idealmente, animais suavemente são imprensados entre a lâmina de vidro e lamínulas.
   5. Escrever o nome da amostra do lado do slide vidro fosco. Leve imediatamente o slide para o microscópio confocal para análise do fenótipo de canal e para adquirir imagens.
      Nota: Atrasos podem resultar em danos de cistos do canal ou mudança na morfologia de lúmen canal.
2. Adquirir imagens confocal
   1. colocar o slide no palco amostra do microscópio confocal, concentram os vermes em pequeno aumento (10 X).
   2. Modo de exibição e selecione animais sob 60 X e/ou 100 objetivos X, examinar o canal excretor ’ celular s e fenótipos subcellular, por exemplo, forma de lúmen e diâmetro, tamanho e forma dos cistos; ou os componentes subcelulares rotulados para análise, por exemplo,, membrana apical/lumenal, membrana basal, citoplasma, CDDP contra vesículas canaliculares, outras organelas (ver discussão, Figura 2 e Figura 4).
   3. Adquirir imagens do fenótipo de interesse específico.
      Nota: Este protocolo descreve o uso de um laser confocal microscópio (Tabela de materiais). Para resolver componentes subcelulares no fino c. elegans canais excretores, objectivos de ampliação mais elevados (60 X 100 X) são necessários. Um microscópio confocal-disco giratório pode ser usado para adquirir imagens de lapso de tempo, mas oferece menos confocality (ver discussão).
      1. Para adquirir imagens confocal, ligar o computador, clique duas vezes sobre o software do microscópio confocal e selecionar o laser clicando em um ícone específico do laser.
      2. Clique o “ varredura ” ícone para visualizar o worm focado na tela do computador, ajuste a intensidade do laser através da software e clique novamente em “ varredura ” ícone para parar a varredura e, em seguida, clique em “ capturar ” ícone para capturar uma imagem e, em seguida, clique em “ salvar ” ícone.
      3. Salvar imagens com nome de arquivo apropriado e incluir o nome do clone de RNAi, estirpe e data.
         Nota: As imagens podem ser adquiridas como single e várias seções (por exemplo, 10 – 15 seções ao longo do eixo z). De corte permite a visualização em 3D. Adquirir imagens de projeção e salvar separadamente, se necessário (dependendo do microscópio). Para resolução ideal, use as configurações do laser com baixo ganho, não abrir muito o pinhole e adicionar vários em média por imagem (ver referências no ^{24 23 ,} para discussão geral de imagiologia confocal). Tome cuidado para adquirir imagens com um brilho abaixo do nível de saturação para permitir a modificação pelo software de imagem, se necessário (de preferência de uso sem modificações de imagens).
      4. Adquirir imagens de duplo - ou multiplicar rotulados canais (por exemplo, verde, vermelho e azul), da mesma forma, clicando nos ícones do laser múltiplos, mas usar a varredura sequencial para evitar infiltração entre canais (críticos para estudos de localização co).
         Nota: Um pode precisar levar em consideração o tempo necessário para fazer a varredura sequencial (que também resulta em um correspondente aumento na foto branqueamento) e modificar as configurações do scanner. Não examina animais de um slide para mais de 30 min máximo para evitar efeitos inespecíficos na morfologia do canal. Montar o novo slide se digitalização mais é necessário.
      5. Adquirir óptica correspondente de interferência diferencial (DIC) / imagens de Nomarski, particularmente se quantificar canal diâmetro comprimento e lúmen em relação o verme ’ s corpo comprimento e diâmetro. Sobreposição de fluorescência e imagens de Nomarski clicando no “ sobreposição ” ícone para demonstrar Marcos ( Figura 1 e Figura 4A – D).
   4. Para quantificação, medir a intensidade de fluorescência de um componente rotulado de interesse pelo ImageJ software ²⁵ ( Figura 5).

Representative Results

Este protocolo descreve como usar os canais excretores de c. elegans visualmente e molecularmente analisar tubulogenesis unicelulares e morfogênese lúmen intracelular em uma única célula. Durante sua extensão da época do meio da embriogênese até a idade adulta, os quatro canais excretores continuam a expandir seus basolateral e apical/lumenal membranas juntamente com seu sistema endomembranoso canalicular e CDDP, fornecendo um modelo exclusivo para a análise na vivo de novo polarizada biogênese de membrana (Figura 1). Componentes subcelulares como membranas apicais, o citoplasma e CDDP contra vesículas canaliculares podem ser visualizadas por expressar proteínas da fusão fluorescentes específicos (descritas no protocolo, seção 1), e eles podem ser distinguidos uns dos outros por duplicar ou triplicar a rotulagem em um único animal transgénico (Figura 2). Um fenótipo de único canal excretor (Figura 3A-B) gerado pela superexpressão de uma molécula de membrana apical associada (ERM-1), é usado para demonstrar como executar uma alvo RNAi tela para identificar genes funcionando na membrana apical e biogênese de lúmen; Isto serve como um exemplo de uma análise molecular e visual de biogênese de membrana polarizada nesse modelo (descrito no protocolo secção 2). Este fenótipo de canal de ERM-1 + [+] é usado para demonstrar como avaliar visualmente e supressão de Pontuação (Figura 3-D) e reforço (Figura 3E– F) dissecando a microscopia de fluorescência (descrita no protocolo seção 3) . Fenótipos de canal induzidos pela modulação da MTC-1 níveis servem para mostrar como resolver defeitos a nível subcellular por microscopia confocal (Figura 4) (descritos no protocolo seção 4) e como quantificar os fenótipos de canal simples (comprimento do canal e cisto tamanho) e defeitos de biogênese de membrana apical (Figura 5).

Figura 1 : Morfogênese da c. elegans Excretory Canal e estruturas subcelulares do Canal
(A) representação esquemática da extensão do canal excretor (linhas azuis) durante o desenvolvimento do embrião e larva. A célula excretor atinge sua localização final no lado esquerdo do ventro-lateral do bulbo da faringe posterior na fase de vírgula do embrião (não mostrado). Como o embrião se alonga, primeiro estende-se dois braços lateralmente para os lados esquerdo e direito; Então cada braço bifurca em um ramo anterior e posterior. Estes ramos anterior e posterior estendem ainda mais ao longo do alongamento do animal durante quatro estágios larvais, primeiro alcançando com o crescimento do animal na fase L2 e, em seguida, acompanhando seu crescimento, até a idade adulta. De novo polarizada membrana biogênese suporta esta extensão até a idade adulta. (B) no animal adulto, os ramos de canal anterior alcançar a ponta do nariz e os ramos posteriores, a cauda (linhas azuis). O corpo celular excretor é mostrado perto do bulbo da faringe posterior (azul). Domínios de membrana polarizada são mantidos durante a vida adulta. (C) ampliado vistas de uma seção do braço de canal. Esquerda: vista 3D do canal mostra: membrana basal (preta), citoplasma (azul), membrana lumenal (verde) e o lúmen (branco). Direita: dentro de vista para o canal e suas membranas: membrana basal (preta), citoplasma (azul), endossomos (amarelos ovais), vesículas canaliculares (esferas brancas, vesículas única conectadas a cada outros, conectada ao lúmen ou isolado), membrana apical (verde) e o lúmen (branco). (D) Confocal/DIC micrografias de sobreposição da célula excretor em um embrião e os canais excretores em uma larva, rotulado por lumenal contra GFP citoplasmática, respectivamente. Imagem à esquerda: excretor célula (seta verde) em um 1.5-fold embrião, com lúmen canal visualizado expressando apical ERM-1::GFP sob o promotor erm-1 . Imagem direita: quatro excretor canal Ramos (seta verde) em larvas L3, visualizados pela citoplasmática vha - 1p:: GFP. Escala de barras = 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 : Visualizando componentes subcelulares nos braços do selvagem-tipo Canal excretor através da dupla marcação com proteínas da fusão fluorescente
(A) distinguem a membrana apical do citoplasma. Expressão de GFP sob o promotor sulp-5 visualiza o citoplasma de canal (verde, em cima); expressão de ERM-1::mCherry sob o seu próprio promotor visualiza a membrana apical (vermelho, médio); mesclar essas imagens (em baixo) distingue entre o citoplasma e a membrana apical que seria indistinguível através da marcação única mesmo em alta ampliação. Barra de escala = 5μm. (B) determinação das relações espaciais das vesículas CDDP ao lúmen. Visualização do lúmen por uma apical da membrana-associado GFP proteína da fusão (pseudo cor ao vermelho, topo); visualização das vesículas CDDP expressando mCherry::RAB-7 (pseudo cor ao azul, meio); mesclar essas imagens (em baixo) mostra a posição espacial relativa dos CDDP vesículas para o lúmen. Barra de escala = 5μm. (C e D) Resolvendo as formas de tubo de canal versus componentes subcelulares canal em diferentes ampliações. O citoplasma das larvas L1 é rotulado expressando GFP sob o promotor sulp-5 e vesículas canaliculares citoplasmáticas expressando o canal de água AQP-8::mCherry sob o promotor aqp-8 . (C) imagens adquiridas na ampliação baixa resolver um padrão de "grânulos-em-um-corda", correspondente ao estágio específico as varizes (varizes são abundantes em vesículas canaliculares e outros componentes necessários para o crescimento do canal de reservatórios), mas fazer não resolva citoplasmática partitura AQP-8. (D) imagens adquiridas na maior ampliação resolvem AQP-8 partitura no citoplasma canal, correspondente a vesículas canaliculares. Barras de escala: 20 μm em C e 5 μm em D. Todos os painéis mostram projeções confocal de 10 – 15 seções cada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 : Pontuação potenciadores e supressors de um fenótipo de Canal cístico (ERM-1[++]) por microscopia de dissecação
(A) MTC-1 [+ +]; rol-6(su1006) de canais excretores são visualizados expressando GFP sob um promotor vha-1 . Canais posteriores estendem-se até a vulva ou meados do corpo do animal (setas; considerado como extensão de 1/2) na ampliação baixa (1,5 X objetivo e zoom baixo). (B) a maior ampliação, o canal assinatura ERM-1 + [+] pequeno-cística frisado pode ser resolvido, com a ponta dos canais posteriores (um braço indicado pela seta pequena) estendendo acima da vulva ou ligeiramente além (canal vulva indicado pela seta larga; lúmen no painel D pode ser considerado como tipo selvagem para comparação). (C) supressão, baixa ampliação: alongados e finos canais em RNAi trataram animais ERM-1 + [+]. (D) a maior ampliação, canais posteriores podem ser vistos quase totalmente estender à cauda (setas pequenas, comparado com o de animais progenitores, mostrados no painel B); grande seta indica a posição da vulva. (E) realce: mais encurtados canais com cistos maiores em RNAi trataram animais ERM-1 + [+]; baixa ampliação, sem zoom. (F) na maior ampliação, extensão do canal posterior pode ser determinado como menos de 1/2 (seta pequena) ou não estendido até a vulva (indicado pela seta grande) e o tamanho do cisto como superior a 1/3 da largura do animal (mais ampla do que o animal progenitor mostrado em B). Escala de barras = 400 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4 : Análise visual do Canal excretor morfologia e componentes subcelulares Canal em mutante/RNAi animais por microscopia Confocal
(A-D) Distinguir um vacuolar de um fenótipo de canal cístico (confocal/DIC sobreposição micrografias são mostradas). (A) o citoplasma de um canal de tipo selvagem é visualizado expressando GFP sob o promotor sulp-5 (pseudo cor para azul na distinção da membrana apical, etiquetando, mostrados em verde no painel B). (B) a membrana apical de um canal de tipo selvagem é visualizada por expressar ERM-1::GFP; Observe que lúmen não é visível a esta ampliação e essa rotulagem simples não consegue distinguir citoplasmática da membrana de rotulagem. (C) o fenótipo do canal excretor induzida por RNAi: rotulagem citoplasmática não pode distinguir vacúolos citoplasmáticos de cistos intralumenal. (D) o fenótipo do canal excretor induzida por RNAi: rotulagem Apical ERM-1::GFP detecta o acúmulo de líquido no interior do lúmen, identificação de cistos (lumenal) ao invés de vacúolos (citoplasmáticos) (compare figura 4I para vacúolos citoplasmáticos). Barra de escala = 40 μm para A – D, mostrada na. (E-J) analisando efeitos de perda e ganho-de-função em componentes subcelulares canal (imagens confocal de braços de canal único são mostradas). (E-G) Efeito de erm-1 RNAi sobre a Localização subcellular de canalículos. (E) citoplasma de canal de tipo selvagem; Observe o lúmen indicando de exclusão de GFP. (F) selvagem-tipo citoplasmática AQP-8::GFP partitura, correspondente a vesículas canaliculares. (G) citoplasmáticos e deslocamento basal de partitura AQP-8::GFP em erm-1(RNAi) animal. Lúmen descontínuos (H) e detalhe de patologia de ponta de lúmen (ondulação e perda de centralização de lúmen) no erm-1(mildRNAi) animal (ver³ para modulação de força de RNAi); Observe que o citoplasma do canal se estende além da ponta do lúmen, aqui indicado por pequenos cistos. (I) vacúolos citoplasmáticos em corpo de canal excretor sem qualquer extensão do canal em fortemente afetado erm-1(RNAi) animal³; Observe que o ACT-5::GFP não é recrutado para o lúmen (exceto várias pequenas manchas ao redor de alguns vacúolos). (J) recrutamento de excesso ACT-5::GFP e AQP-8::mCherry para o lúmen triplo animais transgénicos superexpressão ERM-1 (cinto grosso nota de ACT-5::GFP e sobreposição AQP-8::mCherry aglomerados em torno do lúmen cístico). Barra de escala = 5 μm para E-J, mostrado no E. , por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5 : Exemplos de quantificação dos defeitos de Canal pela microscopia Confocal e dissecação
(A) representação esquemática de tipo selvagem (painel superior) e mutante cística (painéis inferiores) canais excretores para quantificação de tamanho de comprimento e cisto do canal. Comprimento do canal posterior é quantificado como 0, 1/4, 1/2, 3/4 e 1. Comprimento de canal '0' não indica nenhuma extensão e '1' indica extensão longa-metragem. Tamanho do cisto é quantificado como < 1/3 (pequeno) e > (grande) para 1/3 do diâmetro do corpo. (B) a quantificação da morfologia do canal bruto no controle e ERM-1 + [+](RNAi) animais por fluorescentes dissecando a microscopia. Na simulação animais(RNAi) MTC-1 + [+], o comprimento do canal posterior é cerca de 1/2 estendido em 95% de animais (imagem de referência, Figura 3A-B). Em animais de supressor de ERM-1 + [+](RNAi) , comprimento do canal posterior é quase totalmente estendido em animais de 80-90% (imagem de referência, Figura 3-D). Em animais de ERM-1 + [+](RNAi) potenciador, aproximadamente 60-70% canais têm grandes cistos e menor comprimento (< 1/2) (imagem de referência, Figura 3E– F). Os dados apresentados como média ± DP (n > 3). (C) a quantificação da intensidade de fluorescência do citoesqueleto apical/lumenal canal pelo ImageJ imagens confocal. Membrana apical do canal é rotulada por ACT-5::GFP, braço do selvagem-tipo canal está indicado para o braço esquerdo, do canal de ERM-1 + [+], para a direita. Deixou os painéis: intensidade da ACT-5::GFP na manga de membrana tipo selvagem é cerca de 50 (cinza valor/membrana; indicado pela seta preta e vermelha), trama mostrada por baixo da imagem. Direito de painéis: intensidade da ACT-5::GFP em MTC-1 + [+] é acima de 100 (valor cinza da membrana dorsal é cerca de 110 (seta preta), e da membrana ventral é cerca de 140 (seta vermelha)), trama mostrada abaixo da imagem. Escala de barras = 5 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: exemplos de marcadores para o Sistema de membrana do Canal excretor de c. elegans
Nome de proteína	Sub

localização celular Função Exemplos de variedades disponíveis Referências MTC-1 domínio apical vinculador de membrana – citoesqueleto VJ402 (fgEx13 [erm-1p::erm-1::gfp, rol-6p::rol-6(su1006)]) ref (¹³) ATO-5 domínio apical actina apicalmente localizada VJ268 (fgEx12[(act-5p::act-5::gfp); unc-119 (+); unc-119 (ed3) III]) ref (¹³) ABTS-2 Basolateral Transportador de ânion/bicarbonato ABTS-2::GFP ref (⁴²) SULP-8 Basolateral Sulfatepermease SULP-8::GFP ref (⁴²) VHA-1 vesículas canaliculares V-ATPase VJ535 (fgEx35 (vha-1p::vha-1::gfp; rol - 6p:: rol-6(su1006))) ref (⁹) VHA-5 vesículas canaliculares V-ATPase ML846 (vha-5(mc38) IV; mcEx337 [vha-5 (+):: GFP + rol-6(su1006)]) ref (¹⁰) AQP-8 vesículas canaliculares aquaporina, canal de água VJ533 (fgEx33 (aqp-8p::aqp-8::gfp)) ref (⁹) RAB-5 CDDP vesículas tráfico de BK209 (qpIs99 (exc9p::mCherry::rab-5)) ref (³⁶) RAB-7 CDDP vesículas tráfico de BK210 (qpIs100 [Pexc-9::mCherry::rab-7]) ref (³⁶) RAB-11 CDDP vesículas tráfico de BK205 (qpIs97 (exc9p::mCherry::rab-11)) ref (³⁶) ¹ Exemplos são selecionados dos recursos listados na tabela 3.

Tabela 2: exemplos de C. elegans promotores Excretory Canal específico
promotores	Palco de expressão
MTC-1	embrião de palco de vírgula
sulp-5	3 vezes de embrião
VHA-1	2 vezes de embrião
VHA-5	2 vezes de embrião
AQP-8	2 vezes de embrião
GLT-3	embrião de tarde
1 Exemplos são selecionados dos recursos listados na tabela 3.

Tabela 3: recursos

Recursos para identificar moléculas de canal específico excretor c. elegans, rotulando os reagentes/cepas e anticorpos

1. centro de genética Caenorhabditis (CGC)43 de tensões e reagentes disponíveis

2. Wormbase44 para obter informações sobre moléculas de específicas do canal excretoras, cepas e anticorpos

3. informações sobre moléculas de específicas do canal excretoras: ver referência6

4. Transgeneome site45 para construções de fusão de GFP translacionais

5. c expressão padrão46 para construções de fusão de GFP transcricionais

6. nacional projeto BioResource (NBRP)::C.elegans47 para informações sobre promotores e mutantes de c. elegans

7. Fluorophores: ver referência48,49

Recursos baseados na Web para a montagem de moléculas para uma alvo RNAi biblioteca

1. GeneMANIA50

2. AceView51

3. iHOP52

4. Wormbase44

5. saccharomyces Genome Database53

6. Flybase54

7. Mouse Genome Database55

8. humano Genome Database56

9. explosão57

Tabela 4: Exemplo de fenótipo simples folha de Pontuação
Biblioteca de RNAi		Estirpe	Fenótipo geral (% total)	Fenótipo de canal
				Comprimento de canal < 1/2 (% L4)	Comprimento de canal > 1/2 (% L4)	Outro fenótipo de Canal	Número total de animais contados
Matrícula	Número bem
I-1	A1	MTC-1 [+ +]; VHA - 1p:: GFP	CLR (30)	80	20		100
X-5	B12	mesmo	nenhum	30	70		100
III-10	C5	mesmo	UNC (54)	70	30	cistos grandes	100

Discussion

Versatilidade genética dos c. elegans , transparência, plano de corpo simples e linhagem de células invariável fazem um excelente modelo para a análise da morfogênese. Este protocolo descreve como combinar padrão manipulações genéticas e a imagem latente estudos para aproveitar a 2 mícrons fina c. elegans canais excretores para estudar a membrana polarizada e biogênese intracelular lúmen em um tubo de célula única.

Rotulagem
C. elegans excretoras canais podem ser rotulados pela expressão de proteínas da fusão fluorescentes, permitindo a análise ao vivo (descrita aqui), ou por anticorpos ou coloração química (veja papel de acompanhamento no tubulogenesis intestinal para anticorpos ³). a expressão de dois ou mais diferentes fluorophores, ou a combinação destes diferente técnicas, de rotulagem permite a dissecção alta resolução visual desses túbulos finas (Figura 2). Proteínas de fusão fluorescente dirigidas aos canais por um promotor específico do canal são a primeira escolha para a rotulagem de canal excretor por vários motivos, entre eles: (1) os níveis de baixa expressão de muitas proteínas de canal e a estrutura fina do canal (2) o que é facilmente oprimido pela coloração fora dos canais onde a proteína de interesse também pode ser expressa. Por outro lado, os canais são sensíveis à proteínas exógenas e facilmente desenvolver fenótipos não específico (por exemplo, defeitos de extensão e cistos ou mesmo letalidade) quando essas proteínas são fortemente expressos. Isso deve pesar na decisão ao escolher entre diferentes formas de gerar animais transgénicos. Em princípio, transgenes pode ser introduzido como matrizes extracromossômico (por exemplo, por injeção direta o ADN do plasmídeo na gônada para transformação da linha germinal, conforme descrito aqui), que normalmente gera alta-cópia números matrizes (muitas vezes com alta expressão), ou integrado no genoma, normalmente em número de cópia única ou baixa (por exemplo, por bombardeamento²⁶ ou através de cópia única mediada por Mos1 inserção [MosSCI]²⁷). Matrizes de Extrachromsomal também podem ser integrados no genoma em uma segunda etapa (ainda, no entanto, em um número elevado de cópia)¹⁸. Por outro lado, quando injetado o germline em baixa concentração (por exemplo, 1-2 ng / µ l de DNA, aliada a uma maior concentração do marcador de DNA), matrizes de número de baixas (até mesmo única) cópia podem ser facilmente gerado²⁸. Este cenário tem a vantagem que as concentrações de DNA podem ser variadas, que pode ajudar a encontrar o melhor expressão nível para a rotulagem de canal, nem muito baixo nem muito alto (tóxicos). A relação entre o nível de concentração e expressão de DNA injetado é dependente de vários factores (por exemplo, o promotor) e assim deve ser empiricamente determinada. Alternativamente, o gene de interesse pode ser etiquetado diretamente com um fluoróforo no germline por agrupado regularmente intercaladas curta palíndromo repete (CRISPR) com base em procedimentos etiquetando^29,30. Embora essa abordagem coloca o fluoróforo no seu contexto genômico mais fisiológico, isto nem sempre é necessário ou mesmo desejável (por exemplo, quando a proteína é expressa em níveis muito baixos). Pode, no entanto, ser a melhor opção, por exemplo se o gene de interesse é muito grande.

Visualização do canal pode ser realizada por dirigir transcriptional construções dentro do canal que irá destacar o citoplasma do canal por um fluoróforo. Em contraste, a rotulagem componentes subcelulares canal requer uma fusão translacional onde o gene completo é conectado no quadro para o fluoróforo codificação de gene. Ao usar um promotor específico de canal de expressão (ao invés do promotor do gene), sua escolha deve ser baseada na força do promotor e, para a análise do desenvolvimento, o tempo de sua expressão. Muitos genes específicos do canal excretor não express antes da fase larval, quando função osmótica do canal torna-se crítico; tarde demais para a análise de sua fase de extensão ativa (erm-1 e 1-profissionais são primeiros genes expressos)^10,13. Exemplos de marcadores do canal excretor endo - e membranas de plasma e de promotores específicos de canal são dadas nas tabelas 1 e 2, respectivamente e recursos para encontrar moléculas adicionais de canal específico na tabela 3. Esses recursos também podem ser usados para encontrar uma proteína de fusão de fluorescente adequado já feitos, que pode estar disponível através do centro de genética Caenorhabditis (CGC; ver também a tabela 1). Para construir o plasmídeo recombinante para a expressão de tais fusões de proteína, pode-se usar vários métodos de clonagem, cada um com específicos prós e contras (discutido em outra parte,¹⁴). Estes incluem a enzima de restrição convencional com base em abordagens, descritas aqui de clonagem, clonagem modular usando a vários sites de sistema de Gateway³¹, Gibson Assembly³²ou construção de gene repórter pelo método "PCR costura"^{14 ,33}. Estas diferentes abordagens podem ser adaptadas para o método escolhido para a sua introdução no germline e/ou outras necessidades específicas (por exemplo, o Gateway versátil sistema facilita a baralhar de promotores e cDNAs para escala maior rotulagem abordagens) . Cuidado precisa ser tomado para escolher o local de inserção correta para o fluoróforo (vinculando-à N-versus C-terminal da proteína), tendo em consideração a função da proteína de interesse.

Interferência com a função dos genes
Como uma das muitas maneiras possíveis para perturbar a função do gene em c. elegans, este protocolo descreve uma tela de interação alvo RNAi projetada para modificar um fenótipo de lúmen do canal cístico, induzido pela superexpressão um componente da membrana lumenal. Neste caso específico, a superexpressão uma membrana apical/lumenal associado marcador como ERM-1 tem a vantagem de orientar directamente o inquérito para o destino desejado: a análise da biogênese intracelular da membrana apical/lumenal. Um fenótipo de ganho-de-função gerado pela superexpressão também fornece algumas vantagens quando combinado com uma tela de interação (RNAi) perda-de-função, conforme descrito aqui (ver³⁴ para a discussão das análises de perda e ganho-de-função e a design de telas genéticas). Além disso, a MTC-1 em si é um bem investigadas "morfogênese lúmen" e membrana apical identidade molécula¹². Portanto, neste caso, uma tela de alvo (ao invés de imparcial) é susceptível de ser informativo diretamente para morfogênese lúmen enquanto concomitantemente função específica mais caracterizando ERM-1 neste processo. No entanto, uma tela imparcial não específico poderia ser realizada de forma semelhante, começando com um animal do tipo selvagem, um animal geneticamente modificado com fluorescently rotulado canais excretores, ou com qualquer mutante de canal. O general vantagens e desvantagens de RNAi (por exemplo, contra o mutagenesis) para a geração de fenótipos de perda-de-função e a condução e a discussão dos diferentes tipos de telas genéticas em c. elegans são discutidas em outra parte ³⁴. RNAi produz um espectro de fenótipos, incluindo fenótipos mais leves, uma vantagem específica para a análise dos genes tubulogenesis muitas vezes letal. Isto é descrito e discutido no jornal que acompanha no tubulogenesis intestinal³. Abordagens diferentes para gerar ganho e perda de função mutantes e procedimentos de genéticos clássicos, como cruzes, são detalhados e discutidos os métodos de genética geral literatura²⁰.

Microscopia e avaliação dos fenótipos tubulogenesis
Avaliar visualmente e marcando a modificação de um fenótipo de canal bem definido sob uma fluorescente microscópio de dissecção usando parâmetros de Pontuação simples (como o canal comprimento e lúmen diâmetro), conforme descrito aqui, podem ser alcançados em um curto período de tempo mesmo quando um número maior de animais em um alvo ou sistemática genéticos ou RNAi tela de processamento. Em contraste, um semelhante tela, procurar fenótipos de morfogênese canal novela em uma cepa que é selvagem-tipo (exceto seu canal-rotulagem do transgene), é mais demorada, mas pode, em princípio, ser executada da mesma forma (Efetuamos tal um tela em uma base de todo o genoma em vários meses). Essas telas identificará vários fenótipos de canal diferente (não mostrados aqui) e, portanto, deve desenvolver correspondentemente diferentes parâmetros de pontuação, por exemplo, uma classificação qualitativa regime (veja ^{9,11, 35,36,37,38} em maneiras diferentes de marcar canal fenótipos dissecando microscopia). Ao interpretar qualquer fenótipo de canal, é crucial manter em mente que a formação do cisto pode ser um efeito inespecífica de muitos insultos diferentes para essa estrutura tubular fina, e muitas vezes é um fenótipo de terminal menos informativo. Cisto de tamanho e localização, por outro lado, podem ser informativos, por exemplo, um cisto perto da pilha de canal (no início da extensão do canal), cistos ao longo do comprimento do canal ou cistos em pontas do canal, fornecem pistas para o mecanismo subjacente dos defeitos. Cistos de canal (aqui definidos como intra-lumenal esferoides cheias de líquido, rodeados por uma membrana apical/lumenal) devem ser distinguidos das vesículas (pequeno citoplasmático membrana-limite fluido preenchido esferoides) ou vacúolos (alargada citoplasmática membrana-limite esferoides enchidos fluidos), não rodeada por uma membrana lumenal, que pode olhar tudo superficialmente idênticos (Figura 4A-D). Vacúolos citoplasmáticos do mesmo modo podem surgir secundariamente, por exemplo, através de efeitos tóxicos de montagem soluções (azida sódica). Ambos, grandes cistos e vacúolos citoplasmáticos podem ocupar quase do tamanho do animal e precisa ser mais distinguida a clássica "clear (Clr)" canal fenótipo que é causado pelo acúmulo de líquido na cavidade do corpo. Finalmente, comprimento de canal é quase sempre secundariamente comprometido em canais císticos, portanto um defeito de extensão do canal verdade precisa ser demonstrada em um ambiente livre de cisto.

Apesar de seus pequenos diâmetros, componentes subcelulares de excretor canais, tais como apical contra as membranas basais, intracelulares CDDP versus canaliculares vesículas, organelas intracelulares e componentes do citoesqueleto, podem ser visualizadas pela maior ampliação, por exemplo, microscopia confocal (Figura 2, Figura 4). Pela imagem latente confocal, uma citoplasma de canal positivo de GFP sozinha é suficiente para distinguir o lúmen do citoplasma canal através de uma linha de não-fluorescente (Figura 2A, Figura 4E). A identidade dos marcadores contribui para resolver canalicular da CDDP vesículas (também surpreendentemente diferentes em tamanho), embora a atribuição definitiva exigirá immunoelectronmicroscopy³⁹. Duplos e triplos rotulagem pode determinar a Localização subcellular de uma molécula de interesse e a relação dos componentes subcelulares uns aos outros (Figura 2). Único canal lumenal rotulado membranas produzem a mesma linha dupla como o citoplasma ou membrana basal, mas podem ser distinguidas através de duplo ou triplo de rotulagem. Para análise confocal, montagem adequada é importante, dada a fragilidade da estrutura de canal, sua sensibilidade às mudanças osmóticos e a vulnerabilidade de seu fenótipo cística mais frequente. Cistos estourar facilmente com alterações osmóticos ou pressão física, são sensíveis a toxinas de membrana, tais como azida de sódio e também são sensíveis a alguns anestésicos utilizados para a imobilização (que também pode produzir vacúolos citoplasmáticos). Em nossas mãos, lidocaína a 5% em tampão M9 funciona melhor para ensaios de canal mais excretoras. Procedimentos de imagem e manipulação de todos devem ser suaves, como descrito. Para evitar artefatos que imitam fenótipos (por exemplo, cistos e vacúolos), recomenda-se imediatamente adquirir imagens após a montagem. Se isso não for possível, imagens de cisto devem ser adquiridas em primeiro lugar, antes de outros fenótipos de imagem. Este protocolo discute padrão microscopia confocal que fornece confocality superior, em comparação com a fiação microscopia confocal de disco que, em contrapartida, reduz a fototoxicidade e é a microscopia de escolha para a análise das mudanças dinâmicas de componentes subcelulares ao longo do tempo. Tais perguntas sobre subcellular dinâmica também podem ser resolvidas usando técnicas de fotobranqueamento ou rotulagem proteínas da fusão com foto-comutável fluorophores que mudam de cor⁴⁰. Finalmente, o intervalo de resolução pode ser aumentado pela adição de microscopia eletrônica de transmissão (TEM, fornecendo a mais alta resolução estrutural mas não molecular), microscopia de super-resolução (fornecendo resolução molecular na escala do nanômetro); ou immunoelectronmicroscopy (fornecendo ambos)^39,41. Tomografia computadorizada 3D pode ser combinada com seções de série TEM e é particularmente útil para a análise da interface canalicular--a membrana plasmática de canais excretores^9,10. Técnicas aperfeiçoadas para estes diferentes tipos de microscopia e combinações dessas diferentes abordagens de imagens continuam a ser desenvolvidas.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cloning
Plasmid pPD95.75	Addgene	Cat. No. 37464
PCR Kit	Qiagen	Cat. No. 27106
Ligation kit	New England Biolabs	Cat. No. E2611L
DNA marker	Thermo Scientific	Cat. No. SM1331
Agarose DNA grade	Fisher Scientific	Cat. No. BP164-100
Competent cells	New England Biolabs	Cat. No. C2987H
Tris	Fisher Scientific	Cat. No. BP154-1
EDTA	Sigma	Cat. No. ED-1KG
Acetic acid	Fisher Scientific	Cat. No. A38S-500
Ethidium bromide	Fisher Scientific	Cat. No. BP1302-10
Equipments
PCR machine	MJ Research	Cat. No. PTG-200
Centrifuge	Eppendorf	Cat. No. 5415C
Water Bath	Precision Scientific	Cat. No. 666A3
Gel running instrument	Fisher Scientific	Cat. No. 09-528-165
Gel running power supply	Fisher Scientific	Cat. No. 45-000-465
Molecular Imager Gel Doc XR System	Bio-Rad	Cat. No. 1708195EDU
Nanodrop Spectrophotometer	Thermo Scientific	Cat. No. ND1000
C. elegans related1			1see reference19 for standard C. elegans culture and maintenance procedures.
LB Medium and plates2			2see reference19 for protocols.
Tryptone	Acros Organics	Cat. no. 611845000
Yeast Extract	BD Biosciences	Cat. no. 212750
NaCl	Sigma	Cat. no. S7653
Bacto Agar	BD Biosciences	Cat. no. 214040
Ampicillin	Sigma	Cat. no. A0116
Tetracycline	Fisher Scientific	Cat. no. BP912
M9 Medium2			2see reference19 for protocols.
NaCl	Sigma	Cat. no. S7653
KH2PO4	Sigma	Cat. no. P0662
Na2HPO4	Sigma	Cat. no. S7907
MgSO4	Sigma	Cat. no. M2773
NGM plates 2			2see reference19 for protocols.
NaCl	Sigma	Cat. no. S7653
Peptone	BD Biosciences	Cat. no. 211677
Tryptone	Acros Organics	Cat. no. 611845000
Bacto Agar	BD Biosciences	Cat. no. 214040
MgSO4	Sigma	Cat. no. M2773
CaCl2	Sigma	Cat. no. C3881
Cholesterol	Sigma	Cat. no. C8667
K2HPO4	Sigma	Cat. no. P3786
KH2PO4	Sigma	Cat. no. P0662
RNAi plates3			3see reference21 for protocols.
NaCl	Sigma	Cat. no. S7653
Peptone	BD Biosciences	Cat. no. 211677
Tryptone	Acros Organics	Cat. no. 611845000
Bacto Agar	BD Biosciences	Cat. no. 214040
MgSO4	Sigma	Cat. no. M2773
CaCl2	Sigma	Cat. no. C3881
Cholesterol	Sigma	Cat. no. C8667
K2HPO4	Sigma	Cat. no. P3786
KH2PO4	Sigma	Cat. no. P0662
IPTG	US Biological	Cat. no. I8500
Carbenicillin	Fisher Scientific	Cat. no. BP2648
NaOH	Fisher Scientific	Cat. no. SS266-1
Sodium hypochlorite	Fisher Scientific	Cat. no. 50371500
Bacteria
OP50 bacteria	CGC
HT115 bacteria	CGC
Genome-wide RNAi libraries
Ahringer genome-wide RNAi feeding library (ref21,58,59)	Source BioScience
C. elegans ORF-RNAi feeding library (ref60)	Source BioScience
Imaging related
Lidocaine	MP Biomedicals,LLG	Cat. no. 193917
Materials
Vacuum Grease Silicone	Beckman	Cat. no. 335148
Microscope slides	Fisher Scientific	Cat. no. 4448
Tissue culture plate, 6 well	Corning Inc.	Cat. no. 08-772-33
Equipment
SMZ-U dissecting microscope (Nikon)
SZX12 dissecting microscope (Olympus), equipped with a high-power stereo fluorescence attachment (Kramer Scientific), CCD camera with Q capture software and X-Cite fluorescent lamp (Photonic Solutions).
TCS SL Laser-scanning confocal microscope (Leica Microsystem)
C2 laser-scanning confocal mounted on an ECLIPSE Ti-E inverted microscope (Nikon)