인간 NK 세포 활동의 평가 대 한 흐름 Cytometry 기반 세포 독성 분석 실험

Summary

양적 인간의 자연 킬러 세포의 세포 독성 활동을 결정 하는 흐름 cytometry 기반 방법은 여기에 표시 됩니다.

Abstract

타고 난 면역 계통 내에서 이펙터 세포 자연 킬러 (NK) 세포로 알려진 탈 선 셀, 구체적으로 종양을 제거 하 고 virally 감염 된 세포에 대 한 호스트 방어에 필수적인 역할을 재생할. 다른 병 적인 상태의 호스트 함께 약 30 알려진된 monogenic 결함 발생 기능 또는 고전적인 NK 세포 결핍에서 만들어 낸 감소 또는 세포 독성 활동을 결 석. 역사적으로, 세포 독성은, 비싼 복잡 하 고 잠재적으로 위험한 방사성 방법 조사 하고있다. 이 문서는 NK 세포의 세포 독성 활동을 계량 유선형, 임상 적용 흐름 cytometry 기반 메서드를 설명 합니다. 이 분석 결과에 주변 혈액 단 세포 (PBMCs) 또는 순화 된 NK 세포 준비는 다른 비율에서 공동 incubated NK 세포 중재 된 세포 독성 (NKCC)에 민감한 것으로 알려져 대상 종양 세포 라인. 대상 세포는 효과 기 세포 (NK 세포)에서 그들의 차별 수 있도록 형광 염료와 사전 분류. 잠복기, 후 살해 대상 세포 특히 죽은 세포를 침투 하는 핵 산 얼룩에 의해 식별 됩니다. 이 방법은 의무가 모두 진단 및 연구 애플리케이션과, cytometry의 다중 매개 변수 기능에 감사 합니다는, 잠재적으로 NK 세포 표현 형 및 기능에 대 한 깊은 분석의 추가한 이점이 있다.

Introduction

자연적인 살인자 (NK) 세포는 virally 감염 된 세포, 변형 된 세포, 그리고 다른 병원 성 위협 ^1,2의 제거에서 비판적으로 관련 된 인간의 타고 난 세포의 정교한 부분 집합. NK 세포 용균성 립 집 perforin 등 granzymes 세포 독성 단백질. 활성화, NK 세포는 직접 대상 세포 세포의 용 해 및 apoptosis, cytokine 및 chemokine 릴리스 함께 결과로 이러한 cytolytic 분자 로컬로 출시 되 면 면역 시 냅 스로 알려진 그들의 목표와 복잡 한 상호 작용을 형성 하 고 궁극적으로 염증의 유도에서 상태 ^1,,34.

NK 세포 활성화 활성화의 복잡 한 문자열을 포함 하 고 억제 상호작용 NK 세포 수용 체와 ligands 단단히 규제 시스템을 형성 하는 대상 셀의 표면에 표현. NK 세포 활성화의 가장 공부 메커니즘 중 하나는 “누락 자가”입니다. 사실, 내가 중요 한 조직 적합성 복잡 한 (MHC), 또는 인간 백혈구 항 원 (HLA) 분자에 클래스의 탐지의 부족 감염 또는 변형 세포 트리거 NK 세포 세포 독성. 종양과 바이러스 감염 세포 일반적으로 downregulate T 세포 중재 면역, 따라서 기본 NK 지 고 탈출이 항 원 셀 대상 ^1,,34.

NK 세포의 기능에 대 한 평가 주로 degranulation 또는 세포 독성으로 분류 분석 실험. 그러나, degranulation 관련 마커 CD107a의 흐름 cytometric 감지와 같은 degranulation 분석 실험, NK 세포 활성화 그리고 그들의 궁극적인 기능, 대상 셀 ^5,6,,78의 직접적인 살인의 아닙니다 나타내는 있습니다. 따라서,이 제한 더 이야기 하 고 더 직접적인 대안으로 세포 독성 분석 실험에 조사를 받고 있다.

T와 NK 세포의 세포 독성 활동 셀 중재를 평가 하기 위한 오랜 “금 표준” 크롬 방출 분석 결과 (CRA) 이다. CRA 포함 방사성 ⁵¹Cr 대상 셀의 라벨 공동 effector 세포 배양. 이 분석 결과 세포 세포의 용 해 단백질 바인딩 ⁵¹Cr 감마 계산에 의해 측정 될 수 있는 상쾌한에의 릴리스 결과 원리에 가득한은. 효과적인, 반면이 분석 결과 여러 가지 이유로 문제가: 높은 물자 비용, 처리 및 방사성 ⁵¹Cr의 처리, ⁵¹Cr의 자발적인 릴리스 및 어려운 표준화-그건 전부 허무 ^9,10.

다양 한 형광 라벨, 효소 릴리스, 그리고 심지어 생물 발광, 관련 된 비 방사능 분석 실험 이후 CRA ^11,12,,1314대 안으로 개발 되었다. 여기의 NK 세포 세포 독성 활동 K562 대상 셀에, 민감한, 간단 하 고 재현성 있는 측정 흐름 cytometry 기반 방법을 설명 합니다. K562 세포는 인간의 erythroleukemic 셀 라인 감소 표현의 HLA 클래스와 내가 그들을 특히 NK 세포 독성 세포 중재 ¹⁵에 취약 하 게 activatory NK 수용 체에 ligands의 과장 된 표현. 이 분석 결과에서 K562 셀 carboxyfluorescein diacetate succinimidyl 에스테 르 (CFSE) 표시 미리 어느 주변 혈액 단 세포 (PBMCs)와 함께 다양 한 비율에서 공동 경작 또는 NK 세포 ¹정화. CFSE는 안정, 단백질 바인딩 형광 염료 이펙터 NK 세포 ^16,17에서 대상 셀의 차별 수 있습니다. 공동 부 화 후 특히 permeating 죽은 세포의 막, 핵 산 얼룩 살해 대상 세포 (재료의 표 참조)를 식별 하는 데 사용 됩니다. 샘플은 죽은 (즉, 얼룩 +)의 비율을 결정 하는 흐름 cytometer에 취득 CFSE + 대상 셀.

이 분석 결과는 약 30 알려진된 결함 기능 또는 고전적인 NK 세포 결핍을 일으키는 원인이 되는 NK 세포 구획에 영향을 미치는 monogenic 결함에 대 한 및 기본 또는 보조 hemophagocytic lymphohistiocytosis에 대 한 일상적인 진단 심사로 사용할 수 있습니다. 그것은 또한 기초 연구 응용 프로그램의 호스트에 대 한 조 혈 모 세포 이식 또는 게시물 immunomodulatory 치료 ^18,,1920다음 면역 재구성을 평가 하기 위해 재발, 심한 헤 르 페 스 바이러스 감염 환자에서 NK 세포 활동을 조사 하는 데 유용.

Protocol

Samples were collected according to the ethical guidelines established by the UCLA Human Research Protection Program and IRB approved. 1. Preparation of reagents NOTE: Unless otherwise stated, all reagents should be allowed to equilibrate at room temperature prior to use. All reagents must remain sterile. Prepare a 2x working solution of Tween-20 (i.e., 0.2%) by adding 10 µL of Tween-20 solution to 5 mL of phosphate-buffered saline (PBS) withou…

Representative Results

분석 결과 설정 하기 전에 NK 셀 내용 선택의 이펙터 인구에 평가 될 것이 좋습니다. 그림 1 에 일반적인 CD56 얼룩 (밝은 파란색) 전에 나와 (빨간색) NK 세포 농축 후. NK 세포 PBMCs의 최대 15% 고 농축 후 순수 80% 이상 이어야 한다. 흐름 cytometric 분석이 분석이 결과에 두 개의 매개 변수 검색 포함: CFSE, FITC;로 ?…

Discussion

여기 설명 하는 방법을 NK 세포의 세포 독성 활동을 평가 하기 위해 전통적인 ⁵¹Cr 자료 분석 결과에 대 한 간단 하 고 비용 효율적인 대안을 제공 합니다. 이 방법은, 재현성, 민감하고 CRA, 같은 이전 표준 방법 보다 적게 시간이 걸리는 임상 모두에 사용할 수 있습니다 이며 응용 연구.

동안 분석 결과 총 PBMCs와 풍부한 NK 세포, 세포 인구를 정화 필요 없이 PBMCs을 사용 하 …

Materials

Phosphate-buffered Saline (1x, w/o Ca2+ and Mg2+)	Corning (Cellgro)	21-040-CM
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare	17-1440-02
Tween-20	Sigma	BP337-100
RPMI 1640 Media	Corning (Cellgro)	10-040-CV
Heat-inactivated Fetal Bovine Serum	Omega Scientific	FB-02
Penicillin Streptomycin	Life Technologies	15140-163	Stock solution at 10,000 U/mL
IL-2	R&D Systems	202-IL-050	Lyophilized from a 0.2 μm filtered solution in Acetonitrile and TFA with BSA as a carrier protein. Reconstitute with 500 ul at 100 μg/mL in sterile 100 mM Acetic Acid containing at least 0.1% bovine serum albumin (2.1x10E6 IU/ml)
K562 Cells	ATCC	CCL-243	Cancer cell line
T-75 cell culture flasks	Corning	431464
CFSE cell proliferation kit	Life Technologies (CellTrace)	C34554	Reconstitute I vial with 18 ul DMSO to prepare a 5mM stock solution. Do not freeze/thaw.
Sytox Red	Life Technologies	S34859	Stock solution is provided at 5 μM in 1 mL DMSO. The DMSO solution may be subjected to multiple freeze-thaw cycles without reagent degradation.
Sodium/lithium heparin blood collection tubes	BD	02-687-95
U-bottom 96-well plate	Corning	CLS3897
Serological pipettes	BD Falcon
Polystyrene round-bottom tubes (5mL)	BD Falcon	14959-5
50 mL polypropylene conical tube	BD Falcon	352070
15 mL polypropylene conical tube	BD Falcon	352097
Reagent reservoir	USA Scientific	2321-2230
Human NK cell enrichment cocktail	StemCell Technologies (RosetteSep)	15065