Na Vivo Imagiologia multimodal e análise do modelo de neovascularização coroide de induzida por Laser de Mouse
Summary
Aqui, apresentamos a utilidade da imagem longitudinal na vivo na sequência de alterações morfológicas da neovascularização de coroide do laser-induzida em camundongos.
Abstract
Induzida por laser a neovascularização de coroide (CNV) é um modelo bem estabelecido para imitar a forma úmida da degeneração macular relacionada à idade (DMRI). Neste protocolo, nosso objetivo é orientar o leitor não simplesmente através das considerações técnicas de gerar lesões induzida por laser para desencadear processos neovascular, mas prefiro focar a informação poderosa que pode ser obtida multimodal longitudinal vivo em de imagem durante todo o período de seguimento.
O mouse laser-induzida modelo CNV foi gerado por uma administração de laser de diodo. Multimodal no vivo técnicas de imagem foram utilizadas para monitorar CNV indução, progressão e regressão. Primeiro, a tomografia de coerência óptica de domínio espectral (SD-OCT) foi realizada imediatamente após o lasering para verificar uma ruptura da membrana de Bruch. Subsequentes na vivo imagens usando angiografia fluoresceína (FA) confirmaram sucesso dano da membrana de Bruch da série imagens adquiridas a nível da coroide. Acompanhamento longitudinal da proliferação de CNV e regressão nos dias 5, 10 e 14 após o lasering foi realizado usando SD-OCT e FA. Simples e confiável de classificação de leasions de CNV com vazamento de imagens de FA é apresentado. Segmentação automatizada para medição da espessura total da retina, combinada com a aplicação manual calibre para medição da espessura da retina em sites CNV, permitir uma avaliação imparcial da presença de edema. Finalmente, verificação histológica da CNV é executada usando isolectin GS-IB4 mancha na flatmounts da coroide. A coloração é thresholded, e a área de isolectin-positivo é calculada com o ImageJ.
Este protocolo é especialmente útil em estudos de terapêutica que exigem alta taxa de transferência-como triagem de patologia CNV como rápido, permite multimodal e classificação confiável de edema de patologia e retinal CNV. Além disso, a alta resolução SD-OCT permite a gravação de outras características patológicas, tais como o acúmulo de fluido subretinal ou intraretinal. No entanto, este método não oferece a possibilidade de automatizar a análise de volume CNV de imagens SD-OCT, que tem de ser executada manualmente.
Introduction
A primeira tentativa bem sucedida para imitar a patologia humana CNV em roedores foi demonstrada há quase três décadas com um laser de krypton em Long-Evans ratos1. Depois disso, um laser de krypton foi usado para invadir a cepa de rato mais popular, C57BL/6J2,3,4a membrana de Bruch. A taxa de sucesso da indução CNV foi verificada com FA e manchas histológicas. Um rápido desenvolvimento de modalidades de imagem não-invasivos, como OCT, estimulou o crescimento do campo de roedores modelos pré-clínicos. A capacidade de monitorar mudanças morfológicas na retina em múltiplos pontos de tempo no mesmo olho significativamente contribui para a redução do uso de animais e aumenta a eficiência em estudos experimentais. Avaliação histológica das lesões CNV é bastante simples e exige a rotulagem de crescimento vascular anormal ao redor do local de administração do laser, aquisição de imagem e estimativa de área/volume usando um software de análise de imagem. Em contraste, na vivo modalidades de imagem apresentar análises mais complexas de patologia CNV e sua interpretação.
Aqui nós apresentamos um método simples e relativamente rápido para indução de grau, progressão e regressão de CNV usando FA, SD-OCT, e o método de segmentação automatizada no mouse laser-induzida CNV modelo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Imagiologia multimodal oferece valiosas ferramentas para avaliação de patologia CNV. Aqui apresentamos um protocolo de imagem consistindo de FA, SD-OCT e segmentação automática para a avaliação rápida, reprodutível e confiável de patologia CNV. Uma ruptura da membrana de Bruch após administração do laser foi confirmada. Além disso, o uso de SD-OCT nesta fase também permitiu a visualização imediata dos possíveis hemorragias intraretinal e subretinal, que pode confundir a interpretação dos resultados. V…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostaria de agradecer a Yuliya Naumchuk (Loyola University Chicago) e Žiniauskaitė Agne (Experimentica Ltd.), pelo excelente apoio técnico e videográfico. Programa de pesquisa do Dr. Kaja é suportado pelo Dr. John P. e Therese E. Mulcahy dotado Professorship em oftalmologia na Loyola University Chicago.
Materials
| Medetomidine (commercial name Domitor) | Orion | Vnr 01 56 02 | Anesthesia |
| Ketamine | Intervet | Vnr 51 14 85 | Anesthesia |
| 0,9% NaCl | B Braun | 357 0340 | Anesthesia |
| Xylazine (commercial name Rompun vet) | Bayer | vnr 14 89 99 | Anesthesia |
| Tropicamide | Santen | Vnr 04 12 36 | Mydriatic agent |
| Viscotears | Alcon | Vnr 44 54 81 | Lubricant |
| Systane | Alcon | - | Lubricant |
| 5% Fluorescein sodium salt | Sigma Aldrich | F6377-100G | Fluoresent agent |
| Atipamezole (commercial name Antisedane) | Orion | Vnr 47 19 53 | Anesthesia |
References
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