부상-유도 노화 및 골격 근육에서 프로그래밍을 Vivo에서 의 평가
Summary
여기 선물이 모두 노화를 감지 하는 상세한 프로토콜 및 만능 줄기 세포 유도 vivo에서 프로그래밍 하는 동안 부상에 골격 근육. 이 메서드는 조직 재생성 하는 동안 세포 노화의 역할을 평가 하 고 vivo에서프로그래밍에 적합 합니다.
Abstract
세포 노화는 안정적인 세포 성장 체포, 암과 노화 등 많은 생리와 병리학 과정에 대 한 중요 한 특징은 스트레스 반응이 다. 최근, 노화 또한 조직 수리 및 재생에 연루 되었습니다. 따라서, 그것은 점점 노화 세포에 vivo에서식별에 중요 한 되고있다. 노화 관련 된 β-galactosidase (SA-β-Gal) 분석 결과 노화 세포 모두 문화에 vivo에서감지 하는 가장 널리 사용 되 분석 결과가 이다. 이 분석 결과 기반 노화 세포에서 증가 lysosomal 내용을 lysosomal β-galactosidase 활동의 조직화 학적인 탐지 중형 pH 6 (5.5)에서 수 있습니다. 다른 분석 실험, cytometry, 같은 비교 관련 조직 구조, 형태, 위치와 같은 중요 한 정보를 제공 합니다 그들의 거주 환경에 노화 세포의 식별 수 있습니다 그리고 커플링 immunohistochemistry (IHC)를 통해 다른 마커와 가능성. SA-β-Gal 분석 결과의 주요 한계는 신선 또는 냉동 샘플의 요구 사항입니다.
여기, 우리가 어떻게 세포 노화를 이해 하는 상세한 프로토콜 현재 셀룰러 소성 및 조직 재생 비보를 촉진. SA-β-Gal 사용 하 여 조직 재생 연구에 기초가 튼튼한 시스템은 부상 시 골격 근육에 노화 세포를 감지. 또한, IHC 사용 하 여 유전자 변형 마우스 모델에서 Nanog, 만능 줄기 세포의 마커를 감지. 이 프로토콜 검사 하 고 세포 노화 유발된 세포가 소성 그리고 vivo에서 프로그래밍의 맥락에서 정할 수 있습니다.
Introduction
세포 노화 스트레스 응답 안정적인 세포 주기 검거가 특징의 한 형태입니다. 지난 10 년간에서 연구는 단단히 설립 노화 배아 개발, 섬유 증, 및1,2노화 하는 유기 체를 포함 하 여 다양 한 생물 학적 및 병 적인 프로세스와 연결 된. 세포 노화는 그들의 일차 수명 telomere 단축3에 의해 실행의 끝에 인간의 섬유 아 세포에서 처음 확인 되었다. 일차 스트레스, 노화, DNA 손상, 산화 스트레스, 종양 신호는의 결국에 p53/p21 또는 pRB 통로 활성화 하는 게놈/epigenomic 변경 등을 일으킬 수 있는 다른 많은 자극 있습니다. 설정 하 고 영구 성장 체포1강화. 노화 세포의 중요 한 특성 중 하나는 그들은 metabolically 활성 상태로 유지 하 고 견고 하 게 표현 하는 노화에 관련 된 분 비 형 (SASP): 많은 염증 성 cytokines, 성장 인자, 세포 외 매트릭스의 분 비 요인4. SASP 요소를 중재 하 고 면역 세포를 유치 하 고 지역 및 조직의 조직 milieus1변경에 그들의 강력한 효과 인해 노화 효과 증폭에 중요 한 역할을 제안 되었습니다. 흥미롭게도, 노화 최근 제안 되었습니다 조직 수리 및 재생5,6에 대 한 중요 한 것. 또한, 우리를 포함 한 여러 연구소에서 데이터 조직 손상-유도 노화 세포가 소성, SASPs, 재생7–9홍보를 통해 강화 수 있습니다 제안 했다. 따라서, 모든 신흥 데이터 노화 비보의 중요성을 강조 표시 합니다.
게시물 유도 만능 줄기 세포 (iPSC) 시대에 세포가 소성은 새로운 정체성을 획득 하 고 두 문화 그리고 vivo에서10에 다른 자극에 노출 되 면 대체 운명 채택 셀의 능력 이다. 그것은 알려져 그 전체 프로그래밍 하 달성 vivo에서11,12, 수 어디의 표현은 4 야 마나카 요소를 포함 하는 카세트: Oct4, Sox2, Klf4및 c-Myc (OSKM) 유도 수 비보에 여러 장기에 teratomas 형성을 촉진. 따라서, 중요 한 레 귤 레이 터와 셀룰러 소성11에 대 한 중요 한 경로 식별 하는 강력한 시스템으로 재프로그래밍 마우스 모델 (i4F)를 사용할 수 있습니다.
적합 하 고 민감한 vivo에서 시스템은 어떻게 세포 노화를 이해에 필수적인 조직 재생의 맥락에서 세포가 소성을 조절. 여기, 우리는 강력한 시스템 및 노화와 조직 재생의 맥락에서 셀룰러 소성 사이의 링크를 평가 하는 상세한 프로토콜 제시. 유도 하는 cardiotoxin (CTX)의 조합 근육 손상 Tibialis 앞쪽 (TA) 근육 그룹, 조직 재생, i4F 마우스 모델을 공부 하 고 잘 설립 시스템에에서 수 세포 노화와 생체 내에서 의 검색 근육 재생성 하는 동안 프로그래밍.
세포가 소성 및 노화 사이의 링크를 평가 하려면 i4F 마우스 급성 근육 손상을 유발 하는 CTX 부상 되며 doxycycline (0.2 mg/mL) 7 일 이상 vivo에서 재프로그래밍을 유도 하는 것으로 치료. CTX 급성 근육 손상을 유발 하는 동안 재생 프로토콜 윤리적인 이유를 위해 최근에 출판 된13되었습니다 현재 프로토콜에이 절차를 생략 됩니다. 노화 세포의 피크 이전 관찰 되었습니다14때 따 근육 샘플 10 일 게시물 부상13, 수집 됩니다. 여기,이 상세한 프로토콜 (SA-β-Gal)를 통해 노화의 수준 및 재활 (IHC Nanog의 얼룩)를 통해 평가 하는 데 필요한 모든 단계를 설명 합니다.
노화 관련 베타-galactosidase (SA-β-Gal) 분석 결과 문화 그리고 vivo에서15에 노화 세포 모두를 감지 하는 가장 일반적으로 사용 되 분석 결과가 이다. 다른 분석 실험에 비해, SA-β-Gal 분석 결과 그대로 조직 아키텍처, vivo에서 학문에 대 한 특히 중요 한 그들의 네이티브 환경에서 노화 세포의 식별 수 있습니다. 또한, IHC를 사용 하 여 다른 표식으로 SA-β-Gal 분석 결과 하 가능 하다. 그러나, SA-β-Gal 분석 결과 주요 제한 남아 있는 신선 또는 냉동 샘플 필요지 않습니다. 신선 또는 냉동 조직 냉동된 따 근육 샘플 같은 정기적으로 사용할 수 있을 때, SA-β-Gal은 명백히 노화 세포를 감지 하는 가장 적합 한 분석 결과 이다. Nanog는 두 가지 이유로 reprogramed 셀을 검출 하는 데 사용 하는 마커: 1) 그것은 pluripotency;에 대 한 필수적인 마커 2) 더 중요 한 것은, 그 표현 doxycycline (dox)에 의해 구동 하지 않으면, 따라서 유도 pluripotency 보다는 야 마나카 카세트의 강제 식 감지.
그것은 중요 한 것,이 연구에서 제시 하는 얼룩 프로토콜 정량화 절차를 단순화 하기 위해 별도로 실시 될 수 있지만 모두 노화를 시각화 하는 공동 얼룩 절차 및 pluripotent 줄기 세포 동일한 섹션에서 수행할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기, 선물이 모두 노화를 검출 하는 방법 및 pluripotent 줄기 세포 재프로그래밍 쥐의 골격 근육. 이 방법은 평가 척도 모두 노화 세포가 소성에 vivo에서, 유도 그리고 조직 수리 및 재생에 노화의 역할을 검토 사용 될 수 있습니다.
현재 프로토콜 골격 근육에 노화 세포 vivo에서 감지 하 노화 관련 된 β-galactosidase (SA-β-Gal) 분석 결과 사용 합니다. 이 분석 결과 중형 p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 Clemire Cimper에 그녀의 우수한 기술 지원에 대 한 빚을입니다. H.L.의 연구실에서 작업 파스퇴르, 검색 과학 센터 국가 부 라와 직원 회 드 라 검색 (응용 d’Excellence, 소생 Investissement d’Avenir;에 의해 투자 되었다 ANR-10-LABX-73), 직원 회 드 라 검색 (ANR-16-CE13-0017-01) 및 Fondation 호 (PJA 20161205028). 참조 및 교류는 박사에 의해 부활 컨소시엄에서 박사 장학 자금을.
Materials
| K3Fe(CN)6 | Sigma | 13746-66-2 | For SA-β Gal staining solution |
| K4Fe(CN)6 | Sigma | 14459-95-1 | For SA-β Gal staining solution |
| MgCl2 | Sigma | 7786-30-3 | For SA-β Gal staining solution |
| X-Gal | Sigma | B4252 | For SA-β Gal staining solution |
| Doxycycline | Sigma | D3447 | For inducing in vivo reprogramming |
| Cardiotoxin | Lotaxan Valence, France | L8102 | For muscle injury |
| Glutaraldehyde | Sigma | 111-30-8 | For Fixation solution |
| Paraformaldehyde | Electron microscopy science | 50-980-487 | For Fixation solution |
| NaCitrate : Sodium Citrate monobasic bioxtra, anhydre | Sigma | 18996-35-5 | For permeabilization solution |
| Triton | Sigma | 93443 | For permeabilization solution |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3608 | Washing solution |
| Antibody anti- Nanog | Cell signalling | 8822S | Rabbit monoclonal antibody |
| EnVision+ Kits (HRP. Rabbit. DAB+) | Dako | K4010 | For Nanog revelation |
| Eosin 1% | Leica | 380159EOF | Counterstainning |
| Fast red | Vector Laboratories | H-3403 | Counterstainning |
| Thermo Scientific Shandon Immu-Mount | Fisher scientific | 9990402 | Mounting solution |
| Quick-hardening mounting medium for microscopy : Eukitt® | Sigma | 25608-33-7 | Mounting solution |
| Microscope Phase Contrast Brightfield CKX41: 10X-20X-40X objectives | Olympus | CKX41 | Microscope for Nanog quantification |
| Mouse: i4F-A | Abad et al., 2013 | N/A | Reprogrammable mouse model |
| Skeletal muscle, Tibialis Anterior | |||
| Slide Scanner | Zeiss | Axio Scan Z1 | slides scanning |
References
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