מאתר כולין לקויה, בתוספת Ethionine (CDE) דיאטה מודל של פגיעה כרונית בכבד
Summary
כאן אנו מתארים שיטה נפוצה כדי לגרום נזק כבד כרונית בעכברים על ידי האכלה של תזונה לקויה כולין, בתוספת ethionine (CDE). נדגים לניטור תקינות זלוף בכבד, בידוד, שימור. קורס זמן של 6 שבועות ניתן להודיע על פגיעה בכבד, pathohistology, פיברוזיס, דלקתיות, ותגובות תא קדמון בכבד.
Abstract
מחלות כבד כרוניות, כגון דלקת כבד נגיפית, מחלת כבד אלכוהולית או מחלת כבד שומני לא אלכוהוליים, מאופיינים על ידי דלקת מתמיד, ההרס מתקדם והתחדשות של התא קדמון parenchyma הכבד, כבד התפשטות, פיברוזיס. בשלב הסופי של כל מחלת כבד כרונית היא שחמת, גורם סיכון מרכזי לפיתוח של קרצינומה hepatocellular יסודי. ללמוד תהליכי ויסות המחלה ייזום, הקמה, התקדמות, משמשים מספר מודלים בבעלי חיים במעבדות. כאן נתאר קורס שישה שבועות זמן של כולין לקויה, בתוספת ethionine (CDE) העכבר המודל, הכוללת האכלה עכברים C57BL/6J זכר 6 – בן שבועיים עם חשוכת-כולין צ’או ו- 0.15% DL-ethionine-בתוספת שתייה. פיקוח על בעלי חיים בריאות, עיקול אובדן משקל הגוף טיפוסי מוסברים. הפרוטוקול מדגים בחינת שטופלו CDE הכבד והדם אוסף מגעיל על ידי ניקוב לב עבור ניתוחים סרום עוקבות. הבא, הטכניקה זלוף הכבד ואוסף של אונות הכבד שונה עבור הערכות סטנדרטיים הם היסטולוגיה הכבד שמוצג, לרבות הערכות hematoxylin ו אאוזין או סיריוס אדום stainings, זיהוי immunofluorescent של תאי הכבד אוכלוסיות כמו גם transcriptome סטיגמה של microenvironment הכבד. מודל זה העכבר מתאים ללמוד דלקתיות, fibrogenic של תאים ובתאים הכבד dynamics המושרה דרך למחלת כבד כרונית והוא יכול לשמש כדי לבדוק את סוכני טיפולית פוטנציאליים אשר ייתכן לווסת תהליכים אלה.
Introduction
הכבד הוא האיבר הגדול ביותר של הבלוטות חילוף החומרים של הגוף ויש לו הרבה פונקציות מורכבות. תפקידי מפתח על הכבד כוללות מערכת העיכול, חילוף החומרים, ניקוי רעלים, אחסון של חומרים מזינים חיוניים, הייצור של רכיבי חלבון פלזמה וחסינות מתווכת דרך מקרופאגים תושב או תאים Kupffer. הכבד יש יכולת להתחדש גם אם עד 70-90% המסה הכוללת אובד. במקרה של פגיעה בכבד חריפה, כגון ראיתי בעקבות של hepatectomy חלקית או הרעלת פרצטמול, hepatocytes בריא הנותרים להתרבות לתקן את הנזק תהליך מתואם מאוד1. עם זאת, כאשר hepatocytes נפצעים באופן כרוני עקב זיהום ויראלי לטווח ארוך, חריפים או אלכוהוליים מחלת כבד שומני, microenvironment דלקתיות מפעיל את ההפעלה של נהיגה פיברוזיס בתאי stellate הכבד ו התפשטות של הכבד ובתאים (LPCs) עם פוטנציאל להתמיין cholangiocytes או hepatocytes2,3,4,5. המקור המדויק, בידול גורל LPCs, תרומתם התחדשות הכבד, hepatocarcinogenesis היו הנושאים שעוררו ותלויות ככל הנראה חומרת הפציעה ואת ההקשר2. סדר האירועים הקשורים התחדשות מוקדם גם משווקי הנדונה, עם כמה חוקרים וקבע כי הפעלת תאי stellate הכבד ובניה מטריקס חיונית לדור של העדפה-LPC נישה6, ואילו אחרים דוח LPC הרחבה, התגובה Ductular כביכול נדרשים ההדק fibrogenesis7. ישנם דגמים בעלי חיים רבים ללמוד היבטים ספציפיים של פציעה, התחדשות, תוך ניסיון להבין את כל הגורמים כבסיס המסדירים את התקדמות המחלה, בסופו של דבר לפתח אסטרטגיות חדשות לטיפול בחולים8.
כולין לקויה, בתוספת ethionine (CDE) תזונתיים המודל פותח במקור לשימוש אצל חולדות, מאוחר יותר שינה עבור אינדוקציה כרונית פגיעה בכבד עכברים9,10. מחסור תזונתי של כולין התוצאה הרכבה לקוי הפרשת ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה מאוד. משטר טיפול זה בשילוב עם hepatocarcinogen DL-ethionine, שמוביל שומן עודפת הכבד טעינה, דלקת מתמשכת, periportal פיברוזיס, התגובה LPC ולטווח hepatocellular קרצינומה של פיתוח11,12 . עם זאת, חשוב, העכבר שונים זנים התערוכה דפוסים ייחודיים של דלקתיות, fibrogenic ו LPC dynamics בתגובה13. פרוטוקול זה מתאר פגיעה כבד כרונית אינדוקציה בעכברים C57BL/6J, הנפוץ ביותר בשימוש מוכלאים העכבר זן.
במחקר ממחלות כבד כרוניות, ניתוחים טיפוסי כוללות הערכות היסטולוגית hematoxylin אאוזין וכן אדום סיריוס מכתים להמחיש קולגן התצהירים, immunohistochemical או immunofluorescent זיהוי של אוכלוסיות תאים בכבד, ניתוח transcriptomic של microenvironment הכבד זה האחראית השינויים הסלולר המושרה באמצעות פקטורי גדילה מורכבים ציטוקין רשתות14,15,16,17 , 18.
Protocol
Representative Results
Discussion
מחלת כבד כרונית הוא לרוב מחלה שקטה עם רוב המטופלים להיות אסימפטומטיים, הוא אחד התורמים העיקריים על התחלואה והתמותה ברחבי העולם. אלכוהוליזם כרוני בנגיף הפטיטיס C הגורמים המובילים בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. פגיעה בכבד כרוני מאופיין על ידי דלקת הכבד, פיברוזיס, שחמת במקרים חמורים, קרצינומה…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים הלאומי לבריאות, המועצה למחקר רפואי (NHMRC) של אוסטרליה (APP1042370, APP1061332, APP1087125). המחברים רוצה להודות הצוות במכון המחקר של חדשנות בריאות קרטין לקבלת סיוע טכני.
Materials
| Six-week-old male C57BL/6J mice | Animal Resource Centre of Western Australia, Murdoch, WA, Australia | N/A | |
| 10 Kg Steam Cut Wheaten Chaff | Specialty Feeds, Glen Forrest, WA, Australia | N/A | |
| Water for irrigation 1000ml bottle (Baxter) | Surgical House, Perth, WA, Australia | AHF7114A | |
| Choline- deficient diet, modified (pellets) | MP Biomedicals Australasia Pty Limited, WA, Australia 02960210 | ||
| DL-Ethionine | Sigma-Aldrich, Castle Hill, NSW, Australia | E5139-25G | |
| Ketamil injection | Troy Laboratories Pty Limited, Glendenning, NSW, Australia | N/A | |
| Ilum Xylazil-20 injection | Troy Laboratories Pty Limited, Glendenning, NSW, Australia | N/A | |
| 27G x 1/2", Regular Wall Needle | Terumo Australia Pty Limited, NSW, Australia | NN-2713R | |
| Syringes Terumo 1ml and 10ml | Terumo Australia Pty Limited, Macquarie Park, NSW, Australia | 1018242, 1018037 | |
| Tissue-Tek OCT compound | VWR International Pty Limited, Tingalpa, QLD, Australia | 25608-930 | |
| Neutral buffered formalin | Amber Scientific, Midvale, WA, Australia | NBF-2.5L | |
| Ethanol absolute anaLaR normalpur | VWR International Pty Limited, Tingalpa, QLD, Australia | 20821.33 | |
| Superfrost Plus slides | Grale Scientific Pty Limited, Ringwood, VIC, Australia | SF41296SP | |
| Dako Protein Block, serum-free | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia | X090930-2 | |
| Dako antibody diluent | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia | s0809 | |
| rat anti-CD45 | eBioscience, San Diego, California, USA | m0701 | 1/200 dilution |
| rabbit anti-panCK | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia | Z0622 | 1/300 dilution |
| Goat anti-rabbit (Alexa Fluor 488) | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | A-11008 | 1/500 dilution |
| Goat anti-rat IgG (Alexa Fluor 594) | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | A-11007 | 1/500 dilution |
| ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | P36935 | |
| Picrosirius Red Stain Kit | Polysciences Inc., Warrington, PA, USA | ab150681 | |
References
- Taub, R. Liver regeneration: from myth to mechanism. Nat Rev Mol Cell Biol. 5, 836-847 (2004).
- Kohn-Gaone, J., Gogoi-Tiwari, J., Ramm, G. A., Olynyk, J. K., Tirnitz-Parker, J. E. The role of liver progenitor cells during liver regeneration, fibrogenesis, and carcinogenesis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 310, G143-G154 (2016).
- Lu, W. Y., et al. Hepatic progenitor cells of biliary origin with liver repopulation capacity. Nat Cell Biol. 17, 971-983 (2015).
- Prakoso, E., et al. Analysis of the intrahepatic ductular reaction and progenitor cell responses in hepatitis C virus recurrence after liver transplantation. Liver Transpl. 20, 1508-1519 (2014).
- Tirnitz-Parker, J. E., Tonkin, J. N., Knight, B., Olynyk, J. K., Yeoh, G. C. Isolation, culture and immortalisation of hepatic oval cells from adult mice fed a choline-deficient, ethionine-supplemented diet. Int J Biochem Cell Biol. 39, 2226-2239 (2007).
- Van Hul, N. K., Abarca-Quinones, J., Sempoux, C., Horsmans, Y., Leclercq, I. A. Relation between liver progenitor cell expansion and extracellular matrix deposition in a CDE-induced murine model of chronic liver injury. Hepatology. 49, 1625-1635 (2009).
- Clouston, A. D., et al. Fibrosis correlates with a ductular reaction in hepatitis C: roles of impaired replication, progenitor cells and steatosis. Hepatology. 41, 809-818 (2005).
- Forbes, S. J., Newsome, P. N. Liver regeneration – mechanisms and models to clinical application. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 13, 473-485 (2016).
- Akhurst, B., et al. A modified choline-deficient, ethionine-supplemented diet protocol effectively induces oval cells in mouse liver. Hepatology. 34, 519-522 (2001).
- Shinozuka, H., Lombardi, B., Sell, S., Iammarino, R. M. Early histological and functional alterations of ethionine liver carcinogenesis in rats fed a choline-deficient diet. Cancer Res. 38, 1092-1098 (1978).
- Knight, B., Tirnitz-Parker, J. E., Olynyk, J. K. C-kit inhibition by imatinib mesylate attenuates progenitor cell expansion and inhibits liver tumor formation in mice. Gastroenterology. 135, 969-979 (2008).
- Kohn-Gaone, J., et al. Divergent Inflammatory, Fibrogenic, and Liver Progenitor Cell Dynamics in Two Common Mouse Models of Chronic Liver Injury. Am J Pathol. 186, 1762-1774 (2016).
- Knight, B., et al. Attenuated liver progenitor (oval) cell and fibrogenic responses to the choline deficient, ethionine supplemented diet in the BALB/c inbred strain of mice. J Hepatol. 46, 134-141 (2007).
- Dwyer, B. J., Olynyk, J. K., Ramm, G. A., Tirnitz-Parker, J. E. TWEAK and LTbeta Signaling during Chronic Liver Disease. Front Immunol. 5, 39 (2014).
- Karin, M., Clevers, H. Reparative inflammation takes charge of tissue regeneration. Nature. 529, 307-315 (2016).
- Ruddell, R. G., et al. Lymphotoxin-beta receptor signaling regulates hepatic stellate cell function and wound healing in a murine model of chronic liver injury. Hepatology. 49, 227-239 (2009).
- Tirnitz-Parker, J. E., et al. Tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis is a mitogen for liver progenitor cells. Hepatology. 52, 291-302 (2010).
- Viebahn, C. S., Yeoh, G. C. What fires prometheus? The link between inflammation and regeneration following chronic liver injury. Int J Biochem Cell Biol. 40, 855-873 (2008).
- Hayner, N. T., Braun, L., Yaswen, P., Brooks, M., Fausto, N. Isozyme profiles of oval cells, parenchymal cells, and biliary cells isolated by centrifugal elutriation from normal and preneoplastic livers. Cancer Res. 44, 332-338 (1984).
- Tee, L. B., Smith, P. G., Yeoh, G. C. Expression of alpha, mu and pi class glutathione S-transferases in oval and ductal cells in liver of rats placed on a choline-deficient, ethionine-supplemented diet. Carcinogenesis. 13, 1879-1885 (1992).
- Chayanupatkul, M., et al. Hepatocellular carcinoma in the absence of cirrhosis in patients with chronic hepatitis B virus infection. J Hepatol. 66, 355-362 (2017).
- Mittal, S., et al. Hepatocellular Carcinoma in the Absence of Cirrhosis in United States Veterans is Associated With Nonalcoholic Fatty Liver Disease. Clin Gastroenterol Hepatol. 14, 124-131 (2016).
