تقييم الضرر الناجم عن الشيخوخة و في فيفو إعادة برمجة في العضلات الهيكلية
Summary
هنا نقدم بروتوكول مفصلاً للكشف عن كل مسن والخلايا الجذعية pluripotent في العضلات الهيكلية عند الإصابة أثناء حمل في فيفو إعادة برمجة. هذا الأسلوب مناسبة لتقييم دور الشيخوخة الخلوية أثناء تجديد الأنسجة وإعادة برمجة في فيفو.
Abstract
الشيخوخة الخلوية هو استجابة إجهاد التي تتميز بحملة اعتقال نمو خلوي مستقر، هو أمر مهم لكثير من العمليات الفسيولوجية والمرضية، مثل السرطان والشيخوخة. في الآونة الأخيرة، كما قد تورط الشيخوخة في إصلاح الأنسجة وتجديدها. ولذلك، أصبح متزايد الأهمية لتحديد الخلايا مسن في فيفو. التحليل المرتبطة بالشيخوخة β-جالاكتوسيداسي (SA-β-غال) هو التحليل الأكثر استخداماً للكشف عن خلايا مسن في الثقافة و في فيفوعلى حد سواء. ويستند هذا التحليل محتويات الليزوزومية زيادة في الخلايا مسن، الذي يتيح الكشف عن نشاط الليزوزومية β-جالاكتوسيداسي histochemical في سوبوبتيموم درجة الحموضة (6 أو 5.5). بالمقارنة مع فحوصات أخرى، مثل التدفق الخلوي، وهذا ما يسمح تحديد الخلايا مسن في بيئتهم المقيم، الذي يقدم معلومات قيمة مثل الموقع المتعلقة بهندسة الأنسجة، مورفولوجية، إمكانية اقتران مع علامات أخرى عبر إيمونوهيستوتشيميستري (المدينة). الحد الرئيسية للمقايسة سا-β-غال هو المطلب للعينات الطازجة أو المجمدة.
نقدم هنا، بروتوكول مفصل لفهم الشيخوخة الخلوية كيف تشجع التجديد اللدونة والأنسجة الخلوية في فيفو. نحن نستخدم سا-β-غال للكشف عن خلايا مسن في العضلات الهيكلية عند الإصابة، ونظام راسخ لدراسة تجديد الأنسجة. وعلاوة على ذلك، يمكننا استخدام المدينة للكشف عن نانج، علامة على الخلايا الجذعية pluripotent، في طراز ماوس المعدلة وراثيا. هذا البروتوكول يتيح لنا لدراسة وتحديد الشيخوخة الخلوية في السياق اللدونة الخلوية المستحثة و في فيفو إعادة برمجة.
Introduction
الشيخوخة الخلوية شكل من إجهاد استجابة تتسم بحملة اعتقال دورة خلية مستقرة. في العقد الماضي، أثبتت البحوث اعتقادا راسخا أن الشيخوخة يرتبط مع مختلف العمليات البيولوجية والمرضية بما في ذلك التنمية الجنينية والتليف والكائن الشيخوخة1،2. للمرة الأولى الشيخوخة الخلوية في الخلايا الليفية البشرية في نهاية حياتها replicative فجرتها telomere تقصير3. بالإضافة إلى الإجهاد ريبليكاتيفي، هناك الكثير من المحفزات الأخرى التي يمكن أن تسبب الشيخوخة، بما في ذلك الأضرار الحمض النووي والأكسدة وإشارات النمطان والتعديلات الجينية/ابيجينوميك، أي منها في نهاية المطاف تنشيط p53/p21 و/أو pRB المسارات إلى إنشاء وتعزيز اعتقال دائمة النمو1. واحدة من الخصائص الهامة للخلايا مسن هو أنها تبقى أيضي نشطة وقوة التعبير عن المرتبطة بالشيخوخة افرازية النمط الظاهري (ساسب): إفراز من كثير من السيتوكينات الالتهابية، وعوامل النمو والمصفوفة خارج الخلية 4من العوامل. واقترحت العوامل ساسب تلعب دوراً مهما في التوسط وتضخيم أثر الشيخوخة، نظراً لما لها من آثار قوية على جذب الخلايا المناعية وتغيير النسيج وجهازيه الأوساط1. من المثير للاهتمام، اقترحت مؤخرا الشيخوخة مهمة للأنسجة إصلاح وتجديد5،6. وباﻹضافة إلى ذلك، اقترحت البيانات من مختبرات عدة، بما في ذلك بلدنا، أن الشيخوخة الناجمة عن تلف الأنسجة قد تعزز اللدونة الخلوية، عن طريق وفقا، لتعزيز التجديد7–9. ولذلك، كافة البيانات الناشئة تسليط الضوء على أهمية دراسة الشيخوخة في الجسم الحي.
في حقبة ما بعد المستحثة pluripotent الخلايا الجذعية (اللجنة التوجيهية)، هو اللدونة الخلوية قدرة خلية للحصول على هوية جديدة واعتماد مصير بديلة عند التعرض لمؤثرات مختلفة سواء في الثقافة و في فيفو10. ومن المعروف أن إعادة برمجة كاملة يمكن أن يتحقق في فيفو11،12، حيث التعبير عن الكاسيت الذي يحتوي على أربعة عوامل ياماناكا: Oct4، Sox2، Klf4، و ج-حركة (أوسكم) يمكن أن يكون المحرض في فيفو لتشجيع تشكيل تيراتوماس في الأجهزة متعددة. ولذلك، يمكن استخدام نموذج ماوس ريبروجرامابل (i4F) كنظام قوي لتحديد المنظمين الحرجة والمسارات التي تعتبر مهمة للهاتف الخلوي اللدونة11.
نظام مناسب والحساسة في فيفو ضروري لفهم الشيخوخة الخلوية كيف ينظم اللدونة الخلوية في سياق تجديد الأنسجة. نقدم هنا، نظام قوي وبروتوكول مفصلة لتقييم العلاقة بين الشيخوخة واللدونه الخلوية في سياق تجديد الأنسجة. تلف العضلات مزيج من كارديوتوكسين (CTX) التي يسببها في مجموعة العضلات الظنبوبي الأمامي (تا)، نظام راسخ لدراسة تجديد الأنسجة، ونموذج الماوس i4F، يتيح الكشف عن الشيخوخة الخلوية و في فيفو إعادة برمجة أثناء تجديد العضلات.
تقييم العلاقة بين اللدونة الخلوية والشيخوخة، أصيب مع CTX للحث على تلف العضلات الحاد الفئران i4F وتعامل مع الدوكسي (0.2 مغ/مل) أكثر من 7 أيام حمل في فيفو إعادة برمجة. في حين CTX الناجم عن تلف العضلات الحاد وتجديد البروتوكول قد نشرت مؤخرا13، لأسباب أخلاقية، سوف يحذف هذا الإجراء في البروتوكول الحالي. جمع عينات العضلات تا في 10 أيام بعد إصابة13في عند ذروة مسن الخلايا وقد لوحظ سابقا14. هنا، يصف هذا البروتوكول مفصلاً جميع الخطوات المطلوبة لتقييم مستوى الشيخوخة (عن طريق سا-β-غال) وإعادة برمجة (عن طريق تلطيخ المدينة من نانوج).
التحليل المرتبطة بالشيخوخة بيتا-جالاكتوسيداسي (SA-β-غال) هو التحليل الأكثر استخداماً للكشف عن خلايا مسن على حد سواء في الثقافة و في فيفو15. مقارنة بالاختبارات الأخرى، مقايسة سا-β-غال يسمح تحديد الخلايا مسن في بيئتها الأصلية مع هندسة الأنسجة سليمة، الذي يكتسي أهمية خاصة للدراسة في فيفو . وعلاوة على ذلك، فمن الممكن الزوجين المقايسة سا-β-غال مع علامات أخرى استخدام المدينة. ومع ذلك، تتطلب المقايسة سا-β-غال العينات الطازجة أو المجمدة، الذي يبقى قيداً رئيسيا. عندما الأنسجة الطازجة أو المجمدة متوفرة بشكل روتيني، مثل عينات العضلات تا المجمدة، سا-β-غال من الواضح أن التحليل الأكثر مناسبة للكشف عن خلايا مسن. نانج هي علامة تستخدم للكشف عن الخلايا ريبروجراميد لسببين: 1) علامة أساسية بلوريبوتينسي؛ 2) والأهم التعبير عن عدم تحركها الدوكسي (دوكس)، ولذلك يكشف المستحث بلوريبوتينسي بدلاً من التعبير القسري من كاسيت ياماناكا.
من المهم أن نلاحظ، البروتوكولات المصبوغة المعروضة في هذه الدراسة يمكن أن تجري بشكل منفصل تبسيط إجراء التقدير الكمي، ولكن يمكن أيضا أن يتم في إجراء المشترك المصبوغة لتصور كل مسن والخلايا الجذعية pluripotent في نفس القسم.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، نحن نقدم وسيلة للكشف عن كل مسن والخلايا الجذعية pluripotent في العضلات الهيكلية من الفئران ريبروجرامابل. يمكن استخدام هذا الأسلوب تقييم وتقدير كلا الشيخوخة وحمل اللدونة الخلوية في فيفو، ودراسة دور الشيخوخة في إصلاح الأنسجة وتجديدها.
في البروتوكول الحالي، يتم استخدام …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن مدينون إلى سيمبير كليمر لها الدعم التقني الممتاز. تم تمويل العمل في مختبر H.L. من معهد باستور، “المركز الوطني” “البحوث العلمية”، وفي الوكالة الوطنية للبحث (مختبر d’Excellence أحياء، دعفينير Investissement؛ ANR-10-LABX-73)، الوكالة الوطنية للبحث (ANR-16-CE13-0017-01) ومؤسسة قوس (بيا 20161205028). جيم وميلان تمول بدرجة الدكتوراه وزمالات ما بعد الدكتوراه من “الكونسورتيوم أحياء”.
Materials
| K3Fe(CN)6 | Sigma | 13746-66-2 | For SA-β Gal staining solution |
| K4Fe(CN)6 | Sigma | 14459-95-1 | For SA-β Gal staining solution |
| MgCl2 | Sigma | 7786-30-3 | For SA-β Gal staining solution |
| X-Gal | Sigma | B4252 | For SA-β Gal staining solution |
| Doxycycline | Sigma | D3447 | For inducing in vivo reprogramming |
| Cardiotoxin | Lotaxan Valence, France | L8102 | For muscle injury |
| Glutaraldehyde | Sigma | 111-30-8 | For Fixation solution |
| Paraformaldehyde | Electron microscopy science | 50-980-487 | For Fixation solution |
| NaCitrate : Sodium Citrate monobasic bioxtra, anhydre | Sigma | 18996-35-5 | For permeabilization solution |
| Triton | Sigma | 93443 | For permeabilization solution |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3608 | Washing solution |
| Antibody anti- Nanog | Cell signalling | 8822S | Rabbit monoclonal antibody |
| EnVision+ Kits (HRP. Rabbit. DAB+) | Dako | K4010 | For Nanog revelation |
| Eosin 1% | Leica | 380159EOF | Counterstainning |
| Fast red | Vector Laboratories | H-3403 | Counterstainning |
| Thermo Scientific Shandon Immu-Mount | Fisher scientific | 9990402 | Mounting solution |
| Quick-hardening mounting medium for microscopy : Eukitt® | Sigma | 25608-33-7 | Mounting solution |
| Microscope Phase Contrast Brightfield CKX41: 10X-20X-40X objectives | Olympus | CKX41 | Microscope for Nanog quantification |
| Mouse: i4F-A | Abad et al., 2013 | N/A | Reprogrammable mouse model |
| Skeletal muscle, Tibialis Anterior | |||
| Slide Scanner | Zeiss | Axio Scan Z1 | slides scanning |
References
- Munoz-Espin, D., Serrano, M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (7), 482-496 (2014).
- Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).
- Hayflick, L. The Limited in Vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains. Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).
- Coppe, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annu Rev Pathol. 5, 99-118 (2010).
- Yun, M. H., Davaapil, H., Brockes, J. P. Recurrent turnover of senescent cells during regeneration of a complex structure. Elife. 4, (2015).
- Demaria, M., et al. An essential role for senescent cells in optimal wound healing through secretion of PDGF-AA. Dev Cell. 31 (6), 722-733 (2014).
- Mosteiro, L., et al. Tissue damage and senescence provide critical signals for cellular reprogramming in vivo. Science. 354 (6315), (2016).
- Chiche, A., et al. Injury-Induced Senescence Enables In Vivo Reprogramming in Skeletal Muscle. Cell Stem Cell. , (2016).
- Ritschka, B., et al. The senescence-associated secretory phenotype induces cellular plasticity and tissue regeneration. Genes Dev. 31 (2), 172-183 (2017).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. A decade of transcription factor-mediated reprogramming to pluripotency. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 183-193 (2016).
- Abad, M., et al. Reprogramming in vivo produces teratomas and iPS cells with totipotency features. Nature. 502 (7471), 340-345 (2013).
- Ohnishi, K., et al. Premature Termination of Reprogramming In Vivo Leads to Cancer Development through Altered Epigenetic Regulation. Cell. 156 (4), 663-677 (2014).
- Guardiola, O., et al. Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection. J Vis Exp. (119), (2017).
- Le Roux, I., Konge, J., Le Cam, L., Flamant, P., Tajbakhsh, S. Numb is required to prevent p53-dependent senescence following skeletal muscle injury. Nat Commun. 6, 8528 (2015).
- Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4 (12), 1798-1806 (2009).
- Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (20), 9363-9367 (1995).
- Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).
- Krishna, D. R., Sperker, B., Fritz, P., Klotz, U. Does pH 6 beta-galactosidase activity indicate cell senescence?. Mech Ageing Dev. 109 (2), 113-123 (1999).
- Cristofalo, V. J. SA beta Gal staining: biomarker or delusion. Exp Gerontol. 40 (10), 836-838 (2005).
