Un'analisi di citotossicità di base di citometria a flusso per la valutazione dell'attività delle cellule NK umane
Summary
Un metodo di basato su citometria di flusso per determinare quantitativamente l’attività citotossica delle cellule natural killer di umane è mostrato qui.
Abstract
All’interno del sistema immunitario innato, linfociti effettori conosciuti come cellule natural killer (NK) svolgono un ruolo essenziale nella difesa dell’ospite contro le cellule aberranti, in particolare eliminando tumorali e cellule infette viralmente. Circa 30 difetti noti monogenici, insieme a una serie di altre condizioni patologiche, causano la mancanza delle cellule NK sia funzionale o classica, che si manifesta ridotta o assente attività citotossica. Storicamente, la citotossicità è stata studiata con metodi radioattivi, che sono ingombranti, costosi e potenzialmente pericolose. Questo articolo viene descritto un metodo di base di cytometry di flusso aerodinamico, clinicamente applicabile per quantificare l’attività citotossica delle cellule NK. In questo saggio, cellule mononucleari del sangue periferico (PBMCs) o preparazioni purificate di cellule NK sono co-incubate a diversi rapporti con una linea cellulare di tumore destinazione conosciuta ad essere sensibili alla citotossicità cellulo-mediata NK (NKCC). Le cellule bersaglio sono pre-etichettate con un colorante fluorescente per permettere la loro distinzione dalle cellule effettrici (cellule NK). Dopo il periodo di incubazione, le cellule bersaglio uccisi sono identificate da una macchia di acido nucleico, che permea in modo specifico le cellule morte. Questo metodo è favorevole alla sia diagnostico e applicazioni di ricerca e, grazie alle funzionalità multi-parametro di citometria a flusso, presenta il vantaggio aggiunto di potenzialmente consentire un’analisi più approfondita del fenotipo delle cellule NK e funzione.
Introduction
Cellule natural killer (NK) sono un sottoinsieme sofisticato dei linfociti umani innati criticamente coinvolti nell’eliminazione delle cellule infettate viralmente, cellule trasformate e altri patogeni minacce 1,2. Granuli litici delle cellule di NK casa proteine citotossiche, come perforine e granzimi. Al momento dell’attivazione, le cellule NK formano una complessa interazione con i loro obiettivi conosciuto come sinapsi immunologica, per cui queste molecole citolitiche localmente vengono rilasciate, con conseguente lisi delle cellule bersaglio diretto e apoptosi, insieme al rilascio di citochine e chemochine e, infine, l’induzione di un infiammatorio stato 1,3,4.
Attivazione delle cellule NK coinvolge una stringa complessa di attivazione e inibitorie interazioni tra NK delle cellule recettori e ligandi espressi sulla superficie delle cellule bersaglio, formando un sistema strettamente regolato. Uno dei più studiati meccanismi di attivazione delle cellule NK è il “sé mancante”. Infatti, mancanza di rilevazione di classe che maggiore istocompatibilità (MHC), o umano del leucocita (HLA) l’antigene molecole, il infetti o trasformato la citotossicità delle cellule NK di cellule trigger. Tumore e cellule infettate da virus generalmente downregulate questi antigeni di fuggire immunità comunicata per cellule di T, diventando così NK primario delle cellule target 1,3,4.
Valutazione della funzione delle cellule NK è principalmente suddivise in degranulazione o citotossicità saggi. Tuttavia, test di degranulazione, quali il rilevamento di cytometric di flusso del marcatore associato degranulazione CD107a, sono indicativi dell’attivazione delle cellule NK e non della loro funzione finale, l’uccisione diretta di destinazione celle 5,6,7,8. Quindi, questa limitazione ha attirato gli investigatori a saggi di citotossicità come un’alternativa più eloquente e più diretto.
Da sempre “gold standard” per la valutazione della attività citotossica cellulo-mediata delle cellule NK e T è il test di rilascio di cromo (CRA). CRA coinvolge radioattivo etichettatura delle cellule bersaglio con 51Cr e co-incubarle con cellule effettrici. Questo test è immersa nel principio che la lisi delle cellule provoca il rilascio di legato alle proteine 51Cr nel surnatante, che può essere misurato contando gamma. Questo test, mentre efficaci, è problematico per una serie di motivi: costi elevati di materiale, manipolazione e smaltimento di radioattivo 51Cr, rilascio spontaneo di 51Cr e difficile standardizzazione – rendendolo del tutto impraticabile 9,10.
Una serie di saggi non radioattivo, che coinvolgono etichettatura fluorescente, rilascio di enzimi e anche bioluminescenza, allora è stata sviluppata come alternative al CRA 11,12,13,14. Descriviamo qui un metodo di basato su citometria di flusso per la misura di attività delle cellule NK citotossica sulle cellule bersaglio K562 che è semplice, sensibile e riproducibile. Le cellule K562 sono una cellula umana eritroleucemiche linea con riduzione dell’espressione di molecole HLA di classe I ed espressione intensificata di ligandi per recettori NK attivatori, che li rende particolarmente suscettibili a NK Citotossicità cellulo-mediata 15. In questa analisi, le cellule K562 sono pre-etichettate con carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) e co-coltivate a vari rapporti con entrambi cellule mononucleari del sangue periferico (PBMCs) o purificata di cellule NK 1. CFSE è un colorante fluorescente stabile, legame che consente di discriminazione delle cellule bersaglio da effettore NK cellule 16,17. Dopo la co-incubazione, una macchia di acido nucleico, specificamente che permea la membrana di cellule morte, viene utilizzata per identificare le celle di destinazione ucciso (Vedi tabella dei materiali). I campioni vengono quindi acquisiti su un citometro a flusso per determinare la percentuale di morti (cioè, macchia +) CFSE + cellule bersaglio.
Questa analisi può essere usata come uno screening diagnostico per malattie monogenici difetti che interessano il compartimento cellulare NK, di cui ci sono circa 30 difetti noti causando carenza di cellule NK o funzionale o classica, e per il lymphohistiocytosis hemophagocytic primario o secondario. È anche utile indagare l’attività delle cellule NK in pazienti con infezioni virali da herpes ricorrente, grave, di valutare la ricostituzione immunitaria dopo trapianto di cellule ematopoietiche o post immunomodulatori terapia 18,19,20e per una miriade di applicazioni di ricerca di base.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo qui descritto fornisce un’alternativa semplice e conveniente per il test di rilascio di Cr tradizionale 51per valutare l’attività citotossica delle cellule NK. Questo metodo è sensibile, riproducibile e richiede meno tempo rispetto ai metodi standard precedenti, come CRA e può essere usato per entrambi clinici e applicazioni di ricerca.
Mentre il dosaggio funziona sia con totale PBMCs e arricchito le cellule NK, l’opzione per utilizzare PBMCs senza la necessità di puri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare Jill Narciso, UCLA Immunogenetics Center, per la sua assistenza con la preparazione del manoscritto.
Materials
| Phosphate-buffered Saline (1x, w/o Ca2+ and Mg2+) | Corning (Cellgro) | 21-040-CM | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Tween-20 | Sigma | BP337-100 | |
| RPMI 1640 Media | Corning (Cellgro) | 10-040-CV | |
| Heat-inactivated Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-02 | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140-163 | Stock solution at 10,000 U/mL |
| IL-2 | R&D Systems | 202-IL-050 | Lyophilized from a 0.2 μm filtered solution in Acetonitrile and TFA with BSA as a carrier protein. Reconstitute with 500 ul at 100 μg/mL in sterile 100 mM Acetic Acid containing at least 0.1% bovine serum albumin (2.1x10E6 IU/ml) |
| K562 Cells | ATCC | CCL-243 | Cancer cell line |
| T-75 cell culture flasks | Corning | 431464 | |
| CFSE cell proliferation kit | Life Technologies (CellTrace) | C34554 | Reconstitute I vial with 18 ul DMSO to prepare a 5mM stock solution. Do not freeze/thaw. |
| Sytox Red | Life Technologies | S34859 | Stock solution is provided at 5 μM in 1 mL DMSO. The DMSO solution may be subjected to multiple freeze-thaw cycles without reagent degradation. |
| Sodium/lithium heparin blood collection tubes | BD | 02-687-95 | |
| U-bottom 96-well plate | Corning | CLS3897 | |
| Serological pipettes | BD Falcon | ||
| Polystyrene round-bottom tubes (5mL) | BD Falcon | 14959-5 | |
| 50 mL polypropylene conical tube | BD Falcon | 352070 | |
| 15 mL polypropylene conical tube | BD Falcon | 352097 | |
| Reagent reservoir | USA Scientific | 2321-2230 | |
| Human NK cell enrichment cocktail | StemCell Technologies (RosetteSep) | 15065 |
References
- Iannello, A., Debbeche, O., Samarani, S., Ahmad, A. Antiviral NK cell responses in HIV infection: I. NK cell receptor genes as determinants of HIV resistance and progression to AIDS. J Leukoc Biol. 84 (1), 1-26 (2008).
- Caligiuri, M. A. Human natural killer cells. Blood. 112 (3), 461-469 (2008).
- Topham, N. J., Hewitt, E. W. Natural killer cell cytotoxicity: how do they pull the trigger?. Immunology. 128 (1), 7-15 (2009).
- Warren, H. S., Smyth, M. J. NK cells and apoptosis. Immunol Cell Biol. 77 (1), 64-75 (1999).
- Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, N., Ullrich, E. Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions. J Vis Exp. (116), (2016).
- Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry. PLoS One. 10 (10), e0141074 (2015).
- Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. J Immunol Methods. 294 (1-2), 15-22 (2004).
- Atkinson, E. A., Gerrard, J. M., Hildes, G. E., Greenberg, A. H. Studies of the mechanism of natural killer (NK) degranulation and cytotoxicity. J Leukoc Biol. 47 (1), 39-48 (1990).
- Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay. J Immunol Methods. 325 (1-2), 51-66 (2007).
- Kane, K. L., Ashton, F. A., Schmitz, J. L., Folds, J. D. Determination of natural killer cell function by flow cytometry. Clin Diagn Lab Immunol. 3 (3), 295-300 (1996).
- Jang, Y. Y., et al. An improved flow cytometry-based natural killer cytotoxicity assay involving calcein AM staining of effector cells. Ann Clin Lab Sci. 42 (1), 42-49 (2012).
- Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. An enzyme-release assay for natural cytotoxicity. J Immunol Methods. 64 (3), 313-320 (1983).
- Karimi, M. A., et al. Measuring cytotoxicity by bioluminescence imaging outperforms the standard chromium-51 release assay. PLoS One. 9 (2), e89357 (2014).
- Oppenheim, D. E., et al. Glyco-engineered anti-EGFR mAb elicits ADCC by NK cells from colorectal cancer patients irrespective of chemotherapy. Br J Cancer. 110 (5), 1221-1227 (2014).
- West, W. H., Cannon, G. B., Kay, H. D., Bonnard, G. D., Herberman, R. B. Natural cytotoxic reactivity of human lymphocytes against a myeloid cell line: characterization of effector cells. J Immunol. 118 (1), 355-361 (1977).
- Jedema, I., van der Werff, N. M., Barge, R. M., Willemze, R., Falkenburg, J. H. New CFSE-based assay to determine susceptibility to lysis by cytotoxic T cells of leukemic precursor cells within a heterogeneous target cell population. Blood. 103 (7), 2677-2682 (2004).
- Lecoeur, H., Fevrier, M., Garcia, S., Riviere, Y., Gougeon, M. L. A novel flow cytometric assay for quantitation and multiparametric characterization of cell-mediated cytotoxicity. J Immunol Methods. 253 (1-2), 177-187 (2001).
- Carotta, S. Targeting NK Cells for Anticancer Immunotherapy: Clinical and Preclinical Approaches. Front Immunol. 7, 152 (2016).
- Mandal, A., Viswanathan, C. Natural killer cells: In health and disease. Hematol Oncol Stem Cell Ther. 8 (2), 47-55 (2015).
- Rezvani, K., Rouce, R. H. The Application of Natural Killer Cell Immunotherapy for the Treatment of Cancer. Front Immunol. 6, 578 (2015).
- Angelo, L. S., et al. Practical NK cell phenotyping and variability in healthy adults. Immunol Res. 62 (3), 341-356 (2015).
- Zons, P., et al. Comparison of europium and chromium release assays: cytotoxicity in healthy individuals and patients with cervical carcinoma. Clin Diagn Lab Immunol. 4 (2), 202-207 (1997).
- Yovel, G., Shakhar, K., Ben-Eliyahu, S. The effects of sex, menstrual cycle, and oral contraceptives on the number and activity of natural killer cells. Gynecol Oncol. 81 (2), 254-262 (2001).
- Laue, T., et al. Altered NK cell function in obese healthy humans. BMC Obes. 2, 1 (2015).
- Hazeldine, J., Lord, J. M. The impact of ageing on natural killer cell function and potential consequences for health in older adults. Ageing Res Rev. 12 (4), 1069-1078 (2013).
